Bu çalışma, Helsinki Bildirgesi'nin İlkelerine uygun olarak yürütülmüş ve Çin PLA Genel Hastanesi Kurumsal Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. WA09 (H9) ESC hattı, WiCell Araştırma Enstitüsü'nden alınmıştır.
1. Kültür ortamı ve reaktif hazırlama
<ol><li>İnsan ESC kültür ortamı ve geçiş çözümü<ol><li>Bakım ortamı (MM): Aseptik olarak 500 mL tam MM (Bazal Ortam + 5x ek; Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın. 5x takviyesini oda sıcaklığında (RT) veya gece boyunca 2-8 °C'de çözdürün. RT'ye önceden ısıtın. Ek bulanıklık giderene kadar kullanmadan önce iyice karıştırın.</li>
		<li>%1 hücre dışı matris (ECM): Buz üzerinde tüp başına 200 μL ECM ( Malzeme Tablosuna bakın) dağıtmak için önceden soğutulmuş bir pipet ucu ve steril tüpler kullanın. Tüpleri -20 °C'lik bir dondurucuda saklayın. ECM'yi buz üzerinde eritin ve 1:100'de önceden soğutulmuş DMEM/F12 ile seyreltin.</li>
		<li>0.5 mM pH = 8.0 EDTA: 500 mL 0.5 mM EDTA hazırlamak için, 500 mL 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinine (DPBS) 500 μL 0.5 M EDTA ve 0.9 g NaCl ekleyin (bkz. İyice karıştırın ve 2-8 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Retina farklılaşma ortamı<ol><li>Büyüme faktörü içermeyen kimyasal olarak tanımlanmış ortam (gfCDM): %45 Iscove'un modifiye edilmiş Dulbecco'nun orta-GlutaMAX'ını (IMDM-GlutaMAX), %45 Jambon'un F12-GlutaMAX'ını (F12-Glutamax), %10 nakavt serum replasmanı (KSR), %1 kolesterol lipid konsantresi ve 450 μM tiyogaliserol'ü birleştirerek gfCDM'yi hazırlayın (bkz.</li>
	</ol></li>
	<li>Küçük moleküllü bileşikler<ol><li>Y-27632 2HCl: 3.122 mL dimetil sülfoksite (DMSO) 50 mg Y-27632 tozu ekleyin. Y-27632'yi ( Malzeme Tablosuna bakın) 50 mM konsantrasyonda -80 °C'de 2 yıl boyunca ışıktan uzak tutarak dağıtın ve saklayın. Stoku kullanım için 2.500 kez (20 μM) seyreltin, bu da mL gfCDM başına 0,4 μL Y-27632'ye eşdeğerdir.</li>
		<li>IWR1-endo: 10 mM'lik bir stok çözeltisi elde etmek için 10 mg IWR1-endo'yu çözmek için 2.4424 mL DMSO ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Alikotları dağıtın ve -80 °C'de 2 yıla kadar saklayın. İndüksiyon için 3 μM konsantrasyonu için mL gfCDM başına 0.3 μL 10 mM IWR1-endo ekleyin.</li>
		<li>SB431542: 50 mM SB431542 hazırlamak için, 0.5203 mL DMSO'ya 10 mg SB431542 ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve iyice karıştırın. -80 °C'de solvent içinde en fazla 2 yıl saklayınız. 10 μM'lik bir çalışma konsantrasyonunda SB431542 hazırlanması için, 10 mL gfCDM'ye 2 μL 50 mM stok çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>LDN-193189 2HCl: 1 mM stok çözeltisi elde etmek için 5 mg LDN-193189 2HCl'yi ( Malzeme Tablosuna bakınız) 10.4297 mL DMSO içinde çözün. -20 °C veya -80 °C'de saklayın (üretici tarafından önerildiği gibi). Her 10 mL gfCDM'ye 0,1 μL stok ekleyin, bu da indüksiyon için 100 nM LDN-193189 ile sonuçlanır.</li>
		<li>Rekombinant İnsan kemiği morfogenetik proteini 4 (BMP4): 4 mM HCl'de 50-200 μg/mL'de sulandırılır (bkz. Sulandırıldıktan sonra 2 °C ila 8 °C'de 1 ay veya -20 °C'de 1 yıl saklayın. 1.5 nM BMP4 kullanarak NR indüksiyonunu gerçekleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Uzun süreli NR kültür ortamı<ol><li>Retinoik asit (RA): 6 mg RA tozu ölçün (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 3.9941 mL DMSO'ya ekleyin. −80 °C'de 5 mM'lik alikotlarda saklayın ve 3 ay içinde kullanın. 0.5 μM'lik bir çalışma konsantrasyonu elde etmek için, 100 mL nöral retina farklılaşma ortamına (NRDM) 10 μL ana karışım ekleyin. Kullanmadan hemen önce ekleyin. NOT: Hazırlama ve saklama sırasında ışıktan uzak tutun.</li>
		<li>Taurin: 200 mM'lik bir stok çözeltisi elde etmek için 200 mg ila 7.9904 mL DMSO ağırlığında taurin tozu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. 2-8 °C'de dağıtın ve saklayın. 100 mL NRDM başına 50 μL stok çözeltisi eklenerek 0.1 mM taurin çalışma konsantrasyonu elde edilir.</li>
		<li>NRDM: NRDM'YI DMEM / F12-GlutaMAX ortamı,% 1 N2 takviyesi,% 10 fetal sığır serumu, 0,5 mM RA ve 0,1 mM taurin ile birleştirin (bkz. Bileşenlerin aktivitesini sağlamak için 2-8 °C'de 2 haftaya kadar veya -20 °C'de 6 aya kadar saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Engelleme tamponu: Kullanım için% 10'luk bir çalışma çözeltisi elde etmek için DPBS ile 1: 9 oranında seyreltin (Malzeme Tablosuna bakın). -20 °C'de 5 yıla kadar saklayın. NOT: Steriliteyi sağlamak için tartım hariç diğer tüm prosedürleri Sınıf II Biyogüvenlik Kabininde gerçekleştirin. Hazırlama işlemi sırasında tartılan reaktiflerin eklenmesi gerekiyorsa, filtrasyon için 0,22 μm filtreler kullanın.</li>
</ol>2. H9-ESC'lerin Kültürlenmesi
<ol><li>H9-ESC'lerin Çözülmesi<ol><li>6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1 mL %1 ECM ekleyin. %5CO2 atmosferinde 37 °C'de bir inkübatörde 1 saat inkübe edin. NOT: Yüzeye yapışabileceğinden, kuyu duvarları boyunca ECM eklemekten kaçının.</li>
		<li>Sıvı nitrojen tankından bir H9-ESC kriyoviyal stoğu alın ve 37 °C suda 30 saniye boyunca hızlıca çalkalayın. NOT: Şişenin tamamen çözülmesine izin vermeyin.</li>
		<li>Şişeyi çıkarın ve% 75 dezenfektan alkol spreyi kullanarak dikkatlice sterilize edin. Çözülmüş H9-ESC'yi kriyoviyalden 10 μM Y-27632 ile 9 mL MM içeren 15 mL'lik bir tüpe ekleyin.</li>
		<li>Tüpü RT'de 5 dakika boyunca 190 × g'da santrifüjleyin. Hücre kaybını önlemek için süpernatantın çoğunu 1 mL'lik bir pipetle dikkatlice çıkarın ve yaklaşık 50 μL süpernatan bırakın.</li>
		<li>Hücre tortusuna 10 μM Y27632 içeren 1 mL MM ekleyin ve 5-10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre tortusunu 1 mL'lik bir pipetle nazikçe yeniden süspanse edin.</li>
		<li>1 saatlik inkübasyondan sonra ECM kaplamasını çıkarın. Her kuyucuğa 10 μM Y-27632 içeren 2 mL önceden ısıtılmış MM ekleyin.</li>
		<li>Kuyucuk başına 0.5 mL hücre süspansiyonu dağıtın. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için plakayı yanal olarak hafifçe sallayın.</li>
		<li>Plakayı 37 °C'de %5CO2 altında dokunmadan en az 24 saat inkübe edin.</li>
		<li>Ortamı günlük olarak değiştirin. Klon yoğunluğu %70 ve üzerine ulaştığında pasaj gereklidir.</li>
	</ol></li>
	<li>H9-ESC'lerin Geçişi<ol><li>ECM kaplı plakayı yukarıda açıklandığı gibi hazırlayın (adım 2.1.1) ve oyuk başına 2 mL MM ekleyin.</li>
		<li>Harcanan ortamı 6 oyuklu plakalardan çıkarın. Her kuyuyu iki kez 1 mL DPBS ile yıkayın.</li>
		<li>Yavaşça 1 mL EDTA ekleyerek ve RT'de 4-7 dakika boyunca 1 mL EDTA ile inkübe ederek her bir kuyuyu iki kez yıkayın. NOT: İnkübasyon sırasında, 6 oyuklu plakayı mikroskop altında 3 dakika inceleyin. Çoğu hücre çanaktan ayrılmaya yakınsa hemen bir sonraki adıma geçin. Hücreler üzerindeki olumsuz etkiyi azaltmak için uzun süre inkübasyondan kaçının.</li>
		<li>EDTA'yı atın ve sindirimi durdurmak için 1 mL MM ekleyin.</li>
		<li>Hücrelerin çoğu ayrılana kadar kuyu plakasına hafifçe vurun.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunu 5 mL'lik bir pipetle 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne dikkatlice aktarın. H9-ESC kolonilerini bir Pasteur pitette ile karıştırmak için 3-5 kez yukarı ve aşağı hafifçe yeniden süspanse edin. 20-100 μL hücre süspansiyonunu yeni bir ECM kaplı 6 oyuklu kültür kabına aktarın ve ileri geri sallayın.</li>
		<li>Mikroskop altında hücre yoğunluğunun yeterli olduğu gözlendiğinde, plakayı 37 °C'de %5CO2 altında en az 24 saat dokunmadan inkübe edin.</li>
		<li>Medyayı günlük olarak değiştirin. %70 klon yoğunluğu ve üzerinde geçiş gereklidir.</li>
	</ol></li>
</ol>3. İnsan NR'lerinin üretilmesi
NOT: Koloniler yaklaşık% 70 birleşme elde ettikten sonra, Şekil 1'de özetlenen prosedür adımları kullanılarak retinal organoidlere (RO'lar) farklılaşmaya yönlendirilebilirler.
<ol><li>0. Gün - Embriyoid cisim (EB) oluşumu<ol><li>Hücreleri 2 mL DPBS ile yıkadıktan sonra, kuyuya 20 μM Y27632 içeren 0.5 mL CDS ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. Nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de 3 dakika inkübe edin. NOT: Mikroskop altında kontrol edin. Hücreler üzerinde zararlı etkilerden kaçınmak için inkübasyon süresini mümkün olduğunca azaltın.</li>
		<li>20 μM Y27632 içeren 3 mL MM ekleyerek sindirimi durdurun. 5 dakika boyunca 190 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Hücre peletini 20 μM Y27632 içeren 1 mL gfCDM'de yeniden süspanse edin ve hücreleri sayın. 20 μM Y-27632, 3 μM IWR1-endo, 10 μM SB431542 ve 100 nM LDN-193189 ile önceden dahil edilmiş 10 mL gfCDM'ye 1.2 × 106 hücre (kuyu başına 1.2 × 104 hücre) için karşılık gelen hacmi ekleyin (bkz.</li>
		<li>96 V tabanlı konik kuyucuğun her bir kuyucuğuna 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Plakayı 6. güne kadar nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin. NOT: EB'lerin yapışmasını artırmak için bulaşıkları en az 24 saat hareket ettirmeyin.</li>
	</ol></li>
	<li>6. Gün - Retina indüksiyonu<ol><li>6. günde, EB'lerde kültür ortamının tam bir değişimine izin vermek için 55 ng / mL BMP4 içeren 10 mL gfCDM ekleyin. Plakayı inkübatöre geri koyun. NOT: Hava kabarcıklarını önlemek için 96 V tabanlı konik kuyunun duvarlarına doğru pipetleyin. Ortamı değiştirirken herhangi bir organoid almaktan kaçının.</li>
		<li>9. gün, 12. gün ve 15. günde yarı-orta değişim gerçekleştirin. BMP4'ü kademeli olarak seyreltmek için ortamın yarısını taze gfCDM ile değiştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>18. Gün - Uzun süreli NR kültürü<ol><li>18. günde, oluşan EB'leri 5 mL Pasteur pipetleri kullanarak dikkatlice 15 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın ve NRDM ile nazikçe tekrar durulayın. EB'leri düşük adsorpsiyonlu 6 oyuklu veya 24 oyuklu plakalara aktarın (bkz. Malzeme Tablosu). Plakayı inkübatöre geri koyun.</li>
		<li>Ortamı her 3 günde bir taze NRDM ile değiştirin. NOT: RA ışığa duyarlı olduğu için ortam değişimi sırasında ışığı kapatın. Kötü farklılaşmış organoidleri çıkarın ve yapışık organoidleri mikroskop altında ayırın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. İnsan NR'lerinin analizi
<ol><li>RO'ların montajı<ol><li>Üç parti RO'yu indüklemek için farklı nesil H9-ESC'ler seçin. NOT: İndüksiyon başarı oranını değerlendirmek için değerlendirilen üç yöntemin her biri (Kuwahara ve ark.12, Döpper ve ark.27 ve bu çalışmadaki modifiye yöntem) için oluşturan NR sayısının üç plakası hesaplanmıştır. Işık mikroskobu 30. günde nöroepitel benzeri yapıların oluşumunu ortaya çıkarırsa indüksiyon başarılı kabul edilir.</li>
	</ol></li>
	<li>RO'ların immünofloresan boyanması<ol><li>3-5 RO'yu 1.5 mL'lik tüplere aktarın. Fazla ortamı pipetleyin ve RO'ları RT'de 1 mL DPBS ile bir kez yıkayın. RO'ların batmasına izin verin ve DPBS'yi dikkatlice çıkarın. 1.5 mL tüp başına 1 mL %4 paraformaldehit ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 4 °C'de sabitleyin. NOT: 6. ve 18. gündeki RO'lar, 2 saat düzeltin. 30. günde 12 saat ve 60. günde 14 saat sabitleyin.</li>
		<li>Fiksasyondan sonra, gradyan alkol kullanarak dehidre edin. RO'ları %50, %60 ve %70 alkolde 15 dakika ve ardından %80, %90, %95, %100 ve %100 alkolde 10 dakika bekletin. Ardından, 10 dakika boyunca 1:1 oranında %100 alkol ve ksilen karışımı, ardından her biri 10 dakika boyunca iki kez ksilen ekleyin.</li>
		<li>RO'ları 40 dakika boyunca erimiş paraplastla doldurulmuş metal kalıplara yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve ardından RO'ları sabitlemek için kalıpları buz üzerinde söndürün. Gömme kutularını kalıplara yerleştirin ve gece boyunca -20 °C'de dondurun. Ardından, gömme kutularını dikkatlice çıkarın. Son olarak, bunları RT'de saklayın.</li>
		<li>Parafin dilimleyici ile sürekli kesitler (5 μm kalınlıkta) oluşturun. Dilimleri yapışma mikroskobu slaytlarına sabitleyin, kurutun ve RT'de saklayın.</li>
		<li>Antijen onarımından önce mum alma ve rehidrasyon gerçekleştirin12,27.</li>
		<li>190 mLddH2O'ya(çift damıtılmışH2O) 10 mL 20x pH 6.0 Sitrat Antijen Alma Çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. Kaynayana kadar 4 dakika mikrodalgada yüksek modda ısıtın. Parafin bölümlerini ekledikten sonra, antijen onarımını tamamlamak için bölümleri düşük modda 20 dakika ısıtın.</li>
		<li>Parafin bölümlerinin havalandırılan bir alanda doğal olarak soğumasına izin verin ve ardından nemli bir odaya koyun.</li>
		<li>Bölümlerin ana hatlarını çizmek için bir pap kalem kullanın (Malzeme Tablosuna bakın). Membranları kırmak için RT'de% 0.2 Triton X-100 ile 30 dakika inkübe edin, ardından slaytları her biri 5 dakika boyunca TPBS ile üç kez yıkayın.</li>
		<li>Boyama alanı başına 10 μL ile nemli bir odada 1 saat boyunca RT'de DPBS'de seyreltilmiş% 10 eşek serumu ile bloklayın.</li>
		<li>% 10 eşek serumu ile seyreltilmiş primer antikorları ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de bir nem odasında inkübe edin. Bağlanmamış antikoru çıkarmak için numuneleri TPBS ile her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. NOT: Primer antikorlar aşağıdaki gibidir: anti-PAX6 (1: 250), anti-SOX2 (1: 200), anti-KI67 (1: 200), anti-CHX10 (1: 200), anti-β tubulin III (1: 250) ve anti-NESTIN (1: 200) (bkz.</li>
		<li>Nemlendirilmiş bir odada RT'de 1 saat boyunca DPBS'de seyreltilmiş ikincil antikorlarla inkübe edin. TPBS ile yıkama adımını her biri 10 dakika boyunca üç kez tekrarlayın. NOT: Floresan sekonder antikorun sönmesini önlemek için karanlıkta tutun. İkincil antikorlar, eşek anti-fare IgG ile konjuge Alexa Fluor 488 ve eşek anti-tavşan IgG ile 1:400 seyreltmede konjuge Alexa Fluor 568'dir (bkz.</li>
		<li>DAPI içeren DPBS (1: 500; Malzeme Tablosuna bakınız) ile karanlıkta RT'de 10 dakika inkübe edin. Her biri 10 dakika boyunca TPBS ile üç kez yıkayın.</li>
		<li>Sürgünün üzerine uygun miktarda anti-floresan sızdırmazlık maddesi ( Malzeme Tablosuna bakın) damlatın ve kapak fişleriyle örtün.</li>
		<li>Akış benzeri bir doku hücresi kantitatif analizörü (Malzeme Tablosuna bakın) veya benzerini kullanarak görselleştirin.</li>
		<li>Slaytları mikroskobik analizden sonra karanlıkta -20 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Gelişmiş 3D Nöral Retina Farklılaşması

<ol>
	<li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, ., Wong, L., O, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+retina:+development+and+disease.">Functional architecture of the retina: development and disease.</a> Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).</li><li>Steinmetz, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+of+blindness+and+vision+impairment+in+2020+and+trends+over+30+years,+and+prevalence+of+avoidable+blindness+in+relation+to+VISION+2020:+the+Right+to+Sight:+an+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study.">Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).</li><li>Pascolini, D., Mariotti, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+estimates+of+visual+impairment:+2010.">Global estimates of visual impairment: 2010.</a> Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).</li><li>Singh, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+stage-specific+proliferation+and+retinoblastoma+genesis+in+RB-deficient+human+but+not+mouse+cone+precursors.">Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).</li><li>Slijkerman, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pros+and+cons+of+vertebrate+animal+models+for+functional+and+therapeutic+research+on+inherited+retinal+dystrophies.">The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies.</a> Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).</li><li>Peng, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+classification+and+comparative+taxonomics+of+foveal+and+peripheral+cells+in+primate+retina.">Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina.</a> Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).</li><li>Ribeiro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+visual+function+in+advanced+disease+after+transplantation+of+purified+human+pluripotent+stem+cell-derived+cone+photoreceptors.">Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors.</a> Cell Rep. 35 (3), 109022 (2021).</li><li>Mehat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells+in+macular+degeneration.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration.</a> Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).</li><li>Manafi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+and+organ+chips+in+ophthalmology.">Organoids and organ chips in ophthalmology.</a> Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).</li><li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+potential+in+organoid+research.">Progress and potential in organoid research.</a> Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).</li><li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li><li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation`of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue.">Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nat Commun. 6, 6286 (2015).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nat Commun. 5, 4047 (2014).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+organoids:+a+window+into+human+retinal+development.">Retinal organoids: a window into human retinal development.</a> Development. 147 (24), (2020).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+resveratrol+on+the+ethanol-induced+disruption+of+retinogenesis+in+pluripotent+stem+cell-derived+organoids.">Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids.</a> FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).</li><li>Zou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid-derived+C-Kit(+)/SSEA4(-)+human+retinal+progenitor+cells+promote+a+protective+retinal+microenvironment+during+transplantation+in+rodents.">Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents.</a> Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).</li><li>Mandai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-derived+Retinal+organoid/cells+for+retinal+regeneration+therapies:+A+review.">Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review.</a> Regen Ther. 22, 59-67 (2023).</li><li>Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+and+organoid+culture+in+research:+physiology,+hereditary+genetic+diseases+and+cancer.">3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer.</a> Cell Biosci. 12 (1), 39 (2022).</li><li>Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neurological+disorders+in+3D+organoids+using+human-derived+pluripotent+stem+cells.">Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 640212 (2021).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+Retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), 171686 (2019).</li><li>Sanjurjo-Soriano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RA+delays+initial+photoreceptor+differentiation+and+results+in+a+highly+structured+mature+Retinal+organoid.">RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478 (2022).</li><li>Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+organoids:+cultivation,+differentiation,+and+transplantation.">Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation.</a> Front Cell Neurosci. 15, 638439 (2021).</li><li>Zerti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+simple+method+to+enhance+the+generation+of+cone+and+rod+photoreceptors+in+pluripotent+stem+cell-derived+Retinal+organoids.">Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids.</a> Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=transcriptome+profiling,+and+functional+validation+of+cone-rich+human+Retinal+organoids.">transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li><li>Yamasaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+Chk1+inhibitor+and+BMP4+cooperatively+promotes+retinal+tissue+formation+in+self-organizing+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+culture.">Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture.</a> Regen Ther. 19, 24-34 (2022).</li><li>D&#246;pper, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+protocol+for+3D+Retinal+organoids,+immunostaining+and+signal+quantitation.">Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120 (2020).</li><li>Norrie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+from+human+stem+cell-derived+Retinal+organoids.">Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids.</a> Nat Commun. 12 (1), 4535 (2021).</li></ol>

Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

İnsan RO'ları, fetal retinanın gelişimini uzamsal ve zamansal olarak özetleyebilir ve erken RO'lar, gelişimin eşdeğer aşamalarında fetal retinaya yüksek derecede benzerlik gösterir15. Doku morfolojisi ve moleküler ekspresyon açısından, insan RO'su retina dokusunun gerçek büyüme durumunu yakından yansıtır ve hastalık modellemesi, ilaç taraması ve rejeneratif tıp alanlarında muazzam ve benzeri görülmemiş fırsatlar sunar. Şu anda, in vitro insan PSC'lerinden R...

Göz, insan duyu organları arasında birincil bilgi kaynağı olarak hizmet eder ve retina, memeli gözlerinde başlıca görsel duyu dokusudur1. Retinopati, körlüğe yol açan göz hastalıklarının başlıca küresel nedenlerinden biridir2. Dünya çapında yaklaşık 2,85 milyon insan retinopati nedeniyle çeşitli derecelerde görme bozukluğundan muzdariptir3. Sonuç olarak, patogenezinin araştırılması erken tanı ve zamanında tedavi için çok önemlidir. İnsan retinopatisi üzerine yapılan çalışmaların çoğu öncelikle hayvan modellerine odaklanmıştır 4,5,6. Bununla birlikte, insan retinası, çeşitli hücre tiplerini içeren karmaşık, çok katmanlı bir dokudur. Geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültürü ve hayvan modeli sistemleri tipik olarak doğal insan retinasının normal uzay-zamansal gelişimini ve ilaç metabolizmasını aslına uygun olarak özetlemekte başarısızolur 7,8.
Son zamanlarda, pluripotent kök hücrelerden (PSC'ler) doku benzeri organlar üretmek için 3D kültür teknikleri gelişmiştir9,10. Bir 3D süspansiyon kültürü sisteminde insan PSC'lerinden üretilen retinal organoidler (RO'lar) sadece yedi retinal hücre tipi içermekle kalmaz, aynı zamanda insan retinasına benzer farklı bir tabakalı yapı sergiler in vivo 11,12,13. İnsan PSC'den türetilen RO'lar popülerlik ve yaygın kullanılabilirlik kazanmıştır ve şu anda insan retinasının gelişimini ve hastalığını incelemek için en iyi in vitro modellerdir14,15. Son birkaç on yılda, çok sayıda araştırmacı, embriyonik kök hücreler (ESC'ler) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) dahil olmak üzere insan PSC'lerinin çeşitli indüksiyon protokolleri kullanarak RO'lara farklılaşabileceğini göstermiştir. Bu gelişmeler, hastalık modellemesi, ilaç taraması ve kök hücre bazlı tedaviler için retinopatide muazzam bir potansiyele sahiptir 16,17,18.
Bununla birlikte, insan pluripotent kök hücrelerinden (PSC'ler) nöral retina (NR) üretimi karmaşık, zahmetli ve zaman alıcı bir süreçtir. Ayrıca, doku organoidlerindeki partiden partiye varyasyonlar, sonuçların daha düşük tekrarlanabilirliğine yol açabilir19,20. Başlangıç hücrelerinin sayısı veya türü ve transkripsiyon faktörlerinin ve küçük moleküllü bileşiklerinkullanımı gibi çok sayıda içsel ve dışsal faktör retinal organoidlerin (RO'lar) verimini etkileyebilir 21,22,23. İlk insan RO'su Sasai laboratuvarı11 tarafından üretildiğinden beri, indüksiyon işleminin 13,21,24,25 kolaylığını ve etkinliğini artırmak için yıllar içinde çok sayıda modifikasyon önerilmiştir. Ne yazık ki, bugüne kadar, tüm laboratuvarlarda RO üretmek için altın standart bir protokol oluşturulmamıştır. Gerçekten de, farklı indüksiyon yöntemlerinden kaynaklanan RO'larda belirli bir derecede tutarsızlık ve ayrıca retinal belirteçlerin ekspresyonunda ve yapılarının sağlamlığında geniş farklılıklar vardır22,26. Bu sorunlar, örneklem toplamayı ve çalışma bulgularının yorumlanmasını ciddi şekilde zorlaştırabilir. Bu nedenle, RO üretiminin minimum heterojenliği ile verimliliği en üst düzeye çıkarmak için daha konsolide ve sağlam bir farklılaşma protokolüne ihtiyaç vardır.
Bu çalışma, Kuwahara ve ark.12 ve Döpper ve ark.27'nin ayrıntılı talimatlarla bir kombinasyonuna dayanan optimize edilmiş bir indüksiyon protokolünü açıklamaktadır. Yeni yöntem, organoid vezikülasyon ve füzyon olasılığını önemli ölçüde azaltarak NR üretme başarı oranını artırır. Bu gelişme, retina bozuklukları için hastalık modellemesi, ilaç taraması ve hücre tedavisi uygulamaları için büyük umut vaat ediyor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01 M TPBS</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G0002</td>
			<td>Washing slices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G1101-500ML</td>
			<td>Fix retinal organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pasteur pipette</td>
			<td>NEST Biotechnology</td>
			<td>318516</td>
			<td>Pipette retinal organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 V-bottomed conical wells</td>
			<td>Sumitomo Bakelit</td>
			<td>MS-9096VZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>CITOTEST</td>
			<td>188105</td>
			<td>Fix slices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5893</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous ethanol</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td>10009218</td>
			<td>Dehydrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CHX10</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-365519</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifade Solution</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KI67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16667</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NESTIN</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N5413</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neuronal Class III &#946;-Tubulin(TUJ1)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>AT809</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PAX6</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab195045</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell dissociation solution(CDS)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7922</td>
			<td>Cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td>GSK-3&#945;/&#946; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol Lipid Concentrate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12531018</td>
			<td>250&#215;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Antigen Retrieval Solution</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G1202-250ML</td>
			<td>20&#215;, pH 6.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS10</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>1001061</td>
			<td>Cell Freezing Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>Nuclear counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565018</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32766</td>
			<td>Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL518A</td>
			<td>0.5 M, pH 8.0, cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (ECM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Coating plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12-Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31765035</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A5669701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow-like tissue cell quantitative analyzer</td>
			<td>TissueGnostics</td>
			<td>TissueFAXS Plus</td>
			<td>Scan sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM-GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31980030</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR1-endo</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7086</td>
			<td>Wnt-inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN-193189 2HCl</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7507</td>
			<td>BMP-inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-adhesion 24-well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-adhesion 6-well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maintenance medium (MM)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SL050</td>
			<td>Blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td>Tissue embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4 basic (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td>Without Ca+,Mg+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>314-BP</td>
			<td>Key protein factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Powder, keep out of light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1067</td>
			<td>ALK5-inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU5402</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7667</td>
			<td>Tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super PAP Pen</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioglycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td>Permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WA09 embryonic stem cell line</td>
			<td>WiCell Research Institute</td>
			<td></td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td>10023418</td>
			<td>Dewaxing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HCL</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td>ROCK-inhibitor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating neural retina from human pluripotent stem cells

Retinopati, dünya çapında körlüğün ana nedenlerinden biridir. Retinopatinin erken tanısı ve zamanında tedavisi için patogenezinin araştırılması esastır. Ne yazık ki, etik engeller insanlardan kanıt toplanmasını engellemektedir. Son zamanlarda, çok sayıda çalışma, insan pluripotent kök hücrelerinin (PSC'ler), hastalık modellemesi, ilaç taraması ve kök hücre bazlı tedaviler için retinopatide muazzam potansiyele sahip olan farklı indüksiyon protokolleri kullanılarak retinal organoidlere (RO'lar) farklılaştırılabileceğini göstermiştir. Bu çalışma, vezikülasyon ve füzyon olasılığını önemli ölçüde azaltan ve 60. güne kadar üretimin başarı oranını artıran nöral retina (NR) oluşturmak için optimize edilmiş bir indüksiyon protokolünü açıklamaktadır. PSC'lerin ayrışmadan sonra kendi kendini yeniden düzenleme yeteneğine dayanarak, bazı tamamlayıcı faktörlerle birlikte, bu yeni yöntem özellikle NR farklılaşmasını sağlayabilir. Ayrıca, yaklaşım karmaşık değildir, uygun maliyetlidir, kayda değer tekrarlanabilirlik ve verimlilik sergiler, kişiselleştirilmiş retina hastalıkları modelleri için cesaret verici beklentiler sunar ve hücre tedavisi, ilaç taraması ve gen terapisi testi gibi uygulamalar için bol miktarda hücre rezervuarı sağlar.

The eye serves as the primary source of information among human sensory organs, with the retina being the principal visual sensory tissue in mammalian eyes1. Retinopathy stands as one of the primary global causes of eye diseases, leading to blindness2. Approximately 2.85 million people worldwide suffer from varying degrees of vision impairment due to retinopathy3. Consequently, investigating its pathogenesis is crucial for early diagnosis and timely treatment. Most studies on human retinopathy have primarily focused on animal models4,5,6. However, the human retina is a complex, multi-layered tissue comprising various cell types. Traditional two-dimensional (2D) cell culture and animal model systems typically fail to faithfully recapitulate the normal spatiotemporal development and drug metabolism of the native human retina7,8.
Recently, 3D culture techniques have evolved to generate tissue-like organs from pluripotent stem cells (PSCs)9,10. Retinal organoids (ROs) generated from human PSCs in a 3D suspension culture system not only contain seven retinal cell types but also exhibit a distinct stratified structure similar to the human retina in vivo11,12,13. Human PSC-derived ROs have gained popularity and widespread availability and are currently the best in vitro models for studying the development and disease of the human retina14,15. Over the past few decades, numerous researchers have demonstrated that human PSCs, including embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs), can differentiate into ROs using various induction protocols. These advancements hold enormous potential in retinopathy for disease modeling, drug screening, and stem cell-based therapies16,17,18.
However, the generation of neural retina (NR) from human pluripotent stem cells (PSCs) is a complex, cumbersome, and time-consuming process. Furthermore, batch-to-batch variations in tissue organoids may lead to lower reproducibility of results19,20. Numerous intrinsic and extrinsic factors can influence the yield of retinal organoids (ROs), such as the number or species of starting cells and the use of transcription factors and small-molecule compounds21,22,23. Since the first human RO was generated by the Sasai laboratory11, multiple modifications have been proposed over the years to enhance the ease and effectiveness of the induction process13,21,24,25. Unfortunately, to date, no gold standard protocol has been established for generating ROs in all laboratories. Indeed, there is a certain degree of discrepancy in ROs resulting from different induction methods, as well as wide variation in the expression of retinal markers and the robustness of their structure22,26. These issues may severely complicate sample collection and the interpretation of study findings. Therefore, a more consolidated and robust differentiation protocol is needed to maximize efficiency with minimal heterogeneity of RO generation.
This study describes an optimized induction protocol based on a combination of Kuwahara et al.12 and D&#246;pper et al.27 with detailed instructions. The new method significantly reduces the probability of organoid vesiculation and fusion, increasing the success rate of generating NR. This development holds great promise for disease modeling, drug screening, and cell therapy applications for retinal disorders.

Yazar Spotlight: Hastalık Modellemesi için Basit ve Verimli Nöral Retina Organoid Üretimi

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Nöral Retina Üretimi

Değiştirilen protokolün grafiksel bir özeti Şekil 1'de gösterilmektedir. H9-ESC'ler, hücreler %70-80'lik bir yoğunluğa büyütüldüğünde RO'ları üretmek için kullanıldı. 96 V tabanlı konik kuyuda H9-ESC'lerin tek hücreli süspansiyonları 1. günde toplandı ve 6. günde iyi sınırlandırılmış yuvarlak EB'ler oluşturdu. Kültür zamanı arttıkça, EB'lerin hacmi giderek arttı. 30. günde, uzun süreli NR farklılaşması sırasında nöroepitel benzeri yapılar aç?...

Watch this Scientific Journal Video about Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Mevcut protokol, retinal organoidlerin yapışmasını ve füzyonunu yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilikle azaltan optimize edilmiş bir 3D nöral retina indüksiyon sistemini tanımlamaktadır.

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of ...

Grubumuz, insan retina hastalıklarının patogenezini ve tedavisini anlamaya odaklanmaktadır. Protokolümüz, 60. güne kadar retina üretiminin başarı oranını artırmak için vaskülasyon ve füzyon olasılığını önemli ölçüde azaltan bir nöral retina oluşturmak için optimize edilmiş bir indüksiyon tekniğini açıklamaktadır. Modifiye yöntem, ilaç taraması ve hücre tedavisi için daha iyi bir hastalık modeli olduğunu kanıtlayabilen nöral retina oluşturmada daha basit ve daha verimlidir.Gelecekte, retinal organoid modelimizi kullanarak fizikokimyasal faktörlerin retina gelişimi ve altta yatan mekanizma üzerindeki etkilerini araştırmayı amaçlıyoruz.

generating-neural-retina-from-human-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells

890 Görüntüleme.  Medical School of Chinese PLA. Grubumuz, insan retina hastalıklarının patogenezini ve tedavisini anlamaya odaklanmaktadır. Protokolümüz, 60. güne kadar retina üretiminin başarı oranını artırmak için vaskülasyon ve füzyon olasılığını önemli ölçüde azaltan bir nöral retina oluşturmak için optimize edilmiş bir indüksiyon tekniğini açıklamaktadır. Modifiye yöntem, ilaç taraması ve hücre tedavisi için daha iyi bir hastalık modeli olduğunu kanıtlayabilen nöral retina oluşturmada daha b...

Video: Yazar Spotlight: Hastalık Modellemesi için Basit ve Verimli Nöral Retina Organoid Üretimi

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of retinopathy. Unfortunately, ethical barriers hinder the collection of evidence from humans. Recently, numerous studies have shown that human pluripotent stem cells (PSCs) can be differentiated into retinal organoids (ROs) using different induction protocols, which have enormous potential in retinopathy for disease modeling, drug screening, and stem cell-based therapies. This study describes an optimized induction protocol to generate neural retina (NR) that significantly reduces the probability of vesiculation and fusion, increasing the success rate of production until day 60. Based on the ability of PSCs to self-reorganize after dissociation, combined with certain complementary factors, this new method can specifically drive NR differentiation. Furthermore, the approach is uncomplicated, cost-effective, exhibits notable repeatability and efficiency, presents encouraging prospects for personalized models of retinal diseases, and supplies a plentiful cell reservoir for applications such as cell therapy, drug screening, and gene therapy testing.

The present protocol describes an optimized 3D neural retina induction system that reduces the adhesion and fusion of retinal organoids with high repeatability and efficiency.