この作品は、健康補助2R01 GM53132とP50 GM071558の国立研究所によってサポートされていました。

1。カルシウムインジケータ付きのロードセル<ol><li> 35ミリメートルのガラスボトムマテック皿のプレートの細胞（またはチャンバーを表示し、他のガラスの底）。 </li><li> 10μg/mlラミニンと前室1泊目の主要な心筋細胞のコートを使用している場合。 KBのバッファ内のプレート心筋細胞（成犬、新生児ラット、または他の生物から単離された）（K -逆転のタイロード緩衝液HEPESの35ミリモル/ L、KClの140ミリモル/ L、KHCO 3の8ミリモル/ L、2ミリモル/ MgCl 2のL、および0.4 KH 2 PO 4、pH7.5のミリモル/ L）、37、15％ウシ胎児血清および1％streptamycinおよび0.5％ゲンタマイシンとインキュベートを添加したM199培地に徐々にそれを変える℃、5％のC CO 2。 </li><li>または室温で30-45分のための任意のカルシウム指示薬、カルシウム緑AM（Molecular Probes社1から5μM）で細胞をインキュベートします。色素の退色を避けるためにアルミ箔で皿に蓋をする。 </li><li> 14mmのEGTAとLeibovitz15培地で細胞を3回洗浄する（低カルシウムで実験を行う場合）または任意の適切な表示媒体。 </li><li> Leibovitz15培地containing14mM EGTAで別の30〜45分インキュベートする。 </li><li>阻害剤の効果をテストする場合（すなわち10μMU73122 PLC阻害剤）2回目のインキュベーションの間にそれらを追加します。 </li></ol> 2。マイクロインジェクション、細胞<ol><li> 24用ガラスボトムマテックの皿（または他の表示チャンバー）の培養心筋細胞。 </li><li> 14mmのEGTA（カルシウムを含まない培地に注入する必要が心筋細胞、他の細胞を含む培地中カルシウムに注入することができる）とフェノールフリーリーボビッツ- 15培養液を交換する。 </li><li>マイクロインジェクションの溶液を準備-私たちの研究は、Gαqを排除ペプチドを使用する-カベオラの相互作用。ボリュームの唯一の少量の細胞（〜フロリダ州）に注入されるので、合理的に集中して株式を使用する必要があることに留意してください。我々は、カルシウムを含まない培地にDAPIでこのペプチドの、2μM、Cav3 -足場を、使用。 DAPIはブルーレイです。電子染料その染色核とマイクロインジェクションされた細胞の同定が可能になります。 DAPIは、多くのカルシウム指標の蛍光を妨げることはありません。 DAPIの量は可変であり、我々は一般的に（0.5〜2μM）核を可視化するのに十分な使用</li><li>単独で色素トレーサー - DAPIを含むコントロール溶液を用意する。 </li><li> microinjectionsための自己引っ張られたり、市販の針を使用してください。適切な針のパラメータを決定するために色素注入で練習。我々は、異なる細胞が異なる針径とマイクロインジェクションの圧力を必要とするかもしれないことに注意してください。 </li><li> InjectMan NI2は、エッペンドルフからFemtoJetポンプで、例えば、自動マイクロインジェクションシステムを使用してください。 私は 90ヘクトパスカル、および補償圧力P Cから45 hPaのために射出圧力Pを設定します。 0.7噴射時間tを設定する秒必要性として注入のパラメータを再調整してください。 </li><li>倒立顕微鏡（例えばツァイスAxioveにmicroinjectionsを実行するRT 200M）は、長作動距離の位相コントラストの目的（例空気40倍フェーズ2の目的のための）を装備。 </li><li>迅速な方法でできるだけ多くの細胞として注入する。生存細胞を選択するには、位相コントラストを用いて注入された細胞を調べます。 </li></ol> 3。共同免疫蛍光研究<ol><li> PBSで2回細胞を洗浄し、30分間3.7％パラホルムアルデヒドで固定してください。必要に応じて、細胞が固定する前に刺激することができる。 </li><li> PBSで固定された細胞を3回洗浄し、5分間のためにPBSに0.2％NP40でインキュベートする。 </li><li> 1時間のためにPBSを含む4％ヤギ血清（または他の適切な血清）を使用してブロックする。 </li><li> 1時間PBS中の1％ヤギ血清で適切な希釈率で一次抗体で細胞をインキュベートします。 </li><li>このようなアレクサ - フルオロ- 488抗ウサギまたはAlexa - フルオロ- 647希釈した抗マウス二次抗体として蛍光標識二次抗体を加え、続いて150mMのNaCl、25mMのトリス、pH 7.6で10分間細胞を3回洗浄1〜：PBSで1000 1％ヤギ​​血清（二つの異なるタンパク質をプローブするときに一次抗体は異なる種で提起されている必要がありますし、二次は対応する種に対してでなければならないことに注意）。 </li><li> 37℃で1時間のために、TBSで3回洗浄。 </li><li> TBSバッファーまたは別の適切な表示培地で細胞を見る。 </li></ol> 4。高速のカルシウムイメージング<ol><li>レーザー走査型共焦点顕微鏡を（例Fluoview 1000年オリンパス用）を使用してください。 </li><li>高開口数対物レンズを使用してください。 </li><li>買収のパラメータを設定します。カルシウム緑の使用488nmの励起のために、長い515発光フィルターを通過する。 </li><li>ピクセル時間を調整 - 高速カルシウムの測定には2μs/ピクセルに設定します。 </li><li> 0.3μmの - 0.05のピクセルサイズを達成するために画像のズームを設定します。 </li><li>特定の地域における選択肢のセルから行を選択します。 </li><li>時間のコントローラ]ウィンドウで時間枠のを希望さに少なくとも1500のスキャン（時間の取得を選択します。レスポンス - 1.3ミリ秒/ライン2秒をもたらすでしょう）。 </li><li>レコードの背景には、刺激前に読んで。 </li><li> 5μMのカルバコールで細胞を刺激し、すぐに録画データを起動します。 Leibovitz15に10μMのカルバコールを準備し、皿に軽く1 mLを加える、Leibovitz15培地1mLに細胞を保持する</li></ol> 5。データ分析<ol><li>記録された画像から各ピクセルの強度を抽出する。 Fluoview 1000年のソフトウェアを使用してテーブルとして強度のデータを保存します。 </li><li> SigmaPlotのまたは類似のデータ解析プログラムとビンにインポートする強度のデータ〜90から40ビンへのデータ。実験と電子ノイズを制御するために比較する。 </li></ol> 6。代表的な結果： 我々は、マルチラインのレーザー励起と40x/1.2 NAアポクロマートの水浸対物レンズを搭載したレーザー走査型共焦点顕微鏡LSM510のセル（ツァイス、イエナ、ドイツ）を撮像。図。我々はdistributioを表示する1（ 赤 ）これらの細胞9の主要な構造カベオラ蛋白質であるカベオリン-3に対する抗体を固定し、染色された犬の成人の心室の心筋細胞におけるカベオラのn。カベオリン-3はAlexa - 647とimmunolabelledと彼からの633 - nmの線で励起された：Neレーザー。画像はLP650 nm発光フィルターを用いて記録した。カベオリン-3の分布はAlexa - 488（ 緑 ）で免疫標識したGαqを比較した。アレクサ- 488は、488nmのアルゴンイオンレーザーの線で励起され、画像はBP505 - 530nmの発光フィルターを使用して記録した。これらの共局在の測定では、2つの蛍光体は、マルチトラックの取得を使用して連続的に興奮していた。この手順は、チャネルクロストークを最小限に抑えることができます。共局在のためのデータ解析は、ツァイスLSM510 -メタに付属のAIMソフトウェアを使用して行った。見ることができるように、2つのタンパク質が局在している。 判断する方法カベオリン-3とGαとの間のカップリング<suB&gt; qは我々が40倍目標（UPlanApo、オリンパス、開口数を倒立顕微鏡（IX70、オリンパス）に結合走査型共焦点レーザー顕微鏡システム（Fluoview、オリンパス、東京、日本）のカルシウムイメージング研究を実施、カルシウムシグナルに影響を与えるこれらの測定ものの1.3）また、上記のツァイスのシステム上で実行することができます。これらの測定では、細胞を、Ca 2 +グリーンを充填した。我々は488nmのアルゴンイオンレーザーで色素を励起し、LP515エミッションフィルタを介して画像を収集した。画像のフレームは500ミリ秒間隔で収集した。各ピクセルの強度値は、オリンパスソフトウェアとImageJを用いて抽出した。ラインスキャンモードは、より高速のCa 2 +過渡電流とCa 2 +スパークの定量的な分析のために使用された。本研究で使用されるピクセルサイズは0.1〜0.3μmであった。ラインスキャンレートは、行ごとにマイクロ秒の数百程度であった。図。 2我々は、Ca 2のラインスキャン+グリーンロードされた心筋細胞ピクセルdを示すうまく時間が2μsで、ライン時間は142μsで。画像は1200行で構成されています。 スキャンの各行は、Ca 2の強度の変動に対応する+グリーンは、142μsの範囲で撮影した71点で構成される、とカルシウム応答の読み出し急速として使用することができます。例えば、図中3私たちは強化5μMのカルバコールの追加（ 一番下 ）の前（ 上 ）と後などのCa 2によって測定された個々の心筋細胞の単一行、+秒単位の時間の関数としてのグリーン蛍光強度のCa 2 +活性を示すGαqを -PLCβ活動を通じて、細胞内Ca 2 +のレベル。多くの行が平均化されると、カルバコール刺激はCa 2の約​​1.8倍に増加+緑の強度を生成します。実験条件の変化（室温、レーザパワー、検出器応答、色素分布、等）のために、この増加は、個々に表示されないことがありますラインスキャン。強度値（y軸の値）が類似しているにもかかわらず、それは底でカルバコール刺激によるプロットが刺激前に見た狭い変動のピークよりも、より持続的なカルシウムのレベルに対応するはるかに広いピークを、持っていることは明らかである。強度のこの拡大と相対的上昇は小さく、遅い振動をあいまいにしています。私たちの目標は、よりよいカルシウムの変動のこれらの異なる見かけの種類を区別することです。 これらの高速なカルシウム変動の別の例を図に示します。 4。上のグラフは、刺激された心室の心筋細胞（赤）と3ライントレースの平均値が黒で表示されているために生のラインのデータを示しています。これらのカルシウムの変動がGαqによって媒介されている範囲を決定するために- caveoline3相互作用を、我々は、カベオリン-3を不安定化ペプチドマイクロインジェクション-長いのCa 2を除去する Gαqの相互作用（すなわちCav3ペプチド）+現在、これらのデータを青色で表示されます（我々は二つのトレースがより識別できるようにCav3ペプチドの強度から500を減算することに注意してください）​​。 私たちは、ExcelファイルSigmaPlotのに（Jandel社）から生データの列をインポートおよびヒストグラム解析を行った。この分析では、イベントの数は、ヒストグラムを生成するボックスの数と同じ数（ビン）に分類されます。ビンの幅は、時間の等しい間隔を表します。強度が異なる時に挿入されている特定のビンの高さは、強度が特定の時間枠で発生する回数を表すように結合する。分析のこのタイプは、同じ走査速度でデータを収集するに依存するため、多くのトレースを同時に分析することができます。さらに、この分析では、レーザパワー、等染料レベルの違いに敏感ではなく、電子とバックグラウンドノイズは非常に速い時間スケールで発生し、最初の1〜2ビンで見られている。 対応するhistogra図の生データのミリ秒。 4ページの一番下に表示されます。コントロール細胞のヒストグラムは、赤線で示されている広範な時間の分布に対応するビンの数が多い、（ラインが目を導くとは、モデルが仮定されていないためです）に分散しています。対照的に、Gαqを - Cav3の相互作用がペプチドによって破壊された細胞の応答のためのビンは、ペプチドの存在は長い期間のフラックスを除去することを示唆狭いビンのディストリビューションに限定されています。 Gαqを - Cav3を妨害していない対照ペプチドのマイクロインジェクションは、非注入された細胞8と同様のヒストグラムを生成します。 図。私たちは大人犬の心室心筋細胞（ 左 ）とカベオラを（ 右 ）がない、新鮮な、刺激されていないラット新生児心筋細胞でのCa 2の速い強度変動+グリーンを比較する5。ここで、3分間にわたって強度の対応するヒストグラムは、選別された<html> 35で遅いカルシウムのイベントを表示する。新生児の心筋細胞はより構造化されたベースラインが大人の細胞に見られるている間に遅いのCa 2 +活性の欠如を示す平坦なベースラインでの高速な変動を表示することに注意してください。これらの違いは、最も簡単にヒストグラムで見られている。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig1.jpg" /> 図1。Gαqの分布を示す犬の成人の心室心筋細胞の画像はAlexa - 488は488nmのアルゴンイオンレーザーの線で励起され、画像がBP505 - 530nmの発光フィルターを用いて記録した。アレクサ- 488で免疫標識NeレーザーとLP650 nmの放射フィルターを使用して、記録：右上のカベオリン-3彼からの633 - nmの線で励起する、アレクサ- 647で免疫標識の局在を見ると同じイメージです。共局在がオレンジ色に見られているマージされた画像は、右に展開したイメージを左下にあります。 <html> &quot;pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig2.jpg" /> 図2：生活犬成人の心室心筋細胞のカルシウムイメージングは、Ca 2 +グリーンでロード。画像は、488nmのアルゴンイオンレーザーとLP515発光フィルターを使用して40倍を目的とした走査型共焦点レーザ顕微鏡システムで撮影されました。画像は1200行で構成され、ピクセルの滞留時間は2μsで、ピクセルサイズは0.1μmであった。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig3.jpg" /> 図3。生きた犬成人の心室のCa 2 +グリーンでロードされ、前述のように撮像心筋細胞、および下位5μMのカルバコールを添加することによって刺激された同細胞からのライントレースのTOP強度変動。 <html> / 3505fig4.jpg&quot;/&gt; 図4のCa 2でロードの生活犬の成人の心室の心筋細胞からライントレースの例TOP 3トレースの平均値が黒い線で示され、そしてマイクロインジェクションした細胞と比較して180ミリ秒を引き継いだ+緑（赤）ペプチドとその3つのトレースの平均が黒になっているGαQ -カベオリン3のアソシエーション（赤）を破壊する。我々は、表示目的のためにデータの下位集合から400強の数を減算することに注意してください。下のパネルは、テキストで説明されているようにビンのデータの対応するヒストグラムであり、ビンの数は任意であり、ビンの数は（または単にカウント）その特定ビンの強度の合計額に相当する場所。我々は、コントロール（左）とペプチド（右）のヒストグラムで描画線の赤と青の線はデータを簡単に識別できるとの比較を可能にするものとしないモデルが仮定されていないことに注意してください。 files/ftp_upload/3505/3505fig5.jpg&quot;/&gt; カベオラ（ 右 ）とそれに対応するヒストグラムを欠いている図5。強度のCa 2の変動+大人犬の心室の心筋細胞におけるグリーン（ 左 ）と新鮮な、刺激ラット新生児心筋細胞を以下に示します。

<ol>
	<li>Cheng, H., Lederer, M. R., Lederer, W. J., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sparks+and+[Ca2+]i+waves+in+cardiac+myocytes.">Calcium sparks and [Ca2+]i waves in cardiac myocytes.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 270, 148-159 (1996).</li><li>Cheng, H., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Sparks.">Calcium Sparks.</a> Physiol. Rev. 88, 1491-1545 (2008).</li><li>Rebecchi, M. J., Pentyala, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+control+of+phosphoinositide-specific+phospholipase.">Structure, function, and control of phosphoinositide-specific phospholipase.</a> C. Physiol.Rev. 80, 1291-1335 (2000).</li><li>Suh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+phosphoinositide-specific+phospholipase+C+isozymes.">Multiple roles of phosphoinositide-specific phospholipase C isozymes.</a> BMB reports. 41, 415-434 (2008).</li><li>Schlegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crowded+little+caves:+structure+and+function+of+caveolae.">Crowded little caves: structure and function of caveolae.</a> Cell. Signal. 10, 457-463 (1998).</li><li>Anderson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+caveolae+membrane+system.">The caveolae membrane system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 199-225 (1998).</li><li>Sengupta, P., Philip, F., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolin-1+alters+Ca2++signal+duration+through+specific+interaction+with+the+G{alpha}q+family+of+G+proteins.">Caveolin-1 alters Ca2+ signal duration through specific interaction with the G{alpha}q family of G proteins.</a> J. Cell. Sci. 121, 1363-1372 (2008).</li><li>Guo, Y., Golebiewska, U., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Ca2++Activity+in+Cardiomyocytes+through+Caveolae-G[alpha]q+Interactions.">Modulation of Ca2+ Activity in Cardiomyocytes through Caveolae-G[alpha]q Interactions.</a> Biophysical. Journal. 100, 1599-1607 (1016).</li><li>Rybin, V. O., Xu, X., Lisanti, M. P., Steinberg, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+targeting+of+beta+-adrenergic+receptor+subtypes+and+adenylyl+cyclase+to+cardiomyocyte+caveolae.+A+mechanism+to+functionally+regulate+the+cAMP+signaling+pathway.">Differential targeting of beta -adrenergic receptor subtypes and adenylyl cyclase to cardiomyocyte caveolae. A mechanism to functionally regulate the cAMP signaling pathway.</a> J. Biol. Chem. 275, 41447-41457 (2000).</li><li>Tovey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+puffs+are+generic+InsP3-activated+elementary+calcium+signals+and+are+downregulated+by+prolonged+hormonal+stimulation+to+inhibit+cellular+calcium+responses.">Calcium puffs are generic InsP3-activated elementary calcium signals and are downregulated by prolonged hormonal stimulation to inhibit cellular calcium responses.</a> J. Cell. Sci. 114, 3979-3989 (2001).</li><li>Lohn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ignition+of+Calcium+Sparks+in+Arterial+and+Cardiac+Muscle+Through+Caveolae.">Ignition of Calcium Sparks in Arterial and Cardiac Muscle Through Caveolae.</a> Circ. Res. 87, 1034-1039 (2000).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は生きている心筋細胞の急激なカルシウムシグナルを表示して分離する手法を開発した。これらの測定の実験条件は、以前に他のセルのシステム10と同様に心筋細胞11に印加されているが、ヒストグラムとビンの分析の使用は、多くのCa 2 +のイベントが取得されるデータを可能にします。より高速なイベントは、容易にそれらの根拠となるメカニズムを理解するた...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes

心筋細胞は、機能の1,2を最適化するために協働する期間の異なる複数のCa 2 +フラックスを持っている。のCa 2の変化は、細胞外の物質への応答で+活動は主にアセチルコリン3,4のような薬剤によって刺激され、原形質膜に局在化ホスホリパーゼCβ-Gαqの経路によって調節されている。我々は最近、カベオラ5,6と呼ばれる細胞膜蛋白質のドメインが活性化Gαqは 7を捕捉できることを見出した。この巻き込みは、Gαqの活性化状態を安定させ、心筋細胞や他の細胞型8の長期のCa 2 +シグナルの結果の効果があります。我々は生きている心筋細胞内の高速規模で動的なカルシウム応答を測定することにより、この驚くべき結果が明らかに。簡単に言えば、細胞は蛍光灯のCa 2 +インジケーターがロードされます。我々の研究では、我々は、Ca 2 +グリーン（Invitrogen社、で用いカルシウムイオンの結合により蛍光発光強度の増加を示すC.）。蛍光強度は、共焦点顕微鏡を走査型レーザーのラインスキャンモードを使用するために記録されます。このメソッドは、マイクロ秒の時間スケールでの時間トレースの数百を生成する、選択されたラインに沿ってピクセルの蛍光強度の経時変化を迅速に取得することができます。これらの非常に高速のトレースは分析のためにExcelにしてから、SigmaPlotのに転送され、電子ノイズ、フリー染料、および他のコントロールのために取得したトレースと比較されます。 Ca 2 +は別のフラックス速度の応答を分析するために、我々は時間とのピクセルの輝度をビンというのヒストグラム解析を行った。ビニングは、スキャンの500トレース以上のグループに私たちを可能にし、一つのプロット上に空間的かつ時間的にコンパイルされた結果を可視化する。従って、スキャンは、別のピーク位置やノイズによるオーバーレイされるときに識別が困難な、低速のCa 2 +波は容易に見ることができます。ビニングヒストグラム。測定の時間スケールで非常に高速なフラックスが長いのに対し、非常に短い時間ビンの強度の狭い分布を示すのCa 2 +波はより長い時間ビン以上の広い分布を持つビンのデータを示しています。これらの異なる時間の分布は、私達は、Ca 2のタイミング+細胞のフラックスを分析する、そして様々な細胞現象に与える影響を判断することができます。

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Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

我々は、レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いた生細胞における遅いフラックスから（マイクロ秒）急激なカルシウムのイベントを分離する方法を提示する。方法は、細胞に数百画素のラインスキャンを記録することによって、カルシウムの指標の蛍光強度の変動を測定する。ヒストグラム解析により、異なるカルシウムフラックスの時間スケールを分離することができます。

心筋細胞における高速カルシウムフラックスの測定

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.1K ビュー.  Queensborough Community College. 我々は、レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いた生細胞における遅いフラックスから（マイクロ秒）急激なカルシウムのイベントを分離する方法を提示する。方法は、細胞に数百画素のラインスキャンを記録することによって、カルシウムの指標の蛍光強度の変動を測定する。ヒストグラム解析により、異なるカルシウムフラックスの時間スケールを分離?...

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Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

アストロサイトの細胞膜とグローバル細胞内カルシウム動態の近くの測定

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

生物学

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

マウス心房と心室の心筋細胞における分離とKvチャンネル録音

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

新生仔マウス心筋細胞の単離および培養

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

ハイドラ内グルタチオンによって誘発される摂食応答を測定する

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

培養HL-1心房筋細胞単層の電圧とカルシウムデュアルチャネル光学マッピング

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

イオン選択自己参照微小電極法を用いた細胞外イオンフラックスの測定

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

C.エレガンスにおけるRANペプチド毒性の測定

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis of the screen is to generate a mutant population that can be screened with a phenotype of interest. EMS (ethyl methane sulfonate) is a commonly used alkylating agent for inducing random mutation in a classical forward genetic screen to identify multiple genes involved in any given process. Cytosolic calcium (Ca2+) elevation is a key early signaling pathway that is activated upon stress perception. However the identity of receptors, channels, pumps and transporters of Ca2+ is still elusive in many study systems. Aequorin is a cellular calcium reporter protein isolated from Aequorea victoria and stably expressed in Arabidopsis. Exploiting this, we designed a forward genetic screen in which we EMS-mutagenized the aequorin transgenic. The seeds from the mutant plants were collected (M1) and screening for the phenotype of interest was carried out in the segregating (M2) population. Using a 96-well high-throughput Ca2+ measurement protocol, several novel mutants can be identified that have a varying calcium response and are measured in real time. The mutants with the phenotype of interest are rescued and propagated till a homozygous mutant plant population is obtained. This protocol provides a method for forward genetic screens in Ca2+ reporter background and identify novel Ca2+ regulated targets.

A forward genetic screen based on Ca2+ elevation as a read-out leads to identification of genetic components involved in calcium dependent signaling pathways in plants.

トランスジェニックカルシウムレポーターエークオリンを用いたニューシグナル伝達の新しい標的の同定を用いた遺伝子スクリーンの前方

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.