まず、金属メッシュを25 x 8ミリメートルのストリップにカットします。カスタマイズしたメッシュを滅菌容器とオートクレーブに2時間置きます。オートクレーブ後、滅菌容器と1.8ミリリットルのバイアルを層流ベンチの下に置きます。
滅菌容器を開けて、金属製のグリッドを取り外します。グリッドを1.8ミリリットルのバイアルのキャップに取り付け、バイアルを閉じます。ヒト卵巣皮質組織を採取した後、髄質を切除し、組織を希望の形状に切断します。
5ミリリットルのガラス固化溶液1を6ウェルプレートの最初のウェルに加えます。細胞ストレーナーを使用して、プレートのウェル1で卵巣皮質組織を5分間平衡化します。皮質組織と共に細胞ストレーナーを5ミリリットルのガラス固化溶液2を含むウェル2に移し、5分間平衡化する。
次いで、皮質組織を含むストレーナを、5ミリリットルのガラス固化溶液3を6分間含む6ウェルプレートのウェル3に入れる。準備したクライオバイアルに滅菌した液体窒素を入れ、液体窒素で満たされたクライオデュワー容器に入れます。組織サンプルをガラス化装置の金属グリッドに1分以内にロードします。
次に、グリッドベースのクライオバイアルの液体窒素に金属グリッドを挿入します。滅菌済み6ウェルプレートのウェル1に6ミリリットルの平衡溶液を加え、次に6ミリリットルのRSをそれぞれウェル2と3に移します。室温で1時間インキュベートします。
37°Cに設定された加熱プレート上で、滅菌サンプルビーカーで急速加温溶液を1時間温めます。層流ベンチの下で、ガラス化した卵巣皮質組織を含む凍結保存されたバイアルを開きます。メッシュを急温化溶液に迅速に移します。
滅菌鉗子を使用して、組織を平衡化溶液に移し、ロッキングシェーカーで3分間インキュベートします。次に、ロッキングシェーカーでRS1とRS2をそれぞれ室温で10分間洗い流します。カルセインを100マイクロリットルのDMSOに溶解します。
3マイクロリットルのカルセインを1.5ミリリットルのチューブの底に移し、摂氏マイナス20度で保存します。1.5ミリリットルのチューブに0.007gのコラゲナーゼを加え、マイナス20°Cで保存します。冷凍した3マイクロリットルのカルセインに997マイクロリットルのDPBSを加え、再懸濁してカルセインを溶解します。
次に、冷たいコラゲナーゼ粉末を加えて、1000マイクロリットルの作業溶液を得ます。次に、500マイクロリットルの作業用カルセイン溶液を加え、2ミリメートルの卵巣皮質断片の2つを4ウェル皿のウェルに移します。その後、光から保護しながら、摂氏37度で90分間インキュベートします。
最後に、蛍光顕微鏡下で、卵胞の生存率を決定します。
