本論文では、三次元多細胞臓器培養モデルシステムにおける創傷をアッシングする簡単な方法について述べた。私たちは豚の目を使ってこれを行いますが、目に慣れていない場合でも、このアッセイを行うことができます。概要として、我々は、ブタの目を受け取り、地球を切り取り、上皮と間質の約3分の1を通過する角膜に円形の傷を作る。
角膜を切り取り、寒天ベースに取り付け、このコンストラクトをインキュベーターに入れます。組織は角膜に瘢痕を作り出す際に満たされます。成長因子や血清を加える必要はありません。
これは無血清培地で行われます。これは角膜で行われるが、一般的に線維性治癒のためのモデルシステムとして使用することができる。瘢痕化中に活性化される細胞経路の多くは、システム間で類似している。
バイオセーフティフードでは、ストレートエッジの外科用ブレードを使用して、エタノール洗浄されたまな板の蓋から地球を取り除き、各眼から余分な脂肪組織を取り除きます。洗浄された地球儀を後に持ち、すぐにPBSに目を浸し、続いて10%ヨウ素に3回の素早いディップを行い、PBSで2回の素早いディップを行います。その後、きれいなラボ組織で周回に眼を包み、角膜に接触することなくトート角膜表面を達成するのに十分な圧力で包みます。
6ミリメートルのトレフィンを使用して、角膜全体に完全な厚さの傷を作ることなく角膜中央の前部ストロマの上皮を貫通し、光圧を加えながらトレフィンを時計回りに180度、反時計回りに5回回転させます。創傷が鉗子で持ち上げられるほどの深さである場合、外科的ブレードを使用して、創傷マージン内で前角膜を持ち上げ続けながら、世界に平行にフラップを切断する。フラップ全体が取り除かれたら、円形の傷が角膜の中心に位置する必要があります。
角膜を収穫するために、実験室組織で目をつかみ、そして、四肢および組織の収集を含むように角膜の端から1ミリメートル離れた小さな切開を作るために外科用刃を使用する。小さくて鋭いはさみを使用すると、四肢をタクトに保つために角膜を横切ってミリメートルのマージンを維持し、世界中の切開を続けます。次に、角膜を下に、60ミリメートル、またはPBSの1ミリリットルを含む100ミリメートル皿に置きます。
角膜を取り付けるには、2組の鉗子を使用して角膜上皮側を保持してカップを作成し、無菌転写ピペットを使用してカップがいっぱいになるまで温めた寒天溶液を角膜に加えます。寒天が固まったら、慎重に角膜を新しい60ミリメートルプレート寒天側に下に置き、蓋でプレートを覆います。その後、5%の二酸化炭素で37°Cの四肢縁部の空気液体界面で角膜を維持する角膜の各プレートに4ミリリットルの無血清培地を加え、水分補給を維持するために、1日1回、角膜表面を1滴ずつ水分補給した状態の培地から1滴ずつ湿潤させます。
遺伝子ノックダウンの場合は、5マイクロリットルの小さな干渉またはsiRNaを、血清最小必須培地の50マイクロリットルとトランスフェクション試薬2マイクロリットルと混合します。50マイクロリットルの減らされた血清培地当たり角膜を用いた。5分後、2つの混合物を混ぜ合わせ、各siRNA混合物に200マイクロリットルの減らされた血清最低培地を加える。
次いで、siRNA溶液を各創傷にピペットして下ります。その後、インキュベーターに角膜を入れます。3時間後、各皿の培地を使用して角膜表面からsiRNAを洗浄し、各皿のコンディション培地を新鮮な補充された血清フリー培地と抗生物質に置き換えます。
次いで角膜培養液を培養インキュベーターに戻し、2週間インキュベートする。創傷後6時間、角膜上皮は存在しない。創傷の6日後、上皮は再成長する。
アルファ平滑筋アクチンによる蛍光アミノ染色は、前から後の間質に創傷マージンに沿った活性筋線維芽細胞の勾配を明らかにする。α平滑筋アクチンの免疫-菌学的染色は、負傷したプラスコントロールsiRNA角膜におけるα平滑筋アクチンタンパク質発現の劇的な増加を明らかにする。傷ついていない標的タンパク質siRNA治療と比較して、傷ついた角膜。
同様に、フィブロネクチン余分ドメインAは、傷ついていない、標的タンパク質siRNAと比較して傷ついた角膜を治療したsiRNAでアップレギュレートされる傷ついた角膜を治療した。標的タンパク質のノックダウンに成功したことを実証する。また、標的タンパク質を非特異的に標的とする毒素による傷ついた角膜の治療は、再上皮化を防止し、質的細胞死を生じ、組織化されていないマトリックスと、毒素がアッセイした濃度で治癒を促進しないことを示唆する。
結論として、この手順を試みている間、それは地球に浸透しないように、切断しながら、組織に平行にブレードを維持することを忘れないでください。このアッセイでは、化学熱傷や上皮の擦り傷を含む異なる創傷技術を採用することができる。また、上皮が治癒するかどうか、そしてどの速度で治癒するかを判断するために、薬物毒性アッセイに使用することができます。
これは、あなたの生体内創傷治癒研究に先立って可能なコスト削減ex vivo、臓器培養モデルシステムです。
