このプロトコルは卵巣のマイクロ環境の深い検査のイン・バイ・イン・イン・バイ・ガン・ビユーザーが卵胞の成長と発達を決定することを可能にします, ステロイド生成と免疫分子の豊富さだけでなく、.この技術の1つの利点は、卵巣微小環境および新たな卵胞の変化を直接評価し、特定のホルモンの添加によって引き起こされるユニークな相互作用を評価する能力である。
この技術は、濾胞の逮捕を引き起こす様々な生殖障害を研究するために使用することができます。例えば、多嚢胞性卵巣症候群。私たちはインビトロで卵巣マイクロ環境を直接評価することができるので、この手順を実証することは、私の研究室の学部研究者ブルック・ベルです。
セリングされた顎の鉗子を使用して、卵巣を固定し、半分にスライスし、外側のスライスを取り除き始めます。1~2ミリメートルの表面深さを切り取って、髄質が採取されないようにします。メスで卵巣皮質の3〜4つの薄いストリップをカットし、3番目のPBS充填ペトリ皿にストリップを置きます。
スカルデルブレードで0.5〜1立方ミリメートルの小さな正方形の部分にストリップをカットします。ペトリ皿の下の定規を使用して、一貫した卵巣皮質片を作るために、同じような大きさと厚さを確認します。3つのPBSと抗生物質フィールドペトリ皿のすべてで卵巣皮質片を洗浄し、湾曲した先端鉗子を使用して洗浄間のピースを移動させます。
一連のLB-15洗い物を通して皮質片を動かし、最後のLB-15で満たされたペトリ皿に入れます。ふたに動物IDと卵巣側のラベルを付けます。卵巣ごとに4つの卵巣皮質片を収集し、日ゼロの神学のためにそれらを修正し、RNA精製のための追加の部分を凍結します。
残りの組織片を培養に使用する。最終的な組織洗浄および培養準備のための生物学的安全キャビネットを準備する。生物安全キャビネットに入れる前に70%エタノールで供給を消毒してください。
培養用のすべての卵巣皮質片を生物学的安全キャビネットに移動し、LB-15で満たされたペトリ皿でもう一度洗います。24ウェル組織培養プレートにウェイマス培地のピペット350マイクロリットル。コーティングされていない培養をよく挿入する鉗子を使用して、挿入物の基部の下に泡が形成されないようにする。
慎重かつ繊細にメッシュを穿刺することなく、各インサートのメッシュ上に4つの卵巣皮質片を配置します。5%の二酸化炭素で37°Cで組織をインキュベートします。卵巣皮質培養培地を7日間毎日変更し、事前に温めたウェイマス培地を使用するようにします。
中程度の変更の間、鉗子を使用してインサートをウェルからそっと持ち上げ、培養したウェイマス培地を0.5ミリリットルのチューブで回収します。インサートをウェルに戻し、挿入物の側面とウェルの間に分配することによって、新鮮な培養培地の350マイクロリットルを追加します。採取した培地を組織培養からマイナス20°Cで保存します。
7日間培養した後、カメラを取り付けた解剖顕微鏡とコンピュータイメージングソフトウェアプログラムを使用して卵巣皮質片を画像化します。図表に含まれるブインの溶液で1つの卵巣皮質片を修正し、液体窒素中の卵巣皮質片にフラッシュフリーズしてcDNAのRNAを得る。組織とすべての井戸のためにこのステップを繰り返し、7日目から培地を収集し、マイナス20度保存します。
卵巣皮質片を約1.5時間ブインの溶液に浸したままにしてから、70%エタノールで3回洗浄し、組織を70%エタノールに保ち、溶液が黄色でなくなるまで毎日それをクリアします。ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、原胞卵胞、初期の一次卵胞、一次卵胞、二次卵胞および骨根嚢に対して行われた。卵胞ステージングは、卵胞形成を評価するために培養前および次の培養物に対して固定された卵巣皮質に対して行われた。
コラーゲン沈着によって決定される形態の違いは、階段ステップまたはコントロールハイファーからの卵巣皮質における線維症を示すことができる。コントロールと階段ステップハイファーの間で満たされた卵巣皮質あたりのピクロシリウス赤陽性染色の平均領域の比較がここに示されています。毎日の培養培地の収集は、様々なステロイドホルモン産生を評価するために3日間にわたってプールし、放射性免疫アッセイを用いた。
ステロイド代謝物およびサイトカイン産生はまた、4日間にわたって培養物をプールした動物ごとに1つのウェルから卵巣皮質培養培地で測定した。組織が座っている時間が長ければ長いほど、一緒に作業するのが難しくなります。正確なカットを練習する必要があるかもしれません。
この技術は、過剰なステロイド生成を救助するシグナル伝達経路への影響を理解し、過剰なステロイドがサイトカインおよびケモカイン産生に及ぼす影響を決定し、卵巣組織内の卵胞の進行または逮捕に及ぼす影響を決定するために使用される。
