A.S.とJ.K.は、Cancer Research UKとOHSUの資金提供に感謝します(CRUK-OHSUプロジェクト賞C65925 / A26986)。A.S.は、MRCキャリア開発賞(MR/N024028/1)によってサポートされています。A.A.は、キング・アブドゥルアズィーズ・シティ・フォー・サイエンス・アンド・テクノロジーの博士号奨学金(奨学金文献1078107040)によって資金提供されています。JKは、MRF新治験責任医師助成金(GCNCR1042A)およびKnight CEDAR助成金(68182-933-000、68182-939-000)によって資金提供されています。梶圭介教授には、リプログラミングベクターpSIN4-EF1a-O2SとpSIN4-CMV-K2Mを提供していただき、誠にありがとうございます。オープンアクセスの目的で、著者はクリエイティブ・コモンズ表示(CC BY)ライセンスを、この投稿から生じる著者が承認した原稿のバージョンに適用しています。

PDACおよび膵臓細胞の人工多能性幹細胞へのリプログラミング

著者らは、利益相反がないことを宣言します。

がんの進行を研究するためのiPS細胞リプログラミングの使用を容易にするために、膵臓がん細胞をリプログラミングするための堅牢なプロトコルが確立されています。がん細胞からiPS細胞を作製することに成功した研究はごくわずかであり、がん細胞を多能性にリプログラミングすることは非常に困難であることが証明されています32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46<sup clas...

膵管腺がん(PDAC)は最も致命的な悪性腫瘍の1つであり、この疾患の無症候性の性質のために早期診断は依然として困難です。PDAC患者の大多数は、治療の選択肢が非常に限られている進行性転移段階で診断されます1,2。これは主に、血流に放出されたタンパク質として便利に検出できるバイオマーカーなど、初期段階の信頼できるバイオマーカーが不足しているためです。
PDACは進行の非常に早い時期に播種する可能性があり、PDACが膵臓に局在している場合、予後が良好になるとがんの早期発見につながることがわかっています3。しかし、予後が良好と診断され、外科的切除が可能となるPDAC患者の10分の1未満である。それにもかかわらず、切除可能な腫瘍を有する少数の患者は、12ヵ月以内に腫瘍が再発する傾向もあります4。
過去50年間で、外科的技術、患者ケア、および治療法において目覚ましい改善が行われました5,6。しかし、外科的に切除されたPDAC患者の5年生存率は17%にかろうじて上昇している。それにもかかわらず、これはほとんど変わらない(0.9%)未切除患者よりもまだましです4,7。化学療法は、PDACの代替療法としては他に唯一の治療法です。しかし、PDAC患者の大多数はゲムシタビン7,8などの化学療法薬に対して強い耐性を示すため、この選択肢は非常に限られています。エルロチニブなどの他の薬剤は、特定の変異を有する少数のPDAC患者にのみ利用可能であり、そのほとんどがエルロチニブ耐性を示す9。ほとんどのPDAC患者における化学療法に関連する有害な副作用は、この治療のさらに別の欠点です10。最近、有望な戦略により、免疫チェックポイント阻害剤(ICI)と低分子キナーゼ阻害剤(SMKI)がPDACの治療に有効であることが示されていますが、これらの標的療法に対する持続的な反応は少数の患者に限られています11,12。全体として、PDAC特異的な早期バイオマーカーの発見は、早期診断と治療のための新しい道を開く可能性があります。
PDACは、非侵襲性膵管上皮増殖に起因する膵臓上皮内腫瘍(PanIN)前駆体病変から発症する13,14。PanINの形成はKRASなどのがん遺伝子変異によって開始されますが、PDACへの進行には追加の遺伝的およびエピジェネティックな変化が必要です。PanINがさまざまな段階を経て侵襲性PDACに進行するには、約10年かかると予測されています13、15、16、17。この時間枠は、早期PDAC診断の恩恵を受ける絶好の機会を提供します。したがって、PDACの進行を研究するために、腫瘍異種移植動物モデルとオルガノイド培養を確立するための広範な研究が行われてきました18,19,20,21。これらのモデルは、PDACの侵襲的段階を研究するのに非常に有用であるが、初期のPanIN段階からの移行ではない。したがって、早期発見バイオマーカーの発見を可能にするために、PanINステージの初期の進行を再現できる実験モデルを開発することが重要です。
4つの転写因子OCT4、SOX2、KLF4、およびc-MYC(OSKM)を使用して、体細胞を人工多能性幹細胞(iPSC)にリプログラミングすると、細胞の可塑性の程度が示されました22。がん細胞の可塑性は十分に立証されており、ヒトがん細胞をiPS細胞にリプログラミングすることで、細胞を元の細胞状態にリセットし、がんの進行中に蓄積したエピジェネティックな損傷の多くを取り除くことに成功しています23,24,25,26,27,28,29.したがって、このリプログラミング戦略を使用してがん細胞の同一性を操作する可能性は、がんの治療に大きな期待が寄せられています30,31。実際、PDAC由来のiPS細胞の分化は、初期のPanINステージ32を通じてPDACの進行を再現できることを以前に示しました。PDACの初期から中期に特異的な遺伝子と経路を特定することにより、PDACの早期診断に臨床的に使用できる候補バイオマーカーが特定されました32,33。しかし、単一のiPS細胞株を用いて発見されたバイオマーカーは、PDAC患者の大多数において限られた範囲しかカバーしていないことが示された32。他のPDAC患者からiPS細胞株を作製するという課題により、より信頼性の高いバイオマーカーを発見する能力が妨げられてきました。これは、ヒト初代PDAC細胞のごく一部のみが4つの因子をすべて含み、リプログラミングに正常に応答したため、OSKM送達の不均一性を含む多くの技術的要因によるものです。ここでは、OSKMのより効率的で一貫性のあるデュアルレンチウイルス送達を使用して初代PDAC細胞をリプログラミングするための詳細なプロトコルを示します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31350010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>330613</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Pituitary Extract (BPE)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13028014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BxPc3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1687</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>C8052-1MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen, Type I solution from rat tail</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>C3867</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Completed Defined K-SFM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;10744-019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS3516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning syringe filters</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS431231</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS430599</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day Impex&#160;Virkon Disinfectant Virucidal Tablets</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12328667</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>D8537</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10270-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene HD Transfection Reagent&#160;</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>&#160;E2312</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, Type B, 2% in H2O</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>G1393-100ML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Media (GMEM)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>G5154</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF Recombinant Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0311</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>100-18B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7)</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECA001-FP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMEF feeder cells&#160;</td>
			<td>iXcells Biotechnologies</td>
			<td>10MU-001-1V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte Serum Free Media (KSFM)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17005-042</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10829018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut serum Replacement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10828028</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030-024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HP 0.45 &#956;M syringe Filter Unit (Sterile)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>SLHP033RS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDG&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>187440</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)&#160;</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>H9268-5G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-CMV-K2M&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>21164</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF2-O2S&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>21162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>12260</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pWPT-GFP&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>12255</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium (ATCC modification)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1049101</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodym Pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11360-039</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringes for Single Use (60 mL)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15899152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Dihydrochloride)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reprogramming pancreatic ductal adenocarcinoma to pluripotency

転写因子を用いた人工多能性幹細胞(iPS細胞)の作製は、ほぼすべての分化細胞種から達成されており、研究や臨床応用に高い価値があることが証明されています。興味深いことに、膵管腺がん(PDAC)などのがん細胞のiPS細胞のリプログラミングは、浸潤性PDAC表現型を逆転させ、がんエピゲノムを上書きすることが示されています。PDAC由来iPS細胞の分化は、初期の膵臓上皮内腫瘍(PanIN)前駆体からのPDACの進行を再現し、PDACの進行の初期に起こる分子的および細胞的変化を明らかにすることができます。したがって、PDAC由来のiPS細胞は、早期発見診断マーカーの発見のためのPDACの初期段階をモデル化するために使用できます。これは、初期のPanIN期の信頼できるバイオマーカーがないため、通常、転移後期で診断されるPDAC患者にとって特に重要です。しかし、PDACを含むがん細胞株を多能性にリプログラミングすることは、依然として困難で労働集約的であり、異なる細胞株間で大きなばらつきがあります。ここでは、ビシストロニックレンチウイルスベクターを用いて、様々なヒトPDAC細胞株からiPS細胞を作製するための、より一貫性のあるプロトコルについて述べる。得られたiPS細胞株は安定しており、リプログラミング因子や誘導性薬物の外因性発現に依存しないことを示しています。全体として、このプロトコルは、PDAC症例のより特異的で代表的な早期バイオマーカーの発見に不可欠な、幅広いPDAC由来iPS細胞の作製を容易にします。

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most fatal malignancies, and early diagnosis remains challenging due to the asymptomatic nature of the disease. The majority of PDAC patients are diagnosed at the advanced metastatic stage when very limited treatment options are available1,2. This is mainly due to the lack of reliable biomarkers for the earlier stages, such as those that could be conveniently detected as proteins released into the bloodstream.
PDAC can disseminate very early during its progression, and a better prognosis has been linked to early cancer detection when PDAC is localized in the pancreas3. However, less than a tenth of PDAC patients are diagnosed with a favorable prognosis, allowing for surgical resection. Nonetheless, those few with resectable tumors are also prone to tumor recurrence within 12 months4.
In the past five decades, remarkable improvements have been made in surgical techniques, patient care, and treatment modalities5,6. However, the 5-year survival rate in surgically resected PDAC patients has barely risen to 17%. Nonetheless, this is still better than that in non-resected patients, which has remained almost unchanged (0.9%)4,7. Chemotherapy is the only other alternative PDAC treatment. Yet, this option is very limited as the great majority of PDAC patients exhibit strong resistance to chemotherapy medications such as Gemcitabine7,8. Other drugs, such as Erlotinib, are only available to a small group of PDAC patients with specific mutations, most of whom show Erlotinib resistance9. The adverse side effects associated with chemotherapy in most PDAC patients are yet another disadvantage of this treatment10. Recently, promising strategies have shown that immune checkpoint inhibitors (ICIs) and small molecule kinase inhibitors (SMKIs) can be effective in treating PDAC, but durable responses to these targeted therapies remain limited to a minority of patients11,12. Overall, the discovery of PDAC-specific early biomarkers can pave new avenues for early diagnosis and treatment.
PDAC develops from pancreatic intraepithelial neoplasms (PanIN) precursor lesions that result from non-invasive pancreatic duct epithelial proliferations13,14. While the formation of PanIN is initiated by oncogene mutations such as KRAS, additional genetic and epigenetic alterations are required for the progression to PDAC. It has been projected that the progression of PanIN through the different stages into invasive PDAC takes about 10 years13,15,16,17. This timeframe provides a great opportunity to benefit from early PDAC diagnosis. Therefore, extensive research has been carried out to establish tumor xenograft animal models and organoid cultures to study PDAC progression18,19,20,21. These models have been very useful for studying the invasive stages of PDAC, although not the transition from the early PanIN phases. It is, therefore, important to develop experimental models that can recapitulate the early progression of PanIN stages to enable the discovery of early detection biomarkers.
Reprogramming somatic cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs) using the four transcription factors OCT4, SOX2, KLF4, and c-MYC (OSKM) has illustrated the extent of cellular plasticity22. Cancer cell plasticity has been well-documented, and reprogramming human cancer cells into iPSCs has been successfully used to reset cells to their original cellular state, removing many of the epigenetic insults that have accumulated during cancer progression23,24,25,26,27,28,29. The possibility of using this reprogramming strategy to manipulate cancer cell identity has, therefore, presented great promise in treating cancer30,31. Indeed, we have previously shown that the differentiation of iPSCs derived from PDACs can recapitulate PDAC progression through the early PanIN stages32. By identifying genes and pathways specific to the early-to-intermediate stages of PDAC, candidate biomarkers were identified that can be clinically used for early PDAC diagnosis32,33. However, the biomarkers discovered using a single iPSC line showed limited coverage in the majority of PDAC patients32. The challenges of generating iPSC lines from other PDAC patients have halted the ability to discover more reliable biomarkers. This is due to many technical factors, including the heterogeneity of OSKM delivery, as only a small portion of human primary PDAC cells contained all four factors and responded successfully to reprogramming. Here, a detailed protocol is presented for reprogramming primary PDAC cells using a more efficient and consistent dual lentiviral delivery of OSKM.

著者スポットライト:がん細胞のiPS細胞へのリプログラミングによる疾患の進行と治療標的の研究

膵管腺癌の多能性へのリプログラミング

1 One of the most challenging aspects of studying PDAC<v>2 or pancreatic cancer is the availability 3 of an experimental model 4 that can recapitulate the progression 5 of PDAC from the early proline stages 6 to the aggressive state. 7 The other challenge is to experimentally capture 8 the plasticity and heterogeneity of PDAC. 9 So using PDAC IPS cells will help us tackle 10 some of these challenges 11 and expand our experimental tools to study this disease.12 We have established a robust protocol 13 to reprogram PDACs to iPS cells. 14 By generating more iPS lines from many more PDAC patients, 15 we can study the transition of pancreatic cancer 16 from early to advanced stages and see the commonalities 17 and differences between these lines. 18 This will help us discover early diagnostic markers 19 that cover more patients, 20 and generate drugs that target 21 the different states of the disease.22 The interesting question that came out of reprogramming 23 PDAC to iPS cells is what makes this cancer 24 so resistant to sulfate conversion compared to normal cells? 25 Is this due to specific genes or genetic mutations 26 that tell us something about cancer cell identity?

PDAC、BXPc3、H6C7、hFib細胞由来のiPS細胞コロニーの形態を示す代表的な画像を 図1に示します。PDAC-iPS細胞コロニーは、リプログラミング25日目に形成され始めました。より確立されたESC様形態を持つ頑健なiPS細胞コロニーが、リプログラミングの40日目に同定されました(図1)。同様に、BxPc3-iPS細胞の形成は23日目に始まり、35?...

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本プロトコルは、膵管腺癌(PDAC)および正常な膵管上皮細胞を人工多能性幹細胞(iPS細胞)に再プログラミングすることを記述する。レンチウイルスの調製から安定なiPS細胞株の樹立まで、最適化された詳細な手順を段階的に提供します。

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...

reprogramming-pancreatic-ductal-adenocarcinoma-to-pluripotency

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

513 ビュー.  The University of Edinburgh. 1 PDAC2 または膵臓がんを研究する上で最も困難な側面の 1 つは、PDAC の進行 5 を初期のプロリン段階 6 から攻撃的な状態まで再現できる実験モデル 4 の利用可能性です。7 もう 1 つの課題は、実験的に 8 PDAC の可塑性と不均一性を捉えることです。9 したがって、PDAC IPS 細胞を使用すると、10 これらの課題のいくつか 11 に取り組み、この病気を?...

ビデオ: 著者スポットライト:がん細胞のiPS細胞へのリプログラミングによる疾患の進行と治療標的の研究

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has proved highly valuable for research and clinical applications. Interestingly, iPSC reprogramming of cancer cells, such as pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), has been shown to revert the invasive PDAC phenotype and override the cancer epigenome. The differentiation of PDAC-derived iPSCs can recapitulate PDAC progression from its early pancreatic intraepithelial neoplasia (PanIN) precursor, revealing the molecular and cellular changes that occur early during PDAC progression. Therefore, PDAC-derived iPSCs can be used to model the earliest stages of PDAC for the discovery of early-detection diagnostic markers. This is particularly important for PDAC patients, who are typically diagnosed at the late metastatic stages due to a lack of reliable biomarkers for the earlier PanIN stages. However, reprogramming cancer cell lines, including PDAC, into pluripotency remains challenging, labor-intensive, and highly variable between different lines. Here, we describe a more consistent protocol for generating iPSCs from various human PDAC cell lines using bicistronic lentiviral vectors. The resulting iPSC lines are stable, showing no dependence on the exogenous expression of reprogramming factors or inducible drugs. Overall, this protocol facilitates the generation of a wide range of PDAC-derived iPSCs, which is essential for discovering early biomarkers that are more specific and representative of PDAC cases.

The present protocol describes the reprogramming of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (PDAC) and normal pancreatic ductal epithelial cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs). We provide an optimized and detailed, step-by-step procedure, from preparing lentivirus to establishing stable iPSC lines.

がん研究

Lentivirus Preparation and Reprogramming Transduction for Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Cells

1 2 To begin, see the HEK 293T cells<v>3 24 hours before transfection 4 in a 15 centimeter dish containing GMEN. 5 Incubate the cells at 37 degrees Celsius 6 and 5%carbon dioxide 7 until they reach 40 to 50%confluency. 8 Label three 15 milliliter plastic tubes 9 with the appropriate lentivirus name.10 Add 1.710 milliliters of reduced serum medium 11 and 90 microliters of transfection reagent to each tube. 12 Mix the contents by vortexing 13 before incubating the tubes at room temperature. 14 After five minutes, add the packaging vector mixture 15 to the transfection medium and vortex.16 Then add 7.5 micrograms of reprogramming vector 17 and the pWPT-GFP control 18 to the respective transfection mixture. 19 Vortex the tubes for two seconds 20 before incubating for 15 minutes at room temperature. 21 To transfect the 293T cells with each lentivirus, 22 dropwise, add a transfection DNA mixture into the dish.23 Incubate the transfected cells at 37 degrees Celsius 24 and 5%carbon dioxide. 25 After 14 to 16 hours, 26 replace the medium with 30 milliliters 27 of fresh 293T medium 28 and continue incubation for 60 to 72 hours. 29 Observe the cells daily 30 and check transfection efficiency.31 Next, transfer the virus transfection culture 32 into 15 milliliter tubes 33 and spin down at 1, 932 G for 10 minutes 34 at four degrees Celsius. 35 Filter the lentiviral supernatant 36 using a 0.45 micron syringe filter 37 into a new 50 milliliter tube. 38 One day before lentivirus transduction, 39 prepare two wells of a 6-well plate 40 containing 100, 000 PDAC cells per well.41 Prepare two 15 milliliter tubes 42 with two milliliters of pre-warmed PDAC medium. 43 In the first tube, 44 add 12 milliliters of reprogramming lentivirus. 45 Then add 12 microliters of polybrene 46 and mix by pipetting.47 To the second tube, 48 add two microliters of polybrene. 49 Now carefully remove the medium from each well 50 of a 6-well plate 51 and wash once with PBS at room temperature. 52 Add the reprogramming infection medium 53 from tube one to the first well.54 Add the mixture from tube two to the second well. 55 Incubate the cells overnight at 37 degrees Celsius 56 with 5%carbon dioxide and 5%oxygen. 57 The next day, replace the medium 58 from both wells with fresh PDAC medium 59 and continue incubation 60 for up to 48 hours as demonstrated.

膵管腺癌細胞に対するレンチウイルスの調製とリプログラミング形質導入

Preparation of iMEF Feeder Cells and Reprogramming Transduction for Induced Pluripotent Stem Cells

1 To begin, coat the 6-well plate<v>2 with two milliliters of 0.2%gelatin solution per well. 3 Incubate the plate at 37 degrees Celsius 4 and 5%carbon dioxide for 30 minutes. 5 Next, drop-wise add iMEFs into a 15 milliliter tube 6 containing 10 milliliters 7 of pre-warmed human fibroblast medium, 8 and mix by gently inverting the tube.9 Centrifuge the cell suspension at 309 G for three minutes. 10 And remove the supernatant before re-suspending the pellet 11 in 12 milliliters of human fibroblast medium. 12 Place two milliliters of the cell suspension 13 into each well of the gelatin-coated six well plate.14 And incubate overnight at 37 degrees Celsius 15 and 5%carbon dioxide. 16 Discard the medium from the lentivirus-infected 17 and non-infected PDAC, and wash the cells twice with PBS. 18 Then add 500 microliters of trypsin to dissociate the cells.19 And incubate at 37 degrees Celsius 20 with 5%carbon dioxide and 5%oxygen 21 for 15 minutes. 22 Centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes. 23 And re-suspend the pellet in one milliliter of PDAC medium.24 Wash the iMEF plate with PDAC medium. 25 Then add 50, 000 lentivirus-infected PDAC cells 26 per well in five wells of iMEF plate, and incubate overnight 27 as demonstrated previously. 28 After preparing the reprogramming medium, 29 add 100 microliters of basic fibroblasts growth factor 30 to 100 milliliters of reprogramming medium.31 The next day, wash the cells growing on iMEF feeders twice 32 with pre-warmed reprogramming media. 33 Then add two milliliters of media to each well, 34 and incubate overnight at 37 degrees Celsius 35 with 5%carbon dioxide and 3%oxygen. 36 After passing the IPSC pool five times, 37 observe the robust colonies 38 maintaining ESC-like morphology.39 The PDAC, BxPc3, 40 H6c7, and human fibroblast 41 showed different days of reprogramming 42 to form a mature ESC-like morphology. 43 Clonal IPSC lines were established 44 from each reprogramming of PDAC, 45 BxPc3, H6c7, 46 and human fibroblast cells. 47 All established IPSC lines stained positive 48 for TRA-160, confirming their reprogramming to pluripotency.