フローサイトメトリー解析のためのマウス脾細胞単細胞懸濁液の単離と調製

まず、安楽死させたマウスをクリーンベンチの仰臥位に置きます。マウス腹部の正中線に沿って切断し、腹部構造を層ごとに分離します。ピンセットを使用して、大網と胃をそっと開きます。

次に、胃脾靭帯で脾臓をそっと引き抜き、周囲の組織や靭帯から鈍く分離して無傷の脾臓を取得します。70ミクロンの細胞フィルターを100mmの無菌培養皿に入れます。セルストレーナーに脾臓を追加し、シリンジプランジャーで粉砕します。

5〜8ミリリットルのホモジネートフラッシング液を加えて、脾臓細胞をフィルターを通して培養皿に押し込みます。濾液を室温で450gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。リンパ球分離キットに付属のサンプル希釈液でペレットを再懸濁します。

血球計算盤で細胞をカウントした後、細胞濃度を2 X 10に調整し、1ミリリットルあたり8細胞の累乗にします。遠心チューブに、組織単細胞懸濁液と同量のリンパ球分離溶液を服用します。単一細胞懸濁液をリンパ球分離溶液の表面に慎重にピペットで移動し、800gで25°Cで30分間遠心分離します。

遠心分離後、チューブ内の4つの層を上から下に観察します。ピペットを使用して、環状の乳白色リンパ球層を別のチューブに慎重に引き込みます。チューブに10ミリリットルの洗浄液を加えて細胞を混合します。

細胞懸濁液を250gで5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを10ミリリットルのRPMI 1640培地に再懸濁して細胞計数します。