まず、安楽死させたラットの腸間膜リンパ管を分離してカニューレ挿入します。滲出室内のリンパ管を加圧し、リンパ管が平衡化して安定した自発収縮を発症できるようにします。次に、リンパ管をフラ-2-アセトキシメチルエステルとプルロン酸と暗所で30分間インキュベートします。
インキュベーション後、陰圧真空で全槽容量を空にし、温度が一致した試薬フリーの生理的塩溶液を3回補充します。次に、リンパ管を暗闇でさらに15分間インキュベートして、余分なインジケーターを取り除き、脱エステル化を可能にします。チャンバーを、LEDライト、20XS蛍光対物レンズ、セルフフレーミングアダプター、および15ヘルツ蛍光捕捉用のカメラを備えた倒立蛍光顕微鏡に移します。
イメージングソフトウェアを搭載したコンピューターに顕微鏡を接続して、蛍光を記録し、エッジ検出を行います。LED光源と蛍光システムインターフェースをアクティブにします。次に、ソフトウェアIonWizardを起動します。
[ファイル] タブで、[新規] オプションを選択します。次に、[収集] タブに移動し、[実験] を選択します。目的の実験テンプレートを読み込み、「OK」をクリックします。画面下部の「開始」ボタンをクリックして、実験を開始します。
次に、画面上のトレースを調整して、容器の直径、分子、340 信号、分母、380 信号、および比率を降順で表示します。トレースの視覚化を改善するために Y 軸のスケールを変更するには、[トレース] に移動し、[自動制限] がオフになっていることを確認し、[ユーザー制限の編集] を選択します。調整するパラメーターを選択し、軸の最小値と最大値を入力してから、[OK] を選択して確定します。
エッジ検出ソフトを使用して、リンパ管壁が暗い線で見えるように照明を調整します。脂肪や破片のない関心領域または ROI を選択し、この ROI を動かさないようにします。血管壁の端が収縮サイクル全体を通じて検出されるようにしきい値を設定します。
光電子増倍管を作動させた後、LEDイルミネーターを使用して、340ナノメートルと380ナノメートルの波長を交互に使用し、50ミリ秒の露光でFura-2を励起します。イメージングフィールド全体にわたって510ナノメートルと15ヘルツの発光スペクトルをキャプチャします。シグナルとバックグラウンドの比率を測定するには、まず、視野の中央にリンパ管がある状態で340および380の蛍光を取得します。
次に、背景をキャプチャするための容器なしで、視野をバスの端に移動します。その後、浴液を温度が一致した試薬フリーの生理食用塩溶液と交換し、過剰なFura-2インジケーターを除去します。ベースラインのFura-2蛍光シグナルと自発的な収縮を約30分間記録します。
次に、ニフェジピンの累積濃度応答を記録し、各薬物濃度のバックグラウンド測定値を取得します。各実験の最後に、温度が一致したカルシウムを含まない生理学的塩溶液でリンパ管を洗浄し、カルシウムイオンの非存在下での最小Fura-2蛍光シグナルとリンパ管の最大直径を取得します。浴液を10ミリモルのカルシウムイオンとイオノマイシンを含む温度一致した生理的塩溶液と交換して、カルシウムイオンを飽和させる条件下で最大のFura-2蛍光シグナルとリンパ管の最小直径を得る。
カルシウムスパイク振幅、ベースラインカルシウム、およびピークカルシウムなどのパラメータは、灌流チャンバーへのニフェジピンの漸進的な添加により、濃度依存的な減少を示しました。同時に、収縮、振幅、計算された流量などの収縮パラメータも段階的に減少することを示しました。マンハッタンプロットは、間隔、収縮時間、リラクゼーション時間などのリズム性の測定値に対する個々のリンパ管の反応を示しました。
