膵管腺癌細胞に対するレンチウイルスの調製とリプログラミング形質導入

1 2 まず、トランスフェクションの24時間前にHEK 293T細胞3をGMENを含む15センチメートルの皿で観察します。5 細胞を摂氏37度でインキュベートし、5%の二酸化炭素7を40〜50%のコンフルエント度に達するまで培養します。8 15ミリリットルのプラスチックチューブ3本9に適切なレンチウイルス名を付けます。

10 1.710ミリリットルの還元血清培地11および90マイクロリットルのトランスフェクション試薬を各チューブに加える。12 チューブを室温でインキュベートする前に、13をボルテックスして内容物を混合します。14 5分後、パッケージングベクター混合物15をトランスフェクション培地およびボルテックスに加える。

16次に、7.5マイクログラムのリプログラミングベクター17およびpWPT-GFPコントロール18をそれぞれのトランスフェクション混合物に加える。19 チューブを2秒間ボルテックス20してから、室温で15分間インキュベートします。21 293T細胞に各レンチウイルスをトランスフェクションするために、22滴ごとに、トランスフェクションDNA混合物を皿に加える。

23 トランスフェクションした細胞を摂氏37度でインキュベートし、二酸化炭素を5%にします。25 14〜16時間後、26培地を30ミリリットル、27、新鮮な293T培地28と交換し、60〜72時間インキュベーションを続けます。29 細胞を毎日観察し、トランスフェクション効率を確認します。

31次に、ウイルストランスフェクション培養物32を15ミリリットルチューブ33に移し、摂氏4度で1,932Gで10分間34回転ダウンする。35 0.45ミクロンのシリンジフィルター37を使用してレンチウイルス上清36を新しい50ミリリットルチューブにろ過する。38 レンチウイルス形質導入の1日前に、39 ウェルあたり100,000個のPDAC細胞を含む6ウェルプレート40の2ウェルを調製する。

41 2つの15ミリリットルチューブ42を準備し、2ミリリットルの予め温めたPDAC培地を使用します。43最初のチューブに、44は12ミリリットルの再プログラミングレンチウイルスを追加します。45次に、12マイクロリットルのポリブレン46を加え、ピペッティングで混合します。

47 第2のチューブに、48 2マイクロリットルのポリブレンを加える。49 ここで、6ウェルプレート51の各ウェル50から培地を慎重に取り出し、室温でPBSで1回洗浄する。52 チューブ1から第1のウェルにリプログラミング感染培地53を加える。

54 チューブ2の混合物を2番目のウェルに加えます。55 細胞を摂氏37度で一晩インキュベートします 56 5%の二酸化炭素と5%の酸素で。57 翌日、両方のウェルからの培地58を新鮮なPDAC培地59と交換し、実証されたようにインキュベーション60を最大48時間続ける。