H9胚性幹細胞を培養し、ヒト神経網膜を作製

まず、1ミリリットルの1%細胞外マトリックスを6ウェルプレートの各ウェルに加えます。プレートを5%の二酸化炭素雰囲気中で摂氏37度でインキュベートします。1時間後、0.4マイクロモルY-27632を含む2ミリリットルの予温維持培地を各ウェルに加えます。

H9胚性幹細胞を融解するには、クライオバイアルストックを摂氏37度のウォーターバスで30秒間振とうします。75%消毒用アルコールスプレーでクライオバイアルを慎重に滅菌します。次に、融解した細胞を、維持培地とY-27632を含む15ミリリットルのチューブに移します。

チューブを室温で190Gで5分間遠心分離します。次に、上清の大部分を慎重に除去し、Y-27632を含む1ミリリットルの維持培地に細胞を再懸濁します。0.5ミリリットルの細胞懸濁液を、維持培地を含む細胞外マトリックスコーティングプレートの各ウェルに分注します。

プレートを横方向に振とうし、プレートを摂氏37度、5%二酸化炭素で少なくとも24時間インキュベートします。培地は毎日交換してください。クローン密度が70%に達したら、使用済みの培地を取り除きます。

2D PBS洗浄後、細胞を1ミリリットルのEDTAと室温で4〜7分間インキュベートし、EDTAを完全に廃棄します。セルに1ミリリットルの維持培地を加え、プレートを軽くたたきます。次に、除去した細胞を15ミリリットルのチューブに移し、3〜5回混合します。

20〜100マイクロリットルの細胞懸濁液を、事前に調製したECMコーティングディッシュの各ウェルに加え、よく混合します。顕微鏡を用いて細胞密度を確認し、5%の二酸化炭素下で37°Cで細胞をインキュベートします。