動物モデルにおける薬物の有効性を理解することは、コストと労力を要する。ex vivo組織の外植モデルを使用する我々のプロトコルは、研究を行うために必要なコストと科学的人員の両方の面で有意に低い。この技術の主な利点は、他のいくつかの小さな動物モデルとは対照的に、人間の目に非常に似た解剖学と生理学を持つブタの目の使用です。
我々は、インビトロで薬をテストするとき, 彼らは動物や人間のモデルに存在する可能性があります有効性を示す可能性があります。.Ex vivo組織システムは、私たちのインビトロシステムが動物およびヒトの試験に翻訳できるかどうかを理解するための最良の方法です。豚の角膜システムは、労働集約的ではないが、薬物を単離、維持、感染、および治療するための訓練可能なスキルを必要とし、特にブタの目全体から角膜を単離するプロセスは言葉で表現するのが難しいが、視覚的なデモンストレーションが必要である。
適切なベンダーからブタの目を受け取った後、加工するまで氷の上に組織を保管し、適切な個人保護具を置きます。作業領域を70%エタノールで消毒し、ベンチカバーをワークスペースに固定します。作業領域の準備ができたら、50ミリメートルのガーゼに目を置き、ガーゼを使って片手で後部セクションをつかみます。
30ゲージ針を使用して、目の上皮表面の中心近くに1回の穿刺を慎重に行い、間質を損傷しないように注意し、角膜から1ミリメートルの距離でスクレラに小さな切開を行うために鋭い滅菌ブレードを使用します。手の迅速かつ滑らかな回転作用を使用し、ビトリスユーモアが漏れないように注意し、角膜の端を切断し、角膜スクレアエッジで角膜を平らなツイーザーで保持し、ブレードを使用して残りのテザリング膜を切断します。各角膜が単離されると、組織は1ウェルあたり2ミリリットルの角膜培地を含む12ウェルプレートの個々の井戸に上に置き、17 GFPウイルス溶液の5番目のプラーク形成ユニットに5マイクロリットルを各角膜表面の破片状の部位に加える。
すべての角膜が採取されたら、プレートを摂氏37度、5%の二酸化炭素インキュベーターを72時間置き、実験で使用されていない追加の目に10%漂白剤をスプレーしてバイオハザードバッグで安全に処分します。薬物を添加する前に毎日、角膜のプレートをステレオ顕微鏡の下に置き、GFPフィルターと500マイクロ秒の暴露時間を選択します。ウイルスの広がりと樹状突起のすべてが明確に視覚化されるまで、一連の増加する倍率で角膜をイメージングする前に、最も低い倍率で画像をキャプチャします。
すべての角膜が画像化されたら、プレートを組織培養インキュベーターに戻します。感染前日、コンフルエントベロ細胞培養を1回1回10ミリリットルのPBSで2回洗浄し、摂氏37度で5〜10分間、1回0.05%トリプシンを1ミリリットルで処理する。細胞が剥離したら、9ミリリットルの培地を使用して、細胞がフラスコ表面から完全に外れ、得られた細胞懸濁液を15ミリリットルの遠心分離管に移すことを確認します。
新しい6つのウェルプレートの各ウェルに300マイクロリットルの細胞を加え、次に各ウェルに2ミリリットルの培地を加え、一晩細胞培養インキュベーターにプレートを入れます。翌朝、定量のために各角膜からウイルスを採取し、無菌綿棒先端をバイオセーフティキャビネットの複数のマイクロ遠心分離管に綿棒当たり500マイクロリットルで少なくとも5分間浸す。インキュベーションの終わりに、感染したブタの角膜培養物をキャビネットに入れる。
湿った綿棒を使用して、過度の圧力を加えることなく、各感染したブタ角膜の中心から3回転を時計回りに、反時計回りに5ミリメートル回転させます。一連の回転の終わりに、その無血清培地で各綿棒を時計回りに、反時計回りにマイクロ遠心チューブを回し、綿棒を切断して、先端が蓋を閉じた状態で各チューブ内に収まるようにします。すべての角膜がスワッピングされたら、1分間高速でチューブを渦盛りします。
各角膜から採取したウイルスの量を定量化するために、マイクロ遠心分離チューブ中の無血清培地中のウイルスの1倍の丸10倍希釈を調製し、10倍から負の8に達するまで調製する。各ウェルの細胞から増殖培地を吸引した後、各ウイルス希釈の1ミリリットルを1回から10回から負の3個のメッキ細胞単層に移し、感染した細胞を細胞培養器に2時間置く。インキュベーションの終わりに、72時間のインキュベーションのために、またはプラークの形成が観察されるまで、各ウェルにメチルセルロースを含む培地の2ミリリットルを追加する前に、PBSでそれぞれをよく2回静かに洗います。
プラーク観察時に、各ウェルの隅に1ミリリットルのメタノールをゆっくりと加え、室温で15分間インキュベーションします。インキュベーションの終了時に、細胞単層を乱すことなく各ウェルから内容物をゆっくりと吸引する。次に、各々に1ミリリットルの結晶紫色の働き溶液を用いてラベルを付け、すべての細胞が光から保護された30分間のインキュベーションのために覆われていることを注意してください。
インキュベーションの終わりに、溶液を捨てて吸収性紙の上にウェルを乾燥させ、次に最も高い希釈ウェルでプラークの数を数え、開始溶液中のウイルス含有量の合計を3回定量化する。この立体蛍光イメージング解析で観察されるように、BX795の抗ウイルス効果は、ウイルス拡散を制御するTFTのそれと同様であり、車両で処理された角膜は、最初のウイルス接種後6日までに中央感染ゾーンから周辺へのウイルスの広がりを示すのみである。同様に、感染後2日目および4日目に採取した眼綿棒は、陽性対照およびBX795処理サンプルにおいてウイルスの完全な阻害を示し、一方、感染性ウイルス力素の急激な増加は陰性対照サンプルで観察される。
ブタの眼全体からのブタの角膜の分離は最も重要なステップです。手順 2.3 ~ 2.6 は、このプロセスで最も重要です。我々のモデルは、ブタ角膜におけるウイルスの樹状拡散を理解するために使用することができる。
この方法は、細菌および真菌感染症に向けて拡張することができます。この方法は、ヒトモデル外の角膜におけるウイルスの樹状拡散を可視化するのに役立った。このモデルは、動物およびヒトの試験に向かう前に薬物の有効性をテストするのに役立ちます.
