このプロトコルは、動物種の生殖能力と生物多様性の保存に不可欠なガラス化と呼ばれる凍結保存技術を通じて、ネコ卵母細胞の長期的な保存に有用である。ガラス化の主な利点は、液体窒素が利用可能な場合、17分未満で完了することができるので、その速度とフィールド条件での実現可能性です。飼い猫は野生の絶滅危惧種のネコの実行可能なモデルです。
凍結保存プロトコルの開発と最適化により、ネコ保護プログラムのためのテレットバイオバンクを確立することができます。1 列に 3 つの円錐形のウェルを持つ Repro ガラス化プレートを準備します。第1ウェルに平衡液20マイクロリットル、2番目と3番目のウェルに300マイクロリットルのガラス化溶液を加えます。
積雲卵母細胞複合体、またはCOCを平衡化するには、小孔ピペットを使用して、1つ以上の複合体を第1ウェルの底部に移す。ゆっくりと20マイクロリットルの平衡溶液を落下の境界に加え、3分間待ってから、さらに240マイクロリットルの平衡溶液を加え、9分間待ちます。待っている間、液体窒素の箱を準備し、実験または猫の識別コードでガラス化のサポートにラベルを付けます。
箱と支をステレオ顕微鏡の近くに置きます。COCを平衡化した後、90秒未満でガラス化を行います。COCsをビトリフィとして、小ボアピペットに第2ウェルのガラス化液を充填します。
最初のウェルの底からCOCを取り、2番目の井戸の表面に移動します。ガラス化溶液でピペットを洗浄し、COCをウェルの別の領域に移動させ、周囲の溶液を混合します。ウェルの別の領域からの溶液でピペットを充填します。
COCを動かし、周囲のミディアムをピペットと混ぜます。このプロセスをもう一度繰り返します。次に、3番目のウェルからガラス化溶液でピペットを洗浄し、それを使用してCOCsを3番目のウェルの底に移動させます。
ここでも、周囲の溶液を混ぜます。配管を別のウェルの領域から溶液で満たした後、COCsを動かし、溶液を混合します。このプロセスを繰り返します。
ピペットチップにウェルの別の領域からのガラス化溶液を充填し、それを使用してチップに近いガラス化支持体のストリップにCOCsをロードし、余分な培地を吸引します。すぐに液体窒素中のガラス化支持を突き落とし、クランプを使用して閉じ、浸漬したままであることを確認します。ロードされたガラス化サポートをゴブレットに保管し、加温するまで貯蔵液窒素タンクに保管してください。
熱の段階をステレオ顕微鏡の近くに置き、38°Cにします。ステージの上にペトリ皿の蓋を温め、その後、ガラス化支持体を貯蔵タンクから液体窒素付きの箱に移します。各ガラス化支持体を温めるごとに、Reproプレートの1列を用意します。
第1ウェルに300マイクロリットルの希釈液を加え、300マイクロリットルの洗浄液を第2および第3の井戸に加えます。解凍液をインキュベーターから取り出し、ペトリ皿の蓋に100マイクロリットルを落とします。クランプを使用して、液体窒素の内部でガラス化支持体を開きます。
ペトリ皿の蓋をステレオ顕微鏡の下に置き、ガラス化支持体を素早く拾い上げ、ストリップをドロップに浸し、すべてのCOCsが切り離されるまで動かします。サポートが空になるとすぐにドロップからサポートを削除しますが、COC は 1 分間解凍ソリューションに残します。ピペットに希釈液を充填し、それを使用して、融解液の低下から希釈液の底部にCOCsを移動させます。
COCは3分間そこに置いておきます。2番目の井戸から洗浄液でピペットを洗い、その後、COCsを取り、第二の井戸の底にそれらを移動します。5 分間待ちます。
ピペットを3番目の井戸から溶液で洗い、それを使用してCOCを第2ウェルから第3ウェルの表面に移動させます。COCが3番目の井戸の底に触れるのを待ちます。次に、別のウェル領域でプロセスを繰り返します。
完成したら、培養液でピペットを洗い、卵母細胞を培養皿に移します。このプロトコルに従って、大多数のジテが卵母細胞のガラス化と温暖化の後に生き残る。フルオレセイン・ジアセテートとヨウ化プロピジウムで染色された生き生きとしたガラス化された温めたネコ積雲卵母細胞複合体の代表的な画像をここに示す。
この表は、体外成熟を目的とした卵母細胞の温暖化後のデータを示すガラス化後の生存率を示しています。435の卵母細胞のうち、395人が生き残り、全体の90.8%の温暖化後の生存率を獲得しました。しかし、いくつかの形態学的変化は、温暖化後に気づくことができます。
最も頻繁な形態異常は、卵形の形状および造粒、積雲細胞の部分的または時には全損失、および透明帯骨折の変化である。この手順を試みる際には、使用前に適切な温度になるようにメディアを事前に準備し、細胞毒性を避けるためにプロトコルの温度とタイミングに従うことを忘れないでください。このプロトコルは、他の種の卵母細胞にも適用できます。
成功すれば、絶滅の危機に瀕しているネコの生物多様性保全のための胚芽プラスムバンキングにも貢献する可能性があります。
