化学毒性試験のためのブタ角膜臓器培養と上皮創傷治癒

まず、1リットルのビーカーに入れた豚の目を取ります。ピンセットで眼球を持ち、滅菌ペトリプレートのハサミで余分な眼組織を取り除きます。上皮の傷の場合は、滅菌した糸くずの出ないワイプを使用して眼球を保持し、角膜の中心に6ミリメートルのトレフィンで印を付けます。

次に、小さなメスまたは角が鈍い柔らかいかみそりの刃を使用して、トレフィンマークの円内の上皮細胞をそっとこすり落とします。基底膜が損傷していないことを確認しながら、すべての細胞破片を取り除きます。その後、綿棒で傷口部分を拭きます。

メスとハサミを使用して、角膜強膜の縁に沿って切って眼球を解剖します。次に、PBSを含む滅菌済みの500ミリリットルビーカーで角膜をすすぎます。次に、切除した角膜を逆さまにして滅菌型に入れます。

内皮角膜腔を、摂氏48度に維持された1%のアガロースを含む最小必須培地(MEM)で満たします。次に、角膜を反転させて35mm皿に移します。試験剤の有無にかかわらず、2ミリリットルのMEMを角膜中央部の表面に滴下し、上皮を空気にさらしたままにしながら、辺縁結膜領域が覆われるようにします。

次に、培養皿を摂氏37度の加湿した5%二酸化炭素インキュベーターに入れます。創傷後40時間で、傷ついた培養角膜をリチャードソン染色液で染色します。.汚れた角膜をPBSで洗ってから撮影してください。

次に、同じサイズのトレフィンを使用して元の傷に印を付け、小さなメスを使用して、印が付けられた円内の上皮細胞をこすり落とします。採取した細胞を取り出し、予冷した遠心チューブに移します。残りの創傷面積は、ネパフェナク0.1%で治療された角膜で有意に大きかった ブロムフェナク0.09%およびケトロラック0.45%で治療された角膜 LL-37で0.2および0.5マイクログラム/ミリリットルで治療された角膜は、未治療の角膜と比較して高グルコース条件下での創傷治癒の有意に加速されたことを示しました。