まず、DNA結合ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ1ミリグラムを含む75マイクロリットルのアリコートを1つ取り、磁気ラックで上清を取り除きます。ビーズを200マイクロリットルのローディングバッファーで洗浄します。次に、ビーズを75マイクロリットルのローディングバッファーに再懸濁し、ピペッティングで穏やかに混合します。
次に、ビーズ結合DNAに最終濃度37.5ナノモルの起源認識複合体を添加し、30°Cで5分間反応をインキュベートし、毎分800回転の攪拌を行います。CDC6を最終濃度50ナノモルで添加し、前に示したように反応をインキュベートします。次に、Mcm2-7 Cdt1を最終濃度100ナノモルで添加し、前に示したように反応を20分間インキュベートします。
その後、最終濃度100ナノモルでDDKを添加し、同様に30分間インキュベートします。上清を除去した後、リン酸化Mcm-2-7六量体を含むビーズ結合DNAを200マイクロリットルの高塩洗浄緩衝液で洗浄します。ピペッティングで混合し、ビーズが完全に再懸濁されていることを確認します。
次に、バッファーを取り外し、ビーズを200マイクロリットルのCMGバッファーで一度洗浄します。蛍光標識されたCMGをビーズ結合DNA上に組み立てて活性化するには、CMGバッファーを取り外し、DNA結合ビーズを50マイクロリットルのCMGバッファーに再懸濁し、5ミリモルADPを添加します。次に、画面に記載されているすべての成分を1つのチューブに混ぜて、氷の上に置きます。
直ちに、再懸濁したビーズ結合DNAをタンパク質ミックスに加えます。反応を摂氏30度で15分間インキュベートし、800RPMの撹拌を行います。ビーズをHSWバッファーとCMGバッファーで順次洗浄します。
緩衝液を除去した後、DNA結合磁気ビーズを含むCMGを200 μLの溶出緩衝液に再懸濁し、800 RPMの撹拌で室温で1時間インキュベートします。チューブを磁気ラックに置き、ビーズを5分間収集します。溶出したDNA-CMG複合体を含む上清を、沈殿したビーズを乱さずに慎重に収集し、新しいチューブに移します。
溶液中にビーズが残らないように、採取した上清を再び磁気ラックに置き、さらに5分間注意深く保管します。上清を集めて新しいチューブに移します。200マイクロリットルの上清に1, 400マイクロリットルのCMGバッファーを追加します。
これで、サンプルを1分子イメージングする準備が整いました。
