この方法は、液体サンプル中の定量タンパク質量を、カウント用の単一分子プロセスで較正する方法を示す。具体的には、タンパク質集団が各分子レベルで蛍光標識できる方法を示すことができる。これまでの方法では、蛍光分子とタンパク質分子のモル比を分析するためにバルク測定を行っていましたが、タンパク質集団が実際にどのように標識されているかを明らかにすることはできません。
我々の方法は、単一分子レベルで直接それを行うことができます。我々の方法は、超高感度かつ高度な分子濃度アッセイに拡張することができ、将来の診断方法につながり、検体中の病原性分子の効率的な発見を可能にする。我々の方法は、蛍光抗体を用いた単一タンパク質種分析、および電気泳動またはクロマトグラフィーによって分離されたすべてのタンパク質に対する非特異的標識を用いた複数種の分析に適用することができる。
この技術の最も重要なポイントは、データの再現性を得るです。複数のサンプルを測定する場合は、できるだけ同じ実験条件を維持することをお勧めします。この手法の視覚的なデモンストレーションは、各実験ステップを安定して再現可能にする方法を提供します。
また、顕微鏡カバーリップのスピンコーティングや洗浄など、生化学プロトコルの珍しいステップも示します。この手順を開始するには、テキスト プロトコルで説明されているように、ライジング バッファーと 1%Tween-20 を準備します。水酸化ナトリウムを使用して、pHを12に調整します。
1マイクロリットルのモルDDTと50%CHAPSの4マイクロリットルを1マイクロリットルと100マイクロリットルのライジングバッファーを混合します。調製した細胞培養液の1マイクロリットルを加え、気泡を避けるためにゆっくりとピペット処理することによって溶液を均質化する。穏やかな攪拌で5分間室温で暗闇の中でインキュベート。
次に、溶液をゆっくり上下にピペット化して再均質化する。Cy3 NHSエステル染料のマイクログラムを1マイクログラム追加し、気泡を避けるためにピペットを遅くすることによって溶液を均質化します。穏やかな攪拌で10分間室温で暗闇の中でインキュベート。
同じ量の染料を加え、サンプルを1回インキュベートして、このプロセスを繰り返します。0.8モルHEPES-水酸化ナトリウムの100マイクロリットルを加え、溶液のpHを7.2に調整し、反応を焼き付けます。溶液を均質化するためにゆっくりとピペットを上下に。
次に、20マイクロリットルのビオチン-2アミンと5マイクロリットルのEDCを加えます。ゆっくりと上下にピペットを使用して溶液を均質化します。穏やかな攪拌で1時間室温で暗闇の中でインキュベート。
この後、10キロダルトンカットオフの限外濾過カラムを使用して、未反応の標識試薬を除去し、サンプルを濃縮します。タンパク質サンプルと分子ラダーに対して標準SDS-PAGEを実行した後、ゲルを画像化してタンパク質バンドの位置を特定します。鋭利な刃を使用して、バンドの位置に基づいて目的のタンパク質画分を含むゲル部分を切り取ります。
まず、22ミリメートル×22ミリメートルで、厚さ0.15ミリメートルのカバーリップを設定します。プラズマクリーナーを使用して、カバースリップを空気プラズマに1分間露出させ、表面をきれいにして活性化させます。次に、スピンコーターを使用して、200マイクロリットルのアバディンバッファーを500RPMで5秒間スピンコートし、続いて1000RPMで30秒を続けます。
室温で15分間カバーリップをインキュベートし、空気を乾燥させます。タンパク質サンプルのカバーリップを調製するには、希釈したタンパク質サンプルを使用します。希釈したサンプルの100マイクロリットルを、アバディンコーティングされたカバーリップの中央に置きます。
室温で暗闇の中で15分間インキュベートします。陽性対照を調製するために、精製蛍光ビオチン100マイクロリットルを、アバディンコーティングカバースリップの中央にpH 7.2の5マイクロモルHEPES-水酸化ナトリウムに入れる。室温で暗闇の中で15分間インキュベートします。
負のコントロールを調製するために、スピンコートプラズマは、5つのHEPES-水酸化ナトリウムを200マイクロリットル、BSAの1ミリリットルあたり2ミリグラムのアバディンを使用せずにカバーリップを行った。pH 7.2で5マイクロモルHEPES-水酸化ナトリウムに100マイクロリットルを精製蛍光ビオチンを加えます。暗闇の中で室温で15分間インキュベートします。
この後、各カバースリップを200マイクロリットルの蒸留水でリンスし、ピペットチップでカバースリップの真ん中に触れないようにします。この洗浄を3回繰り返します。その後、同数の新しいカバーリップを空気プラズマに1分間露出させます。
乾燥を避けるために、各サンプルバウンドカバースリップの上にクリーニングカバースリップを置きます。広視野またはエバネッセントフィールド蛍光顕微鏡を起動します。顕微鏡にカバースリップをセットし、焦点を見つけます。
次に、タイルスキャンを実行して、少なくとも100個の画像を取得します。本研究では、細胞内の標識タンパク質種ごとに標識均質性をSDS-PAGEで分離した後に定量化した。HeLa細胞ライセートのタンパク質の異なる分子量画分、ならびに陽性および陰性の対照の生画像データがここに見られる。
タンパク質サンプルと陽性対照の両方が画像あたり100〜500のスポットの間を示すが、陰性対照は非常に少数からなしを示す。これは、このプロセスがカバースリップ表面への染料の非特異的結合を十分に阻害することを示す。タンパク質サンプルおよび陽性対照のスポット強度ヒストグラムは、タンパク質およびアバジン四量体構造における一次アミンへの色素の確率的結合をそれぞれ表す複数のピークを提示する。
すべてのスポットは、連続的なレーザー励起で点滅と段階的な光漂白を示し、単一分子レベルでの観察を強調した。次に、ラベリング占有率(LO)は、陽性対照におけるすべてのタンパク質サンプルのスポット数の比率から計算されます。HeLa細胞のライセートサンプルから測定したLOは、分子量の小さい分率では50%から、分子量が高い分率では90%の範囲です。
分離せずに全体のプロテオームサンプルのLOは72%と見られる試薬を使用し、特にカバーリップの調製中に、任意のほこりを避けるために重要です。この手順に従って、一定の体積での単一分子計数分析を行い、各タンパク質の濃度を定量化することができます。例えば、任意の生製品、またはゲルおよび毛細管電気泳動産物に対する分析を行うことができる。
この技術は、分子医学、有機化学、およびオミックス分析に単一分子蛍光イメージングを利用するための道を開きます。集中力と数字の間の概念をつなぎます。水酸化ナトリウムは腐食性であり、それを取り扱う際には適切な保護を着用する必要があります。
また、高出力レーザー放射は目の損傷を引き起こす可能性があるため、保護ゴーグルが着用される場合があります。
