ここでは、単一分子FRETを使用し、天然アミノ酸の取り込みを介した部位特異的タンパク質標識を使用して、mGluR2の構造動態を研究しました。これにより、タンパク質構造を乱すことなくタンパク質動態を研究することができます。原子構造は、タンパク質の静止画像を提供する。
しかし、1分子FRETを使用すると、タンパク質の全範囲の動きをリアルタイムで溶液で視覚化できます。この方法は、あらゆるタンパク質の動態を研究するために適用することができる。さらに、天然アミノ酸の取り込みは、タンパク質間相互作用、および合成受容体の工学を研究するために使用することができる。
サンプルのローディングとイメージングの最適化には、忍耐と練習が必要です。まず、スライドガラスに開ける穴にマーカーで印を付けます。スライドを水に浸している間、ドレメルを使用してスライドに小さな穴を開けます。
スライドを超音波処理し、摂氏23度のバス超音波処理器で30分間アセトンでスリップを覆います。スライドとカバーのスリップジャーからアセトンを廃棄します。水で十分にすすぎ、5モル水酸化カリウムで30分間超音波処理します。
次に、スライドをすすぎ、スリップを水で覆い、メタノール中で2分間超音波処理します。アミノ塩類化ステップまでメタノールで満たされたジャーを残します。新しく調製したアミノ塩類化混合物をスライドに注ぎ、スリップジャーを覆います。
溶液を廃棄する前に、アミノ塩類化混合物中のスライドおよびカバースリップをインキュベートし、超音波処理し、再びインキュベートする。次に、瓶を水で満たす前にメタノールで洗います。次に、スライドを水ですすいでください。
エアブローで乾かし、組み立てボックスに入れます。60ミリリットルのPEG化溶液をスライドに塗布し、その上にカバースリップを置きます。保管する前に、非PEG化面に印を付けてください。
インキュベーション後、静かに分解し、スライドとカバースリップを水ですすいでください。次に、空気を吹き付けて乾燥させ、PEG化表面を互いに反対側に向けて滅菌した50ミリリットルのチューブに入れます。HEK 293T細胞を0.05%トリプシン-EDTAで継代した後、細胞をポリ-L/D-リジンカバースリップに播種します。
増殖細胞および代謝型グルタミン酸受容体2、またはmGluR2発現用のAZP補充培地を含む標準培地を配置する。その後、トランスフェクション試薬で細胞をトランスフェクションし、24時間インキュベートしてから、新鮮なAZP添加培地で培地を交換します。アルキンシアニン染料で標識する20分前に、カバースリップを温かい記録バッファー(RB)で2回洗浄し、AZPを含まない温かい標準培地に入れます。
次に、標準培地を除去し、細胞をRBで洗浄してから、新たに調製した標識溶液を加えます。暗闇の中で摂氏37度で15分間インキュベートします。インキュベーション後、標識溶液を取り除きます。
トランスフェクトした細胞を含むカバースリップをRBで2回洗浄し、同じ培地に再懸濁します。次に、摂氏4度で1,000gで5分間回転させて細胞をペレット化し、上清を除去してからペレットを80〜130マイクロリットルの溶解溶液に再懸濁した。ピペッティングでペレットを破る。
次に、それをホイルで包み、摂氏4度のロッカーに30分から1時間置き、細胞を溶解します。不溶性画分を20, 000 gおよび摂氏4度で20分間遠心分離することによりペレット化する。次に、上清を新鮮な冷たいチューブに移し、氷の上に保存します。
スライドとカバースリップを冷凍庫から取り出し、暗所で室温で温めます。スライドとカバースリップの間に両面テープのストリップを挟んでチャンバーを組み立て、PEG化表面がフローチャンバーの内部を形成するようにします。ピペットチップを使用してカバースリップを押し、テープがカバースリップとスライドに接触していることを確認します。
スライドの端にエポキシを塗布します。40マイクロリットルの500ナノモルのニュートラアビジンを各レーンに塗布し、加湿した暗い箱の中でインキュベートします。2分後、各チャンバーレーンを100マイクロリットルのT50バッファーで洗浄します。
次に、20ナノモルのビオチン化抗体溶液を加え、レーンあたり200マイクロリットルのT50バッファーで洗浄する前に30分間インキュベートします。コンピュータと顕微鏡の電源を入れます。次に、レーザーをオンにしてウォームアップします。
次に、EMCCDカメラの電源を入れ、ソフトウェアを開きます。サンプルチャンバーを顕微鏡ステージに取り付け、タンパク質サンプルを徐々に追加して、視野あたり約400分子を実現します。0.3単位のプロトカテクエート3,4-ジオキシゲナーゼを添加した100マイクロリットルのイメージングバッファーでチャンバーを洗浄します。
ゲイン、取得率、レーザー出力を調整して、ドナーチャンネルとアクセクターチャンネルの両方で単一分子蛍光シグナルを検出します。次に、ドナーを励起し、視野内のドナー分子の80%がフォト退色するまでのタイムトレースを取得します。映画の最後に、640ナノメートルのレーザーをオンにして、分子の一部が光退色するまでアクセプターを直接励起します。
視野を変更し、ドナーとアクセプターの励起の手順を繰り返して、条件ごとに3つの動画を収集します。粒子ピッキングの単一分子FRETトレースを選択するには、ドナートレースとアクセクタートレースの合計強度が時間の経過とともに安定しているトレースを選択します。次に、ドナーとアクセプターの強度に反相関の変化があるトレースを選択します。
シングルステップの光退色を示すドナー分子とアクセプター分子を選択し、5秒以上の長さをトレースします。FRET欠損を計算します。最後に、原稿に記載されている手順に従って、隠れマルコフモデリング(HMM)によって立体構造状態を特定します。
シアニン色素によるAZPの標識は、銅触媒による環化付加反応によって達成され、ドナーおよびアクセプター蛍光色素で標識された細胞表面集団による548UAAの効果的な原形質膜標識をもたらしました。SDS-PAGE電気泳動では、548UAAを発現するHEK 293T細胞で250キロダルトンの単一バンドが観察され、これは全長二量体mGluR2と一致しました。ドナーおよびアクセプターの漂白イベントに対する複数の短命および長期の代表的な選択的痕跡をここに示します。
立体配座状態はHMM解析を用いて同定した。離散FRET状態間の遷移を理想適合値から抽出し、遷移密度ヒートマップとしてプロットした。理想化されたFRETトレースは、識別された各確認の滞留時間に関する情報も提供します。
ドナーチャネルとアクセプターチャネルを持つ単一分子の痕跡を以下に示します。さらに、単一分子FRETは、mGluR2システインリッチドメインの4つの立体配座状態を明らかにします。単一分子のプルダウンには効率的なピーク保存が不可欠であり、このプロセスには注意が必要です。
さらに、酸素消去剤はイメージングの直前に添加する必要があります。この標識法と1分子FRET実験は、複数の受容体に適用され、受容体の活性化と受容体機能の調節のメカニズムに新たな洞察をもたらしました。
