iMEFフィーダー細胞の調製と人工多能性幹細胞の形質導入のリプログラミング

1 まず、6ウェルプレート2をウェルあたり2ミリリットルの0.2%ゼラチン溶液でコーティングします。3プレートを摂氏37度でインキュベートします。4と5%二酸化炭素で30分間インキュベートします。5次に、予熱したヒト線維芽細胞培地8の10ミリリットルを含む15ミリリットルのチューブ6にiMEFを滴下し、チューブを穏やかに反転させて混合します。

9 細胞懸濁液を309 Gで3分間遠心分離します。10そして、ペレット11をヒト線維芽細胞培地の12ミリリットルに再懸濁する前に、上清を取り除きます。12ゼラチン被覆6ウェルプレートの各ウェルに2ミリリットルの細胞懸濁液13を入れる。

14そして、摂氏37度で一晩インキュベートします 15 二酸化炭素5%。16 レンチウイルス感染 17 および非感染 PDAC から培地を廃棄し、PBS で細胞を 2 回洗浄します。18次に、500マイクロリットルのトリプシンを加えて細胞を解離します。

19そして、摂氏37度で20°Cで5%の二酸化炭素と5%の酸素21で15分間インキュベートします。22 細胞懸濁液を300 Gで5分間遠心分離します。23そして、ペレットを1ミリリットルのPDAC培地に再懸濁します。

24 iMEFプレートをPDACメディウムで洗います。25次に、iMEFプレートの5つのウェルにウェルあたり50,000個のレンチウイルス感染PDAC細胞26を加え、前に示したように一晩27をインキュベートします。28再プログラミング培地を調製した後、29は100マイクロリットルの塩基性線維芽細胞成長因子30〜100ミリリットルの再プログラミング培地を加える。

31 翌日、iMEFフィーダーで増殖する細胞を、あらかじめ温めたリプログラミング培地で2回32洗浄する。33次に、各ウェルに2ミリリットルの培地を加え、34、摂氏37度で5%の二酸化炭素と3%の酸素で一晩インキュベートします。36 IPSCプールを5回通過した後、37 ESCのような形態を維持している堅牢なコロニー38を観察する。

39 PDAC、BxPc3、40 H6c7、およびヒト線維芽細胞41は、成熟したESC様形態を形成するためのリプログラミング42の異なる日を示した。43 PDAC、45 BxPc3、H6c7、46およびヒト線維芽細胞の各リプログラミングから44のクローンIPSCラインが確立された。47 確立されたすべてのIPSCラインは、TRA-160に対して陽性48を染色し、多能性への再プログラミングを確認しました。