完全に再構成されたCMGの動きを画像化するためのハイブリッドアンサンブルおよび単一分子アッセイ

私たちは、真核生物のレプリソームのさまざまな構成要素の運動ダイナミクスを単一分子レベルで研究しています。細胞がすべての細胞サイクルで全ゲノムを複製する方法を深く定量的に理解するために。2015年のブレークスルーでは、真核生物のDNA複製が精製されたタンパク質成分からin vitroで完全に再構成されました。

これにより、システムを大幅に制御できるようになりました。それ以来、DNA複製のさまざまな段階に関する疑問に答えるために広く使用され、時間的および空間的な解像度が向上しています。そして、これはクライオ電子顕微鏡や単一分子生物物理学などの補完的なアプローチを使用して行われました。

単一分子分野では、このシステムの最大の課題の1つは、関与するタンパク質の数と、単一分子イメージングを複雑にする可能性があるため、反応全体の効率を最大化するためにこれらの成分が必要な濃度です。ここで説明するプロトコルでは、タンパク質複合体を最初にアンサンブル生化学を使用して効率的な方法で組み立ててから、単一分子の設定で導入および研究するハイブリッドアプローチを導入します。これにより、単一分子レベルで2つの高濃度のタンパク質が導入されるのを回避できます。

このアプローチは、DNA上の複製ヘリカーゼCMGの挙動を、起源ベースの経路を介したアセンブリ後の単一分子レベルで研究する方法を示しています。しかし、このアプローチは、他の多くの種類のDNA結合タンパク質複合体のダイナミクスを研究するためにも使用できます。