実験室での研究は、フリッツ·ベンダー財団、ミュンヘン、ドイツ（TD）と（W.-KLへ）ヴィッテン/ヘルデッケ内部研究助成金の大学によって資金を供給されている。私たちは、役立つ提案のために教授博士博士フランクThévenod（生理学、病態学·毒物研究所、ウィッテン/ヘルデッケ大学）に感謝したいと思います。

試薬およびソリューションの調製<ol><li>修正されたハンクス平衡塩溶液（HBSS）の準備（単位：mm：136.9のNaCl、5.37のKCl、0.34のNa 2 HPO 4、0.44 KH 2 PO 4、4.17のNaHCO 3、pHは7.2、無フェノールレッド）。 4℃で保存。 </li><li> 1.5 M CaCl 2および2 M 4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）（pH7.2）中で蒸留水を用いてストック溶液を作る。 </li><li>プロベネシドの250 mMストック溶液を調製する。遊離酸の形のために（多くの場合、水不溶性と呼ばれる）、1 N NaOH中プロベネシド粉末を溶解し、蒸留水で最終容量の3/4充填し、ゆっくりと1 N HClでpH7.4に滴定する。 4℃で保存。 </li><li> 1mMのストック濃度を、無水ジメチルスルホキシド（DMSO）中の蛍光膜透過性カルシウム結合色素を溶解する。暗闇の中で-20℃で保存。 </li><li>各実験の前に、新鮮にプロベネシド含有Hを準備1.5のCaCl 2、10mMのHEPES、pH7.2で、5％ウシ胎児血清、2mMのプロベネシド、および5.55 mMグルコース（最終濃度）で修飾されたHBSSを組み合わせることにより、BSS束（PHF）バッファ。 37℃まで暖かい。 </li></ol> 2.細胞培養<ol><li>標準培養培地中の6ウェルプレートまたは35ミリメートル皿のウェル当たりプレート2.5×10 5腎臓近位尿細管細胞（WKPT-0293 Cl.2）とは、約70％のコンフルエンシーに達した2日間成長。 </li></ol> 3.カルシウム色素負荷<ol><li>各ウェルまたはディッシュは、5％ウシ胎児血清、4μMの細胞透過性カルシウム結合色素および2mMのプロベネシドを含む1mlの培地を混合する。 </li><li>各ウェル内の1mLのローディング色素の混合物と培地を交換し、5％CO 2の加湿インキュベーター中で30分間37℃でインキュベートする。蛍光指示薬の退色を防止するためにアルミホイルでプレートをカバーする。 </li></ol>のCe 4.準備フローサイトメトリー用LLS <ol><li> 37℃の温かい0.05％トリプシン - エチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液を調製した。 </li><li>各ウェルから吸引し、カルシウムローディング色素溶液およびウェルの壁に沿って1ミリリットルのトリプシンを加える。 </li><li>すべての細胞が剥離されるまで37℃でインキュベートする。 </li><li> 1分間10,000gで微量遠心分離することにより、1.5mlチューブ、ペレットへの転送細胞。 </li><li>慎重にペレットを乱すことなく、上清を吸引除去する。 </li><li>ピペッティングにより1ミリリットルのPHFバッファと再懸濁を追加することで細胞を洗浄。 </li><li> 1分間、10,000gで遠心分離して細胞をペレット。 </li><li>繰り返して4.6を繰​​り返します。 4.7。さらに2回。 </li><li> 500μlのPHFバッファーの最終体積で細胞を再懸濁し、1時間以内に実験用の細胞を使用しています。 </li><li>オプション：細胞濃度を決定するために、細胞をカウントし、5×10 4個の使用-測定あたり1×10 5細胞。 </li></ol> 5.フローのCytオメーターのセットアップ<ol><li>フローサイトメーターを開始流体工学引き出しを開いて、シース流体タンクの空気圧を増加させるために、ベントバルブトグルスイッチを入れる。 </li><li> 「プライム」インナーチューブとフローチャンバー内から潜在的に存在する気泡を除去するための器具。 </li><li>フローサイトメトリーソフトウェアでは、オープン2ドットプロットウィンドウ。 <ol><li>最初のドットプロットは、前方それぞれそのサイズとその粒度、通る試料内の細胞の品質を制御するために、Yパラメータ用のXパラメータと側方散乱光（SSC）のための散乱光（FSC）が必要です。 </li><li>第2のドットプロットは、カルシウム結合色素の蛍光強度を測定する。リニアスケール上のXパラメータに秒単位で対数スケールと時間を使って、Yパラメータに適切な蛍光検出チャンネルを選択します。 </li></ol></li><li> 「高」に流量を設定。 </li></ol> 6.フローサイトメトリーMeasurement <ol><li> RTで測定を行う。サンプルチューブ（11.5×75 mm）のフローサイトメトリーでは、480μlのPHFバッファーを追加します。 </li><li>混合する20μlの細胞懸濁液と簡単に渦を追加します。 </li><li>側にチューブ支持アームを移動し、緊密なシールが形成されるまで試料注入管を介してサンプルチューブを配置します。元の中心の位置に管支持アームを返します。 </li><li>試料の平均蛍光強度は、少なくとも約10 2、y軸上になるように蛍光チャネルを調整することにより、測定を最適化する。保存し、その後の実験のために使用します。 </li><li>実験を開始するには、繰り返し6.3に6.1を繰り返します。 </li><li> 50秒間録音するベースライン蛍光。 </li><li>簡単に追加、関心、渦の化合物をサンプルチューブを取り外し、試料注入管に戻り、測定を一時停止します。このステップでは、15秒以上かかるべきではありません。 </li><li>測定を再開し、204.8秒の合計継続。 </li><li>カルシウムのiを使用してくださいonophoreなどのイオノマイシン（10μM）、エチレングリコール四酢酸（EGTA）などのカルシウムキレート剤、のMnCl 2、のCoCl 2（2mM）を、それぞれ陽性および陰性対照のため。 </li></ol> 7.データ解析<ol><li>そのようなWinMDI（フローサイトメトリー用のWindowsマルチドキュメントインターフェイス）、スクリップス研究所、フローサイトメトリーコアファシリティでジョー·トロッターが開発した無料のソフトウェアパッケージとして、オフライン分析のための専用のフローサイトメトリーソフトウェアを使用してデータを分析します。 </li><li> SSCおよびFSCパラメータを持つドットプロットを開きます。 </li><li>データ分析から左下隅（ 図1）で見つかった死んだ細胞や細胞破片を排除するために「リージョン」ツール（画像上で右クリック）を使用して、分析のための細胞の地域を選択します。 </li><li>象限分析（ 図2） <ol><li> y軸上のx軸、蛍光強度の時刻との密度プロットを開く。すべてのイベントを使用してください。 </li><li>私達7.3と同様にゲート領域を電子。 </li><li> 「クアドラント」ツールを使用してデータを定量化する。 </li><li>垂直線は、化合物添加時に配置され、水平ライン対照におけるベースライン蛍光の中央に配置されるように、象限セパレータを調整する。象限セパレータの位置決めはすべてのサンプルで同じであることを確認してください。 </li><li>各象限における細胞の割合は、各コーナー（ 図2）に表示される。サンプル間の右上の象限（UR）を比較。 </li></ol></li><li>ヒストグラム解析（ 図3） <ol><li> x軸とy軸上のイベントでの蛍光強度ヒストグラムウィンドウ内の制御データを開く。すべてのイベントを使用してください。 </li><li>絵入り概要については、オーバーレイプロットとして対照区（[ファイル]→[オーバーレイ→[ファイルを開く]→[ファイル]）と比較されるようにテストデータを追加します。 </li><li>定量分析のために、単一のヒストグラムは勝つdowsを使用する必要があります。ゲートステップ7.3から領域R1を使用して、細胞集団。 </li><li>未処理対照では、制御ピークの最小および最大蛍光の中間点から開始して最大蛍光強度で終わる分析するための領域をマークするマーカー機能（「マーカー」）を使用。この領域の細胞の割合を算出する。 </li><li>統計ウィンドウからデータを取得します。分析のための同じマークされた領域を使用して、データファイルを、残りの手順を繰り返します。 </li></ol></li><li>蛍光強度分析（ 図4） <ol><li> y軸上のx軸、蛍光強度の時刻とのドットプロットを開く。すべてのイベントを使用してください。 </li><li> 「カイネモード」と「オーバーレイカイネライン」を有効にします。青い線は平均蛍光強度を表すドットプロットに表示されます。 </li><li>複数の矩形領域を作成することで、相対的なカルシウム流入を定量化する。各領域は、AWが必要です「10秒」に相当する「50」、約のIDTH。 15矩形領域を定義。 </li><li>統計ウィンドウから定量化を取得して、スプレッドシートにコピーします。 </li><li>解析のためのyの平均データを使用しています。 20〜50秒に相当する、R6にR2の平均を計算します。これは、ベースライン値である。 </li><li>カルシウム流入分析（発症、持続時間と強度に依存する）のための適切な時間間隔を選択します。 </li><li> 100％に設定されている化合物の添加の前に、蛍光シグナルであり、平均ベースライン値からの相対間隔をこの時間内に、各領域からのカルシウムシグナルを計算する。地域の平均と標準偏差を決定する化合物の添加を投稿。これは、化合物によって誘発される平均カルシウムシグナルである。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

カルシウムは、セカンドメッセンジャーシグナル伝達分子として、また、ERおよびミトコンドリアの間で通信するための手段として、複数の細胞プロセスにおいて重要な事象である。自由な細胞質カルシウム濃度の変化を測定する能力は、細胞生物学のすべての領域に適用することができる有用な技術である。細胞質ゾルのカルシウムシグナルを検出するための様々な方法がある。古典的に?...

カルシウムは、細胞の生理学的および病態生理学的信号1の送信を担当する重要なセカンドメッセンジャーである。細胞質カルシウム濃度は、カルシウムポンプとカルシウム交換体の活性を介して低く保たれている。筋小胞体/小胞体カルシウムATPアーゼ（SERCA）のATP依存様式で両方の、原形質膜カルシウムATPアーゼ（PMCA）は、細胞外区画へのカルシウムを押し出す一方で「ポンプリーク」システムの一部として、小胞体（ER）カルシウムストアを補充2。そのようなホルモンや神経伝達物質などの生理的メッセンジャーは、Gタンパク質共役受容体、ジアシルグリセロールおよびイノシトール三リン酸（IP3）3を生成するために、原形質膜にホスファチジルイノシトール4,5-ビスリ ​​ン酸（PIP2）を加水分解するホスホリパーゼCの活性化を介してそれらの信号を送信する。ジアシルグリセロールは、原形質膜に残っている間、IP3は、細胞質ゾル中に拡散し、IP3受容体に結合するER膜とカルシウムで見られるリガンドカルシウムチャネルを活性化する複数（IP3Rs）は、細胞質カルシウム濃度の増加は4で最高潮に達するER腔ストアから放出される。細胞質ゾルに到達するカルシウムのための代替経路は、原形質膜に存在するカルシウムチャンネルと交換によるものである。これら二つの区画間のクロストークが記載されている：カルシウム誘導性カルシウム外カルシウムがER店5からのカルシウム放出を誘導放出（CICR）、およびストアはSTIMによって感知されるERストアを空にするカルシウム流入（SOCE）を操作して往来の開口を引き起こす原形質膜カルシウムチャネルは、ER店舗6の補充を促進する。 病態生理学的条件下では、細胞のカルシウム応答は、生理的刺激物質1の非存在下での脱制御および細胞質のカルシウムが増加する。カルシウム応答は、多くの方法で影響を受ける可能性がある：カルシウム長期信号、細胞質ゾルからのカルシウム除去、カルシウム貯蔵またはカルシウムの局所的変化の枯渇を遅らせた。さらに、ミトコンドリアは、バッファリングで中心的な役割を引き受けるとカルシウム7をリリース。延長および/または過最大細胞質カルシウムの増加は、細胞死に至る。実際に、カルシウムがより頻繁な細胞の病態生理学的応答に関与する主な細胞死と関連しているような神経変性疾患、心臓病、癌、骨疾患および腎疾患などの疾患の幅広い、における重要な事象ではないよりもおよび臓器または組織機能8-10の損失または変更。また、カルシウムシグナルの摂動は、細胞の適応及び細胞機能および応答の変化に関連している。 伝統的には、カルシウムシグナルを細胞透過性アセトキシメチル（AM）エステルの形で細胞内にロードされた負に帯電した蛍光カルシウム指示薬を用いて測定される。かつて携帯esterasにより開裂ES、蛍光指示薬は、細胞内コンパートメント内に残るとカルシウムが結合した時に蛍光強度の増加。最もよく知られており、カルシウム指示薬を使用レシオメトリックのFura-2ロジャーツィンと同僚11によって開発されています。カルシウムに対する異なる親和性カルシウム指示薬は異なるカルシウムプールを監視することを可能にする。検出方法は、生細胞イメージング、蛍光マイクロプレートリーダー、フローサイトメトリーが含まれる。 （通常、数分〜数秒以内）カルシウムシグナルの比較的速い反応速度は、カルシウムシグナルの特性に関する大部分の情報を得るための最善の方法を画像化する生細胞を作る。別に（ミリ秒以内）カルシウムシグナルの速い反応速度から、生細胞イメージングは、単一のセル12内のカルシウムシグナル伝達の細胞内区画化を研究するための優れた方法である。絶対的なカルシウム濃度は、カルシウムのindの最小および最大蛍光を測定することによって計算することができるGrynkiewicz ら 11によって記載されているように、それぞれ、カルシウムキレート剤を添加して細胞を透過性にすることによってicator。 カルシウムシグナルを測定するフローサイトメトリーの使用は、最初の機会は、膜の完全性および分離細胞集団の、単一波長の開発と組み合わせ懸濁液中の細胞の必要性などの複数のパラメータを測定するための免疫学的細胞中で1980年代に開発されたカルシウム指標は理想とconvenientdetection方法13-15たフローサイトメトリーを作った。付着細胞では、生細胞イメージングは​​、カルシウムシグナル伝達、最も重要な動力学に関するほとんどの情報を提供するが、取得するための温度等の蛍光顕微鏡、灌流システム、細胞環境の維持を含む複雑な設定、および特殊な顕微鏡ソフトウェアが必要データを分析する。そのような蛍光マイクロプレートリーダーまたはpharmacolなどの代替方法カルシウムキレート剤の使用によるogical手段は、得られた情報の点で比類のないです。フローサイトメトリーの研究の大部分においてのみ、エンドポイントの測定が行われ、より広くも付着細胞における細胞質カルシウムを監視するために使用されるようになっている。最初にはGergely らによって開発された方法を用いて製造した。免疫学的B細胞16に、サンプル集団の個々の細胞の蛍光強度をモニターするリアルタイム動態を用いたフローサイトメトリーによる細胞質ゾルの遊離カルシウム濃度の変化および正常癌上皮細胞で測定されているそして癌は細胞ハイブリッド17幹 。この方法は、さらにカルシウム指示薬18とロードすることが困難であり、付着上皮細胞での使用に適合した。 ここでは、ラット腎臓近位尿細管（WKPT-0293 Cl.2）19のS1セグメントに由来する不死化接着性上皮細胞株を使用して、我々は、最適化を簡略化メートルを記述フローサイトメトリーによる細胞質カルシウム濃度の変化を測定するためのethod。多くの上皮細胞は、アニオン性化合物のための有機トランスポーターの数を有しているので、カルシウム指示薬を用いた細胞のローディングは挑戦であることを証明することができます。カルシウム指示薬、プロベネシド、ペニシリン20の腎排泄を減少させるために開発された当初は原型的有機アニオントランスポーターの阻害剤との流出を防ぐために、インキュベーション培地に同時に印加される。細胞は、カルシウム指示薬をロードするための単層で維持化合物添加直後に検出することができるサスペンションカルシウム信号にされる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="735">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:79px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:321px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-3, AM</td>
			<td style="width:79px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">F-1241&#160;</td>
			<td>Cell permeable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Probenecid</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-8761</td>
			<td>Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:79px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ionomycin</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I9657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thapsigargin</td>
			<td style="width:79px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tunicamycin</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software</td>
			<td style="width:79px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)</td>
			<td style="width:79px;">Joe Trotter, The Scripps Institute</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line</td>
			<td style="width:79px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology &#38; Biophysics, Case 
			Western Reserve University, Cleveland, OH)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cytosolic calcium measurements in renal epithelial cells by flow cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

細胞質カルシウムを増加させるために、2薬理学的化合物は、細胞透過性カルシウム結合色素、フルオ-3-AMを負荷し、腎近位尿細管細胞（WKPT-0293 Cl.2）に適用した。未処理の対照試料は、プロベネシドの存在下でのカルシウム結合色素を負荷し、混合したが、任意の化合物を添加せずに行った。タプシガルギン（TG）は、ERからの漏れにつながると細胞質カルシウムの増加をもたらすSERCAポンプ?...

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Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

カルシウムは、多くの生理学的および病態生理学的なシグナル伝達経路に関与している。生細胞イメージングは​​、特殊な設備を必要とし、時間がかかる可能性がある。懸濁液中に持ち込ま付着上皮細胞における細胞質カルシウムの相対的変化を決定するために、フローサイトメーターを使用して迅速に、簡単な方法を最適化した。

フローサイトメトリーによる腎上皮細胞における細胞質ゾルカルシウム測定

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

cytosolic-calcium-measurements-renal-epithelial-cells-flow

Research

JoVE Journal

Biology

15.2K ビュー.  University of Witten/Herdecke. カルシウムは、多くの生理学的および病態生理学的なシグナル伝達経路に関与している。生細胞イメージングは​​、特殊な設備を必要とし、時間がかかる可能性がある。懸濁液中に持ち込ま付着上皮細胞における細胞質カルシウムの相対的変化を決定するために、フローサイトメーターを使用して迅速に、簡単な方法を最適化した。 

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IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP - FCM：フローサイトメトリーにより検出免疫沈降

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

生物学

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

RNA精製によってクロマチンの単離（チャープ）

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the heart, and improving strategies to accurately model heart disease. The potential of exploiting human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology to generate cardiac muscle &#8220;in a dish&#8221; for these applications continues to generate high enthusiasm. In recent years, the ability to efficiently generate cardiomyogenic cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) has greatly improved, offering us new opportunities to model very early stages of human cardiac development not otherwise accessible. In contrast to many previous methods, the cardiomyocyte differentiation protocol described here does not require cell aggregation or the addition of Activin A or BMP4 and robustly generates cultures of cells that are highly positive for cardiac troponin I and T (TNNI3, TNNT2), iroquois-class homeodomain protein IRX-4 (IRX4), myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform (MLC2v) and myosin regulatory light chain 2, atrial isoform (MLC2a) by day 10 across all human embryonic stem cell (hESC) and hiPSC lines tested to date. Cells can be passaged and maintained for more than 90 days in culture. The strategy is technically simple to implement and cost-effective. Characterization of cardiomyocytes derived from pluripotent cells often includes the analysis of reference markers, both at the mRNA and protein level. For protein analysis, flow cytometry is a powerful analytical tool for assessing quality of cells in culture and determining subpopulation homogeneity. However, technical variation in sample preparation can significantly affect quality of flow cytometry data. Thus, standardization of staining protocols should facilitate comparisons among various differentiation strategies. Accordingly, optimized staining protocols for the analysis of IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, and TNNT2 by flow cytometry are described.

The article describes the detailed methodology to efficiently differentiate human pluripotent stem cells into cardiomyocytes by selectively modulating the Wnt pathway, followed by flow cytometry analysis of reference markers to assess homogeneity and identity of the population.

フローサイトメトリーによる高効率心筋細胞へのヒト多能性幹細胞の分化と特性

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

スペクトラルフローサイトメトリーにより固形組織から単離された細胞懸濁液の分析

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

孤立した塊茎プロトプ ラストのフローサイトメトリーによる表現を測定

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion and the spread of neurodegenerative diseases. The commonly used laboratory strains of the amoeba Dictyostelium discoideum have extremely high fluid uptake rates when grown in nutrient medium, over 90% of which is due to macropinocytosis. In addition, many of the known core components of mammalian macropinocytosis are also present, making it an excellent model system for studying macropinocytosis. Here, the standard technique to measure internalized fluid using fluorescent dextran as a label is adapted to a 96-well plate format, with the samples analyzed by flow cytometry using a high-throughput sampling (HTS) attachment.
Cells are fed non-quenchable fluorescent dextran for a pre-determined length of time, washed by immersion in ice-cold buffer and detached using 5 mM sodium azide, which also stops exocytosis. Cells in each well are then analyzed by flow cytometry. The method can also be adapted to measure membrane uptake and phagocytosis of fluorescent beads or bacteria.
This method was designed to allow measurement of fluid uptake by Dictyostelium in a high-throughput, labor and resource efficient manner. It allows simultaneous comparison of multiple strains (e.g. knockout mutants of a gene) and conditions (e.g. cells in different media or treated with different concentrations of inhibitor) in parallel and simplifies time-courses.

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Macropinocytosis, large-scale non-specific fluid uptake, is important in many areas of clinical biology including immunology, infection, cancer, and neurodegenerative diseases. Here, existing techniques have been adapted to allow high-throughput, single-cell resolution measurement of macropinocytosis in the macropinocytosis model organism Dictyostelium discoideum using flow cytometry.

フローサイトメトリーによる細胞性粘菌キイロタマホコリカビマクロピノサイトーシスの高スループット測定

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

フローサイトメトリーによる生体内におけるタンパク質自己集合体の検出と特性特性

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

造血幹細胞とT細胞におけるミトコンドリア質量と膜電位の測定

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...