まず、肺組織とアガロースを包埋し、ビブラトームを使用して切片化します。スライスした組織に、300マイクロリットルのブロッキング剤を加えます。プレートを摂氏4度でシェーカー上で45分間穏やかに撹拌しながらインキュベートします。
次に、希釈したPBS一次抗体300マイクロリットルを各ウェルにピペットで移します。プレートを摂氏4度で穏やかに振とうしながら一晩インキュベートします。次に、スライスに触れずに一次抗体を静かにピペットで取り出します。
スライスを400マイクロリットルのPBSで3回洗浄します。次に、300マイクロリットルの希薄二次抗体を各ウェルにピペットで移します。90分間のコールドインキュベーション後に抗体溶液を除去します。
次に、DAPIとトマトレクチン488をウェルに加えます。混合物を30分間インキュベートします。DAPIとトマトレクチンを除去した後、スライスをPBSで10分間の3サイクル洗浄します。
ブラシを使用して、スライスをスライドに移します。スライドに封入剤を3滴垂らし、その上にカバースリップを載せてから撮像します。マウス、ブタ、およびヒトサンプルの肺切片を免疫蛍光染色し、SMA、エラスチン、およびLEAについて染色しました。
SMAとエラスチンは、肺胞管、血管、細気管支、肺胞などの構造に分布していることが観察されました。成人と乳児におけるII型肺細胞分布の比較を行った。II型肺胞細胞抗体HT2-280は、肺細胞表面に強い親和性を示しました。
乳児サンプルは、II型肺細胞数が有意に多くなりました。しかし、乳児のサンプルは、成人よりも有意に高い足場被覆率も示しました。足場被覆に基づくII型肺細胞の数も、乳児で有意に多かった。
