角膜上皮の機械的および化学的損傷のためのEx Vivoおよびin vivo動物モデル

機械的および化学的角膜損傷を研究するために、生体外および生体内動物モデルが設定されました。この技術は、研究者が角膜の機械的および化学的損傷を研究するための簡単に構築できるプラットフォームを提供します。マウス角膜上皮創傷を作成するには、皮膚生検パンチを使用して麻酔をかけたマウスの中央角膜に印を付け、創傷の十分に制限され、十分に測定可能な領域を確認します。

中央の角膜の上にパンチをそっとインデントして円形のマークを残します 角膜上皮をボーマン層までデブライドします ボーマン層を傷つけないように0.5ミリメートルのバリを備えたハンドヘルド角膜錆リングリムーバーを使用します。角膜鉗子で創傷縁の残りの緩い組織を取り除きます。フルオレセイン紙に生理食塩水を滴下してフルオレセインを溶解し、フルオレセイン含有液滴をマウス上皮欠損部に置き、コバルトブルー光下で可視化することにより、蛍光染色による創面切除領域を確認します。

マウス角膜擦過傷創傷モデルのex vivo培養を、安楽死させたマウスの上眼窩縁と下眼窩縁を軽く押して眼球を押し出すことにより進めます。閉じた角膜はさみの先端を下眼窩壁に沿って球後腔に導入し、眼球を貫通しないようにします。0.3ミリメートルの角膜鉗子で眼球をしっかりと保持し、次に角膜ハサミで視神経と眼窩周囲軟部組織を切断して眼球を隔離します。

マウス眼球のex vivo培養では、ウェル内に溶かしたワックスを入れた48ウェルプレートを用意し、固化するのを待ってから、結膜鉗子の先端で固化したワックスの表面に丸い穴を開けて眼球を収容します。採取した眼球を、ワックスで覆われた底部と側壁を備えた48ウェルプレートに直接置き、安定化を確立します。研究の目的に応じて、抗生物質の有無にかかわらず1%ウシ胎児血清を含むDMEMで眼球を培養します。

眼球を浮かせずに眼球表面を培養液に浸し、フルオレセイン染色とコバルトブルー光の下でデジタルカメラで写真を収集することにより、創傷治癒の経過を記録します。アルカリ熱傷を誘発するには、直径8ミリメートルの円形のろ紙をペトリ皿に入れます。スポイトを使用して、0.5通常の水酸化ナトリウムをペトリ皿に加えてろ紙を浸し、ろ紙から余分な溶液を排出してから、麻酔をかけたウサギの角膜に置きます。

蓋鏡でまぶたを開いた後、ウサギの硝化膜がろ紙の挿入を妨げていないことを確認し、アルカリに浸したろ紙を中央角膜に30秒間置きます。ろ紙を取り除き、眼の表面を10ミリリットルの生理食塩水ですすぎ、アルカリ物質を洗い流します。角膜欠損を完了するには、角膜錆リング除去剤を使用して、不透明領域内の角膜上皮をボーマン膜までデブライドします。

コバルトブルー光下でフルオレセイン染色で創面切除部を確認し、角膜鉗子を用いて角膜上皮の残留を除去します。足根炎で創傷状態を確保するには、硝子体膜が眼表面と鼻側の角膜上皮欠損を滑らかに覆っていることを確認します。眼の表面を保護し、ウサギがそれを引っ掻くのを防ぐために、6-0縫合糸を使用して局所剤の有無にかかわらず一時的な足根吸引を行い、足根骨の縫合糸が上下のまぶたの縁から3〜4ミリメートルにあり、ウサギが縫合糸を壊さないように4〜5本のネクタイと長い結び目があることを確認します。

マウス角膜上皮のex vivo創傷治癒モデルでは、フルオレセイン染色陽性の軽度の角膜中心領域が、マウス角膜上皮のin vivo創面切除後2ミリメートルの中央に観察されました。ワックスコートされた48ウェル培養プレート上に固定されたマウス眼球のex vivo培養を、実体顕微鏡下で48ウェル培養プレート内で毎日検査し、記録した。マウス角膜上皮をデブライディングした翌日、コバルトブルー光下で得られたデジタル写真に直径2ミリメートルの円形フルオレセイン染色された上皮欠損が1つ明らかになりました。

ウサギの角膜上皮にアルカリ損傷を与えた後、中央角膜上にコバルトブルー光の有無にかかわらず、明確で完全な円形マージンでフルオレセイン染色の陽性が観察されました。辺縁部からはパンヌス内方成長を伴う角膜上皮創再上皮化が観察された。最も重要なステップは、マウスとウサギの角膜表面に滑らかで均一な上皮欠損を作成する手順です。

これらのプラットフォームで新しい医学的および外科的治療法をテストできます。再上皮化の効果は、処置後に監視することができる。このプロトコルの角膜新生血管と損傷後の混濁は、さらなる研究の満たされていないニーズです。