In Vitro Blood-Brain Barrier Model Assembly for Measurement of TEER

まず、24ウェルプレートの上部チャンバーをPBSですすぎます。ボルテックスミキサーを用いてBEND3細胞をDMEM培地と混合し、懸濁液を作製します。次に、200マイクロリットルのBEND3細胞懸濁液を、24ウェルプレートの上部チャンバー内のPETメンブレン上に播種します。

プレートの下部チャンバーに1、200マイクロリットルの完全な培地を追加して、上部チャンバーと下部チャンバーの浸透圧を安定させます。流体交換中に、負圧ピペットで古い培地を片側からゆっくりと取り除き、壁に沿って新しい培地を追加して、培地を交換します。TEERを測定する前に、抵抗器、5%次亜塩素酸ナトリウム溶液、75%エタノール、および二重蒸留水を超クリーンテーブルに置きます。

UV照射を30分間オンにして、残留細菌や病原体を除去します。電極を5%次亜塩素酸ナトリウム溶液に入れ、3〜5秒間ゆっくりと振とうします。次に、75%エタノールに15分間浸します。

最後に、使用するまでPBSまたは二重蒸留水に移します。次に、セル抵抗計の背面にあるスイッチをオンにします。Select Plateをクリックし、Select 24 well plateをクリックします。

操作に応じて、適切な検出シーケンスを選択します。キロオームの抵抗器を右側のプラグに挿入して、機器を校正します。校正結果が1000プラスマイナス5オームの場合、機器は正確であると考えてください。

そうでない場合は、メインインターフェイスの[モード単位]をクリックして[オーム]を選択し、[キャリブレーション]をクリックします。次に、キロオーム抵抗器を取り外し、接続線を使用して測定電極と交換します。培地のみを含む24ウェルプレートに電極を垂直に置き、装置の[ブランクハンドリング]をクリックします。

着座セルなしのプレート抵抗のバックグラウンド値は、約134.4オームである必要があります。次に、2つの電極を着座プレートの上部チャンバーと下部チャンバーに挿入し、セル層がそれらの間に来るようにします。ペダルを軽く踏んで抵抗値を記録します。

電極が上部チャンバーと下部チャンバーの下部のセルに触れていないことを確認してください。式に示すように、電気抵抗値に上部チャンバーの底部面積を乗じてTEER値を求めます。TEERと時間の関係の折れ線グラフを日数で描画します。

抵抗値が時間とともに増加しない場合、セルはバリアを形成しています。BEND3細胞の時間に対してプロットされた抵抗値は、細胞のTEER値が5日目に安定し始めたことを示しました。