TB と HG 欧州研究評議会「Cellufuel、高度なグラント号 294438」を通じて支援を認めます。HCS は、Innovationsallianz Technofunktionale Proteine (TeFuProt) を通じて教育研究のための中央政府大臣から財政支援を認めている SS が金融認めているバイエルン州省から科学と教育のためのサポートによって研究の焦点「Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe - キャンター」。テクニカル サポート、コニー Hasselberg クリストフとマルチナ Hörig に感謝します。

著者が明らかに何もありません。

SMF 原子間力顕微鏡の導入以来、直接プローブ内および個々 の蛋白質、核酸、その他生体分子3,4、5の分子間力に広く使われている手法に進化しました。SMF 実験に成功、適切なサーフェス結合戦略が必須です。天然および合成高分子の分子内力を調べるため、基板表面と AFM 先端36,38,39,40,41にポリマーを直接に結合可能性があります。分子の結合などの分子間相互作用の調査のために、しかし、それは AFM チップに相互作用パートナーを接続する適用範囲が広いリンカー分子ヘテロ二官能性 PEG リンカーまたはポリペプチド鎖などを使用することをお勧めし短距離の表面力を克服するために、変性や変性タンパク質21,22,23、ように結合パートナーの正しい向きを可能にするために、基板表面 24,25,26,27,42。我々 したがって、ヘテロ二官能性 PEG スペーサーを使用して自分のアクセスの第一級アミン蛋白質を介して共有結合固定化のためのシンプルでまっすぐ進むプロトコルを説明します。
適用性を示した我々 の相互作用の調査の双球菌肺炎球菌感染から RrgA と細胞外マトリックス蛋白 Fn の力として最近で詳しく説明他13。
表面の化学がよく確立され、分析と同様のアプローチは、複数の SMF 実験19,42,43,44,45で正常に使用されています。表面にシラン高分子を結合の使用 silylether は、加水分解が適用されます。加水分解の程度は、シリル化プロセス中に制御することができます形成されたシロキサン結合の量に依存します。高い相互作用力 (≥ 1000 pN) は、SMF の測定中に期待されて、シリル化は実行を介して気相蒸着30シロキサンの連続的な層の形成の結果をする必要があります。多くの実験 (例えば、多くのタンパク質-タンパク質相互作用) の相互作用力は数百の pN と記述されていたプロシージャ、するシロキサンの形成を液相からの蒸着法による実施し、非連結の範囲で有機シランは思慮深く熱 (ステップ 1.1.8) と硬化後のエタノール (ステップ 1.1.7) で洗い落とし、充分です。
もう一つの重要なステップです残りの EDC を洗うし、NHS 分子表面 (ステップ 1.2.3) をオフは、残り物は、蛋白質のカルボキシル基の活性化につながるよう。これは、その機能を変えることができる同一の表面タンパク質の架橋結合のどちらかの結果を可能性があります。 またはカップルが反対側の面の他の蛋白質に蛋白質を活性化しました。これは表面とドメイン展開を伴う可能性が高い破断力による AFM の先端の間の蛋白質のクランプにつながる可能性があります (図 3 b1、4、5 のトレースを参照してください Fn ドメインの展開)46。PEG スペーサーのアクティブな NHS エステル不飽和に残っている場合、同じ問題が発生することができます。したがって、トリス緩衝生理食塩水で孵化は推奨 (ステップ 1.2.6)、トリスの第一級アミンを消光残りアミノ反応性として。
シラン処理ガラスの Fn の均一な分布につながる段階のプロトコルに従う (図 2を参照)、表面蛋白質の二量体の形を残してします。これは溶液中の Fn´s の構造のような他サンプル表面37前の原子間力顕微鏡データと一致します。さらに、AFM の先端に RrgA の適切な濃度は、SMF の測定 (図 3および図 4) 中の明確な相互作用イベント 〜 20% のターゲット値を生成するに取得されます。タンパク質濃度および/またはインキュベーション時間を変化させる以外にもサンプル基板、カンチレバーの先端に結合分子の量を制御する別のエレガントな方法は、異なるセカンダリ官能基をもつシラン剤の組み合わせです。PEG ・ ポリマーから伸びる蛋白質反応基の割合を変更すると、固定された蛋白質の数は制御15,16,17,18をすることができます。
ここで説明されているプロトコルは、他 -NH2含む分子を固定化したり、ガラスとシリコン窒化以外にも他のシリコン酸化膜の表面にいくつか蛋白質を調整するも使用できます。タンパク質の設計によってアミン反応性のカルボキシル基に変更できますスルフヒ反応グループ (例えば、マレイミドまたはオルソ ピリジル二硫化)を介してタンパク質カップルにその無料-SH グループ。Fn、この定義済みの方向の13,17,20になります。
要約すると、このプロトコルはさまざまな要件を提供するために調整することができます、単一分子力分光実験以外にも他の生物物理アプリケーションに適しています。

光と磁気ピンセットの横に原子間力顕微鏡 (AFM)1,2分析および分子を操作する便利なツールとして浮上しているし、プローブのプロパティおよび関数、外部力3 への対応を含む ,4。対照的に酵素結合抗体法 (elisa 法) のような方法は、表面プラズモン共鳴 (SPR) または水晶発振子マイクロ バランス (QCM) セットアップは、原子間力顕微鏡により分子 (SMF)5単一セルのレベル (SCFS)6 上の相互作用を測定するには.これらの技術をもたらした Fn黄色ブドウ球菌結合タンパク質で形成されたエシェリヒア属大腸菌線毛の蛋白がマンノース7、またはタンデム β ジッパーと FimH を繰り返すの相互作用の発見キャッチ債のようなバインド メカニズムに貴重な洞察力Fn8へのバインド時に。最近毛 1 付着性 RrgA9,10グラム陽性菌の肺炎球菌(S. pneumoniae)11からはフィブロネクチン12にバインドすることを示すことができましたその二つのターミナル ドメイン。これはタンデム β ジッパーとは異なりますし、毛肺炎球菌を形成し、一時的なフィブロネクチン含有の問い合わせ先ホスト面13を維持するを有効にする可能性があります新しい 2 ドメイン バインド メカニズムを明らかにしました。
SMF の実験の成功は、批判的に固体表面と原子間力顕微鏡のチップで生体分子の機能とネイティブの固定化に依存します。高い力に SMF 測定中に起こりうる、蛋白質は、できればにおいて、表面に共有に結合する必要があります。たくさんの異なる結合蛋白質と他の生体分子だけ (無機) 固体表面、ナノ粒子と文学14,15 に記載されているその他のデバイス上の全体のセルでの固定化法 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24、 25,26,27。これらのプロトコルは、多くの場合、有害物質の使用、実行および/または特別な装置 (例えば、プラズマ クリーナー) を必要とすることは困難です。カップル分子のガラスにする簡単な方法は、片側シラン反応グループと彼らの他の側にアミン反応性グループ ポリマー層が厚く heterobifunctional 塗料の硬化剤を添付することです。アプリケーションによっては、カップリング剤は例えば可変長の柔軟なハイドロ カーボン鎖を含めることができます。、ヒドロキソアルミニウム ポリエチレング リコール系 (PEG)。彼らは表面修飾した (例えば、疎水性、静電気とファン ・ デル ・ ワールス相互作用) の非特異的相互作用を抑制し、結合分子の回転自由度を提供することがあります。
ここでは、1 つまたは複数の自由なアミノ グループを含んでいる蛋白質の結合の結合のための一般的なプロトコルについて述べる (-NH2) ガラス表面し、窒化ケイ素原子間力顕微鏡のヒントを介してheterobifunctional エトキシ シラン-ペグ-カルボキシル基 (-COOH)。SMF の実験で、例示されている RrgA と Fn の細胞外マトリックス蛋白の相互作用に基づくこのプロトコルを使用することができます (概要については図 1を参照)。
最初のステップは、表面28,29,30,31のシリル化です。それは反応性の高い SiOH グループを形成するためにカップリング剤のエトキシ グループの加水分解を含みます。これらは、基板上 SiOH グループと反応できます。主凝縮でのステップは、これらの silanols の水素結合を形成し基板の上に広げ。(これは通常熱または水を削除する真空が必要) 二次縮合反応のシロキサン結合が形成されます。これは、結果、共有添付有機シラン。
2 番目の手順は、機能する蛋白質の結合 (-COOH) ポリマー32から拡張するグループ。まず、酸は確立された NHS/EDC を通して得られた反応性 N hydroxysuccinimid (NHS) エステル中間に変換されます (1-エチル - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid 化学33求核置換反応を受けると最終的に蛋白質の第一級アミンとアミド結合を形成します。
このように RrgA はシリコン窒化 AFM チップとランダムな方向にガラス基板を人間の Fn を連結した、単一分子レベルでの相互作用力を行った。ガラス表面に Fn の均一な分布と先端、SMF の測定時に発生する相互作用の最大 20% のターゲット値で明らかに RrgA の濃度を適切に説明した表面化学をリードすることが分かった。この化学非特異の相互作用を低減、データ集録中に少し変更する場合は、したがって見事正確な SMF 実験に適しています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03450</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738</td>
			<td>100 %; analytical purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doubly distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065</td>
			<td>&#8805; 99.8 %; analytical purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethoxy silane polyethylene glycol acid</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG2-CASL-5k</td>
			<td>5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X896</td>
			<td>32 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>804518</td>
			<td>NHS; for synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline - Dulbecco</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L1825</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule e.g. RrgA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Produced in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE15</td>
			<td>&#8805; 99,3 %; TRIS; Buffer Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cutter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inert gas desiccator</td>
			<td>Sicco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope - Zeiss Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JPK NanoWizard 1</td>
			<td>JPK Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JPK NanoWizard SPM and DP software</td>
			<td>JPK Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter</td>
			<td>Knick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td>10-100 &#181;l, 50-200 &#181;l, 100-1000&#160;&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Acculab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride cantilever - MLCT</td>
			<td>Bruker AXS S.A.S</td>
			<td></td>
			<td>Spring constant &#8804; 100 pN/nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope - Zeiss Stemi</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech science precision wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twezzers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV PenRay</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>90-0012-01</td>
			<td>Mercury spectrum with the primary energy at 254&#160;nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TP64</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent immobilization of proteins for the single molecule force spectroscopy

近年, 原子間力顕微鏡 (AFM) と単一分子力分光法 (SMF) の分子特性と機能の私達の理解を拡張しました。それは私たちに詳しくホストの表面の受容器にどのように細菌アドヘシン バインドなど、生物物理学的メカニズムの多様性を探索する機会を与えた。その他の要因の間で SMF 実験の成功は、固体表面と原子間力顕微鏡のチップで興味の分子の機能とネイティブの固定化に依存します。ここでは、順序でシラン ペグ carboxyls と定評の N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) 化学を用いたシリコン表面に蛋白質の共有カップリングの簡単なプロトコルについて述べる細胞外マトリックス蛋白質フィブロネクチン (Fn) グラム陽性菌の肺炎球菌(S. pneumoniae) から線毛 1 付着性 RrgA の相互作用を探索できます。ガラス表面に Fn の均一な分布と AFM カンチレバー先端、SMF の中に相互作用イベントの最大 20% のターゲット値によって明白に RrgA の適切な濃度に表面の機能化をリードすることが分かった測定 RrgA Fn に 52 pN の平均力と結合することを明らかにしました。プロトコルは、カップルのサイト経由で特定の無料チオール グループに調整できます。これは定義済みの蛋白質または分子配向の結果し、SMF のほか他の生物物理アプリケーションに適しています。

プロトコル説明ここで共有結合固定化によるタンパク質の結果ランダムな方向 (図 1) とアクセスの第一級アミンの類。図 2 (左) とシラン処理ガラス表面の AFM 像を示しています、窒素の穏やかな流れの下でサンプルの脱水後 (右) Fn が固定化せずに記録。約 10 nm 高 Fn 分子が明らか (図 2左)、高分子シラン表面修飾と Fn の約 2-5 nm (図 2右) 中の高さとだけ小さな表面よりを示しています。クローズ アップ、Fn の二量体の構造を確認できます。Fn 分子にペグの表面コーティングの上 4-5 nm の高さの長さとコンパクトに見える 〜 120 nm (の挿入を参照してください)。
Fn は、最近私たちのグループ13で詳細に説明したと RrgA の相互作用力を調査するには、RrgA シリコン窒化 AFM 探針とガラス基板 (図 3 a) に人間の Fn に結合されていました。図 3は、代表的な先端に 1 μ m s-1の引き抜き速度で記録された Fn をもつ RrgA との相互作用の分離曲線のサンプルを示します。使用される表面化低バック グラウンド操作とチェーン (eWLC) モデル (赤いカーブ) のような拡張性のあるワームを使用して装着された (図 3 a)、形の良い単一 (または二重) 相互作用イベントにつながった。まで AFM 探針と基板、ペグ リンカー (> 70 nm) をストレッチと非特異的表面相互作用を克服した後は、フィット (破断力と - 長さ、図 4を参照) の結果をプロット力曲線の ~ 19% 示した破裂RrgA - Fn との相互作用の力の平均破裂イベント 〜 約 100 の tip サンプル距離で 52 pN nm。対照的に、適切でない表面化 (ここでは、生理食塩水図 3bをバッファリング トリスと省略された焼入) (トレース 2 と 3) をバインド複数タンパク質非特異的相互作用による単一の操作イベントの明確な評価の妨げになるおよび/またはタンパク質試料表面と原子間力顕微鏡のカンチレバー探針との間の共有カップリング。これは蛋白質 (Fn) の領域 (トレース 4 および 5) の展開を伴う可能性が高い破断力 (トレース 1) につながる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig1.jpg"> 図 1: 表面の化学上の概要。エトキシ シラン-ペグ-カルボキシル基の加水分解は、シロキサン架橋の形成と水和からす表面の結露が続きます。EDC のカルボキシル基との反応は水溶液 (加水分解) の半減期が非常に短いとアミン反応性中間反応o- acylisourea の結果します。中間は最終的に蛋白質の第一級アミンとアミド結合を形成する求核置換反応を受ける NHS エステルの形成による安定化します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig2.jpg"> 図 2: 固定ガラス基板を介してheterobifunctional エトキシ シラン ペグにフィブロネクチンのカルボキシル基剤。機能性ガラスの AFM 像 (左) と表面し、(右) なし Fn. 数字は個々 の Fn 分子を基板の表面 (挿入) で均一に配られます。分子がペグの上 4-5 nm の高さの二量体でコンパクトな構造を採用するコーティングとの長さ > 100 nm。これは、他のサーフェスは、雲母などの前の原子間力顕微鏡データを一貫性のあるソリューションで Fn の構造が似ている (インレイのスケール バー = 500 nm)37。AFM 下画像、AFM 画像に示されている線に沿って高さプロファイルです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig3.jpg"> 図 3: SMF 実験と代表のイラスト力 RrgA - Fn 相互作用の距離曲線。(a) RrgA と Fn された共有リンクを介してheterobifunctional エトキシ シラン ペグ AFM の窒化ケイ素にカルボキシル基カップリング剤カンチレバー探針とガラス表面、それぞれ。代表の SMF は、RrgA - RrgA と Fn の記述への固定化と 1 μ m s-1の収縮速度で Fn 相互作用の得られた曲線が表示される距離を強制します。赤いカーブは、破断荷重、長さを得るために適用する拡張可能なワームのようなチェーン フィットを表します。図は Becke、ら、ACSnano 201813から変更されています。(b) 代表の SMF は、生理食塩水 RrgA - tris バッファー焼入れなし Fn 相互作用の距離曲線を強制します。この場合、トリスの第一級アミンは欠席した NHS エステル不飽和実験中に残っていたので、残りのアクティブな。これはマルチ蛋白質 (トレース 2 と 3) をバインディングにつながったし、表面と高破断につながった AFM 先端間の蛋白質のクランプ力 (Fn-) を伴うドメイン展開 (トレース 1、4 および 5; 異なるスケールを注意してください)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig4.jpg"> 図 4: 単一 RrgA - Fn 相互作用の力・長さ分布。破壊力と RrgA - Fn SMF の相互作用の測定から得られた対応する破断長ヒストグラム (n = 1400) 1 μ の-1の収縮速度で。ヒストグラムは、51.6 pN (ガウス適合、黒い線) の最もありそうな破壊力fMP破断長約 100 の蓄積を明らかにする nm。図は、らACSnano、2018年13Becke から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

このプロトコルを記述する、heterobifunctional シラン カップリング剤による酸化シリコン薄膜表面の原子間力顕微鏡による単一分子力分光法のために設計するで例示されている蛋白質の共有結合固定化、RrgA の相互作用 (毛 1 先端付着性S. pneumoniae)フィブロネクチンと。

力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

covalent-immobilization-proteins-for-single-molecule-force

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.0K ビュー.  Munich University of Applied Sciences. このプロトコルを記述する、heterobifunctional シラン カップリング剤による酸化シリコン薄膜表面の原子間力顕微鏡による単一分子力分光法のために設計するで例示されている蛋白質の共有結合固定化、RrgA の相互作用 (毛 1 先端付着性S. pneumoniae)フィブロネクチンと。

ビデオ: Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau's heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

本質的に無秩序なタンパク質の複数のリン酸化の同定のための核磁気共鳴分光法

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

生化学

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子の力分光法

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA processing, and telomere elongation. During these processes, various proteins bind and resolve G4 structures to perform their function. As the function of G4 often depends on the stability of its folded structure, it is important to investigate how G4 binding proteins regulate the stability of G4. This work presents a method to manipulate single G4 molecules using magnetic tweezers, which enables studies of the regulation of G4 binding proteins on a single G4 molecule in real time. In general, this method is suitable for a wide scope of applications in studies for proteins/ligands interactions and regulations on various DNA or RNA secondary structures.

A single-molecule magnetic tweezers platform to manipulate G-quadruplexes is reported, which allows for the study of G4 stability and regulation by various proteins.

磁気ピンセットで G quadruplexes の単一分子マニピュレーション

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and millisecond temporal resolution. These capabilities make single-molecule localization microscopy ideally suited to study molecular level biological functions in physiologically relevant environments. Here, we demonstrate an integrated protocol for both acquisition and processing/analysis of single-molecule tracking data to extract the different diffusive states a protein of interest may exhibit. This information can be used to quantify molecular complex formation in living cells. We provide a detailed description of a camera-based 3D single-molecule localization experiment, as well as the subsequent data processing steps that yield the trajectories of individual molecules. These trajectories are then analyzed using a numerical analysis framework to extract the prevalent diffusive states of the fluorescently labeled molecules and the relative abundance of these states. The analysis framework is based on stochastic simulations of intracellular Brownian diffusion trajectories that are spatially confined by an arbitrary cell geometry. Based on the simulated trajectories, raw single-molecule images are generated and analyzed in the same way as experimental images. In this way, experimental precision and accuracy limitations, which are difficult to calibrate experimentally, are explicitly incorporated into the analysis workflow. The diffusion coefficient and relative population fractions of the prevalent diffusive states are determined by fitting the distributions of experimental values using linear combinations of simulated distributions. We demonstrate the utility of our protocol by resolving the diffusive states of a protein that exhibits different diffusive states upon forming homo- and hetero-oligomeric complexes in the cytosol of a bacterial pathogen.

3D single-molecule localization microscopy is utilized to probe the spatial positions and motion trajectories of fluorescently labeled proteins in living bacterial cells. The experimental and data analysis protocol described herein determines the prevalent diffusive behaviors of cytosolic proteins based on pooled single-molecule trajectories.

単一分子トラッキング顕微鏡 - 細胞細胞分子の拡散状態を決定するツール

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled protein polymerization process is always a challenge. Here, we have developed an enzymatic methodology for constructing polymerized protein step by step in a rationally-controlled sequence. In this method, the C-terminus of a protein monomer is NGL for protein conjugation using OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) while the N-terminus was a cleavable TEV (tobacco etch virus) cleavage site plus an L (ENLYFQ/GL) for temporary N-terminal protecting. Consequently, OaAEP1 was able to add only one protein monomer at a time, and then the TEV protease cleaved the N-terminus between Q and G to expose the NH2-Gly-Leu. Then the unit is ready for next OaAEP1 ligation. The engineered polyprotein is examined by unfolding individual protein domain using atomic force microscopy-based single-molecule force spectroscopy (AFM-SMFS). Therefore, this study provides a useful strategy for polyprotein engineering and immobilization.

Here, we present a protocol to conjugate protein monomer by enzymes forming protein polymer with a controlled sequence and immobilize it on the surface for single-molecule force spectroscopy studies.

OaAEP1-媒介酵素合成と単分子力分光法のための重合タンパク質の固定化

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm phenotyping can be used to classify genotypes based on SG morphotype using scanning electron microscopic (SEM) analysis. SGs can be visualized using SEM by slicing through the kernel (pericarp, aleurone layers, and endosperm) and exposing the organellar contents. Current methods require the rice kernel to be embedded in plastic resin and sectioned using a microtome or embedded in a truncated pipette tip and sectioned by hand using a razor blade. The former method requires specialized equipment and is time-consuming, while the latter introduces a new host of problems depending on rice genotype. Chalky rice varieties, particularly, pose a problem for this type of sectioning due to the friable nature of their endosperm tissue. Presented here is a technique for preparing translucent and chalky rice kernel sections for microscopy, requiring only pipette tips and a scalpel blade. Preparing the sections within the confines of a pipette tip prevents rice kernel endosperm from shattering (for translucent or &#8216;vitreous&#8217; phenotypes) and crumbling (for chalky phenotypes). Using this technique, endosperm cell patterning and the structure of intact SGs can be observed.

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

This protocol allows for the preparation of transverse sections of cereal seeds (e.g., rice) for the analysis of endosperm and starch granule morphology using scanning electron microscopy.

成熟米の横断断面(オリザ・サティバ L.ピペットチップを固定化支援として用いた走査電子顕微鏡イメージング用カーネル

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes measurements on freely diffusing biomolecules more accessible. This overview includes a step-by-step protocol for using this instrument to make measurements of precise FRET efficiencies in duplex DNA samples, including details of the sample preparation, instrument setup and alignment, data acquisition, and complete analysis routines. The presented approach, which includes how to determine all the correction factors required for accurate FRET-derived distance measurements, builds on a large body of recent collaborative work across the FRET Community, which aims to establish standard protocols and analysis approaches. This protocol, which is easily adaptable to a range of biomolecular systems, adds to the growing efforts in democratising smFRET for the wider scientific community.

This article provides step-by-step instructions for making fully-corrected accurate FRET measurements on individual, freely diffusing biomolecules using the open-source, inexpensive smfBox, from switch on, through alignment and focusing, to data collection and analysis.

オープンソースsmfBoxを使用して、正確で正確な単一分子フレット測定を行う

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 (FET) family of fusion oncoproteins, is one of the most frequently involved fusion genes in Ewing sarcoma. These FET family fusion proteins typically harbor a low-complexity domain (LCD) of FET protein at their N-terminus and a DNA-binding domain (DBD) at their C-terminus. EWS-FLI1 has been confirmed to form biomolecular condensates at its target binding loci due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, and these condensates can recruit RNA polymerase II to enhance gene transcription. However, how these condensates are assembled at their binding sites remains unclear. Recently, a single-molecule biophysics method-DNA Curtains-was applied to visualize these assembling processes of EWS-FLI1 condensates. Here, the detailed experimental protocol and data analysis approaches are discussed for the application of DNA Curtains in studying the biomolecular condensates assembling on target DNA.

Here, we describe the use of the single-molecule imaging method, DNA Curtains, to study the biophysical mechanism of EWS-FLI1 condensates assembling on DNA.

DNA上に集合したEWS-FLI1凝縮体の1分子イメージング

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...