このプロトコルは、内皮トランスサイトーシスに特に焦点を当てた血液網膜や血液脳関門などの選択的血管バリアの機能と透過性を研究するための有用な細胞ベースのモデルを提供します。このアッセイは、生きた動物を必要としないセットアップと使用が簡単です。内皮細胞透過性およびトランスサイトーシスのさまざまな分子調節因子が血液網膜バリアの完全性に影響を与えることを研究するために利用できます。
このアッセイは、血管生物学と眼と脳の研究への洞察を提供し、BRB BBB制御の根底にある分子メカニズムをよりよく理解し、障壁を越えた潜在的な薬物送達を探索することができます。まず、ヒト網膜微小血管内皮細胞またはHRMECを播種するための細胞培養フィルターインサートを準備し、各インサートを200マイクロリットルの0.1%ゼラチン溶液で層流フードの下で30分間コーティングします。溶液がフィルターインサートの底面全体を覆っていることを確認してください。
培養HRMECを摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートしたペトリ皿を取り、成長培地を吸引します。層流フードの下で10ミリリットルの1X PBSで細胞を2回静かにすすぎ、潜在的な浮遊細胞または死細胞を取り除きます。細胞を0.5〜1ミリリットルの0.25%トリプシン-EDTA溶液で解離し、ペトリ皿を摂氏37度および5%二酸化炭素のインキュベーターに5分間入れる。
4.5〜9ミリリットルの増殖培地を加えてトリプシン活性を消光し、10ミリリットルのピペットを使用して細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。細胞を200倍gで室温で5分間回転させる。上清を注意深く取り除き、ペレットを3ミリリットルの増殖培地に再懸濁します。
手動血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞数を数え、フィルターインサートあたり40, 000細胞の密度で播種します。各インサートの細胞懸濁液の容量は250マイクロリットルです。透過性インサートを含むウェルからコーティング溶液を吸引し、インサートあたり250マイクロリットルの細胞懸濁液を移してから、インサートの1つに培地のみを添加し、経内皮電気抵抗(TEER)測定のブランクコントロールとして使用されます。
同時に、基底外側チャンバーにウェルあたり750マイクロリットルの培地も加えます。培養細胞が完全にコンフルエントになり、約20オーム/平方センチメートルの望ましいTEER値が達成されるまで、インキュベーター内の透過性インサートを備えた24ウェルプレートを摂氏37度、5%二酸化炭素で7〜12日間保持します。TEER測定の前に、セルを含む24ウェルプレートを室温の層流フードに15〜20分間置き、温度平衡化を行います。
HRMECのTEERを測定するには、上皮ボルト/オームメーターの電気抵抗システムを使用して、電極をメーターに接続し、最初に電極を70%エタノールに15〜20分間浸してから、細胞培養EGM増殖培地に短時間浸して電極を平衡化します。短い方の先端がインサートに入り、長い方の先端がウェルの底に接触するように、電極を注意深く浸してTEER測定を実行します。最初にブランクコントロールの両端の抵抗を測定し、次に各インサートについて、TERを3連で測定します。
約20オーム平方センチメートルのTEER値でコンフルエントに達したら、リガンドで処理する前に、両方のチャンバーでEBM中の0.5%FBSを使用して、摂氏37度と5%二酸化炭素で24時間細胞を血清から奪います。血清還元EBMをアッセイ全体を通して使用した。アピカルチャンバー内の血清還元培地を使用して、蛍光シアニン-3-タグとトランスフェリンリガンドを摂氏37度で60分間インキュベートします。
単層を血清還元培地で頂端および基底外側に4回洗浄した後、細胞を含むフィルターインサートに新しい培地を追加し、予温した血清還元培地を含む24ウェルプレートの新鮮なウェルにインサートを移します。細胞をインキュベーター内でさらに90分間インキュベートし、次に基底外側チャンバーから培地を収集する。蛍光検出器を用いて基底外側チャンバーからの溶液の蛍光強度を記録する。
約20オーム平方センチメートルのTEER値でコンフルエントに達したら、リガンドで処理する前に、両方のチャンバーでEBM中の0.5%FBSを使用して、摂氏37度と5%二酸化炭素で24時間細胞を血清から奪います。血清還元EBMをアッセイ全体を通して使用した。次に、頂端室内の細胞を所望の処理およびビヒクルコントロールで処理する。
西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を細胞に1ミリリットルあたり5ミリグラム加え、摂氏37度で15分間インキュベートします。新鮮な血清還元培地を頂端チャンバーに加え、インサートを予熱した培地を含む新鮮なウェルに移します。インキュベーター内でさらに90分間単層をインキュベートする。
基底外側チャンバーから培地を回収した後、採取した培地に100マイクロリットルのHRP蛍光発生ペルオキシダーゼ基質を加え、室温で10分間インキュベートします。100マイクロリットルの停止溶液で反応を停止し、蛍光プレートリーダーを使用して培地中のHRP基質反応生成物のレベルを検出します。in vitroトランスサイトーシスアッセイを実証する前に、網膜における内皮細胞トランスサイトーシスの可視化が背景情報として示されている。
ここで、光学顕微鏡画像は、DABで染色された3ヶ月齢の野生型マウス網膜切片からのHRPで満たされた血管内腔を示す。HRPは軌道後注入された。HRPで満たされた網膜血管は、光学顕微鏡下で暗褐色の沈殿物として見ることができます。
透過型電子顕微鏡の超薄切片は、血液網膜内関門を横切るECトランスサイトーシスを示すRMECを備えたHRP充填トランスサイトーシス血管を示しています。ここで、大きな小胞は潜在的にマクロピノソームとルミノール側の赤血球を反映しています。TeM画像は、RMEC内のHRPで満たされた小さなトランスサイトーシス小胞、おそらくカベオラ小胞を示しています。
CAV-1抗体とイソレクチンB4の免疫組織化学染色により、3ヶ月齢の野生型マウス網膜において、網膜血管内のカベオラ小胞のマーカーであるCAV-1の局在が示されました。網膜内皮細胞内の免疫金標識CAV-1のTeM画像を、CAV-1陽性のカベオラ小胞の拡大画像とともにここに示す。トランスフェリンを用いたHRMECにおけるクラスリン媒介ECトランスサイトーシスアッセイの場合、ここでの蛍光顕微鏡画像は、青色のDAPIで染色されたHRMEC内の赤色のエンドサイトーシスCy3トランスフェリンを示しています。
HRPを用いたカベオラ媒介ECトランスサイトーシスの場合、ここでのWntシグナル伝達は、アッセイを実証するための例として使用される。Wntシグナル伝達は、カベオラ媒介ECトランスサイトーシスを調節するために最近発見されました。細胞を、Wnt経路活性化因子Wnt3a馴化培地および組換えNorrin、Wntシグナル伝達阻害剤XAV939およびそれらの反応性対照の有無にかかわらず処理した。
WntアクチベーターはHRPベースのトランスサイトーシスのレベルを低下させ、XAV939によって逆転した。正しいTEER測定は、単層の完全性を判断するために重要です。不適切な取り扱い、温度変動、培地、培養期間など、さまざまな要因の影響を大きく受けます。
このアッセイは、in vivo条件を模倣した共培養または3D有機型培養システムとして変更することができます。
