我々は、彼らの共焦点顕微鏡にアクセスするためのテクニックと博士ふみ小野研究室の初期設定中にそれらの援助のためにマイケルフェデーとテレルホロウェイに感謝します。この研究は、NIAAAとNINDSの学内プログラムを通じて国立衛生研究所によって資金を供給された。

1。 DII /タングステンビーズ箇条書きの準備 ：DII（1 - 1&#39; -オクタデシル- 3、3,3&#39;、3&#39; - tetramethylindocarbocyanine過塩素酸塩）弾丸は脳のスライスを切るのを事前に準備する必要があります。手順は、一度に用意されているどのように多くの弾丸に応じて、約2〜4時間かかります。 <ol><li>タングステンのビーズの新しいバッチから開始した場合、300mgをそれぞれのアリコートを準備。アリコートを、塩化メチレン2ml中にタングステンの6グラムを中断することによって調製される。 300mgのタングステンビーズのアリコートを生成するし、ピペット微量遠心チューブにビーズ溶液100μl室温で保管のアリコート（ 注 ：。塩化メチレンは非常にすぐに蒸発アルコールが蒸発を最小限に抑えるためにも使用できます ）。。。 </li><li>ビーズのアリコートから起動するとき、塩化メチレン、300μlの各アリコート（300mgのタングステンビーズを）再懸濁し、蒸発を防ぐために迅速にカバー。この量は、弾丸の3バッチには十分です。 </li><li>親油性色素のDIIの13.5 mgを秤量し、塩化メチレンの450μlの（最終濃度=3mg/100μl）を追加することにより、色素溶液を準備します。 </li><li>染料でコーティングビーズを。の部分にスライドガラスを置き、ワックスコーティングしたスライド上にビーズの紙とピペット100μlの重量を量る。ビーズは、薄い灰色を回すまではDIIの溶液100μlを追加、ピペットチップ、そして空気乾燥を使用してよく混ぜる。 </li><li>ガラススライドからビーズをこすりして微粉末にビーズをダイシングするためにカミソリの刃を使用してください（ 注 ： 染料を汚染しないように、弾丸の複数の色を行う場合は、新しい刃を使用 ）。。 </li><li> 15 mlコニカルチューブに紙と漏斗ビーズの重さにビーズをこすり落とす。水3 mlを加え室温で10〜30分間、水浴中で超音波処理（ 注 ： 粉体および超音波処理のダイシングは、個々の神経細胞の疎なラベリングを中断させコーティングされたビーズの塊の形成を最小限に抑えるために適用される）。。 </li></ol> 2。ポリビニルピロリドン（PVP）ソリューションとチューブの準備：弾丸のチューブ（TEZFELのチューブ）にビーズの添付を改善するには、コートには、ポリビニルピロリドン（PVP）溶液で。 <ol><li> 10mgのPVP / mlの濃度で水にPVP溶液10mlを準備します。 </li><li>もう一方の端を、それを追放して弾丸のチューブを通してPVP溶液を渡すためにチューブのアダプタ付き12mlの注射器（少し大きめの直径を持つフレキシブルチューブ）を使用して。いくつかのバッチが同時に準備されている場合のコートより多くの弾丸のチューブにソリューションを再利用。使用後はPVP溶液を捨てる。 </li><li>弾丸のチューブにビーズを追加するには、ボルテ​​ックス均質な溶液を生成し、そのビーズが均一にチューブ全体に分散されるようにチューブを介してビーズ溶液を引くために注射器を使用するビーズ。 （（注：）チューブ内の気泡の数を最小限に抑えるようにしてください ）。 </li><li>準備局を介してチューブを供給し、ビーズが沈殿することができます。唯一のビーズが残るように軽く水を除去するために注射器を使用してください。 </li><li>水滴が表示されなくなるまで準備ステーションと窒素ガスと乾燥でチューブを回転させる。このステップでは、約10-20分かかります。 </li><li> DRIERITEまたは無水硫酸カルシウムのようなものを含むシンチレーションバイアルに13mmの長さと所定の位置にチューブカッターで弾丸を切る。光から保護するためにホイルでバイアルを包みます。 </li></ol> 3。 DIIは、染色：この標識法は多様な種からの脳組織で神経細胞を染色するために使用することができ、この特定のケースでは、マウス（旧3月6日の月）とヒト以外の霊長類（9-15歳）から。 それは組織保存はこの状態で最良になることが予想されるので、スライスが固定溶液の経心臓的灌流によって得られる固定脳組織から調製することが好ましい。しかし、灌流による固定は必ずしも現実的ではない（のようなサルの組織の場合と同様）とDiOLISTICラベリングは、まだ正常組織の準備のためのさまざまな手続きの下で適用することができます。ここでは、組織の準備の3つの別の手順について説明します。 <ol class="lalpha"><li>経心臓的灌流による脳を修正する→10分→カットのスライス用に脳→postfixを削除→染色</li><li>脳→組織のカットブロック→修正のブロック→PBS→カットスライスで洗浄→汚れを取り除く</li><li>脳→カットスライス→修正→洗浄→汚れを取り除く</li></ol>本研究では、サルの脳をtranscardially氷冷の人工脳脊髄脳の収穫前に流体（ACSF）と尾状核を含む組織のブロック（厚さ4ミリメートル）で灌流した被験者から得られたND被殻は、室温で60分間固定した。すべての手順については、固定液は4％パラホルムアルデヒドとPBS（新鮮な準備または15日以内に使用される）の4％スクロースを含んでいます。固定時間は成功した染色ために重要であることに注意することが重要です。 Overfixationは原形質膜の完全性を破壊し（結果は下のより多くの情報を参照してください）​​細胞外に漏出する色素を引き起こすことによって染色に影響を与える可能性があります。 <ol><li>手順についてはa と b は 、スライス（200μmのは）固定された脳または組織ブロックとPBSで24ウェルプレートに配置されたスライスからカットされています。手順cには 、新鮮な急性脳スライス（200μm）を含有する冷加工溶液（mMで）110コリン- Clを、25のNaHCO 3、1.25ビブラトームで切断されているのNaH 2 PO 4、2.5のKCl、0.5 CaCl 2で 、7のMgCl 2は 、25グルコース、11.6アスコルビン酸、3.1ピルビン酸（浸透圧= 310 mOsmols）とすぐにスライスした後、24ウェルプレートに入れ、室温で固定液で30分間固定されています。 </li><li> PBSでのスライス、3回洗浄する。 </li><li>撮影スライスする前に、井戸からPBSを除去して、ペイントブラシを使用して、ウェルの中央のスライスを配置します。 </li><li>サンプルとバレルの端の間に1.5cmの距離で銃を置くことによって120から180 psiのヘリウムガスの圧力でヘリオス遺伝子銃システムを使用して3.0μmの濾紙でDIIの弾丸を撃つ。 （ 重要な注意 ：これは、洗浄中にしてマウントするための面を上にスライスの同じ側を保つことが重要であるので、スライス面の50mm以内のみのニューロンは、このメソッドによってラベルが付けられますこの方法では、あなたがそのことを確認します。時共焦点顕微鏡とイメージング標識したニューロン）は焦点距離になります。 </li><li> PBSで3回のスライスを洗浄し、DIIは、樹状突起に沿って広がるようにするいくつかの時間のためにPBSに格納します。 </li><li>ゴールドの退色を延長するとスライドガラスの上にスライスをマウントし、18 × 18ミリメートル1号カバースリップでカバーしています。 （ 注：手順cに、それは、スライスの整合性がよく一晩維持されていないのと同じ日にスライスをマウントするのが最善です ）。 </li><li>メディアが乾燥した取付け後の明確なマニキュアとシール。 </li><li>また、スライスは、後述するようにマウントする前に抗体で染色することができます。 （ 注：4℃で暗所に保存されている場合スライドは、年間に少なくとも6ヶ月を使用することができます℃のDIIは敏感な光と光への長期暴露なのはフェードする汚れの原因となります ）。 </li></ol> 4。抗体染色：免疫染色は、手順3.4の後に、取付の前に実行する必要があります。 <ol><li> 透過性：0.01％でインキュベートスライストリトンX - 100室温で15分間、PBS溶液（ウェルあたり300〜500μL）であった。 注記：これは、DIIを溶解し、大幅に蛍光染色を低減するように界面活性剤の高濃度を使用しないでください。豊富なインキュベーションもDIIのラベリングを削減するように洗剤で時間を最小限に抑えるようにしてください。拡張インキュベーションが必要な場合は、ブロッキング溶液でPBSでスライスを保つのではなく。 </li><li> ブロッキング：室温で30分間PBSで10％ヤギ血清、0.01％トリトンX - 100を含むブロッキング溶液でインキュベートスライスを。 </li><li> 一次抗体：ブロッキング溶液（1:1000希釈で、例えばウサギ抗GFP抗体）の所望の希釈率で抗体を追加する。ウェルあたり300から500μlを加え、1〜2時間インキュベートする。 （ 注 ：一晩のインキュベーションが必要な場合は、ブロッキング溶液から界面活性剤を除去 ）。 </li><li> 5のためにPBSで切片を洗浄してください - 15分、3回。 </li><li> 二次抗体：室温で30分間二次抗体でインキュベートする。ブロッキング溶液で目的の希釈（1:1000希釈などのAlexa - ® 488コンジュゲート抗体）で二次抗​​体溶液を準備します。 </li><li> 5〜15分間、4回PBSで切片を洗浄してください。 </li><li>ゴールドの退色を延長し、18 × 18ミリメートル1号カバースリップでカバーしてスライド上のスライスをマウントします。マウントメディアが乾燥した後にマニキュアで密封する。 </li></ol> 5。代表的な結果： <ol><li> 正しいラベルをチェック ：セクションは、水銀ランプと成功DiOLISTICラベルを確認するために赤色蛍光フィルターキューブを装備した蛍光解剖範囲下で可視化することができます。図1は、低倍率で得られた素敵なラベルが付いた脳切片の典型的な画像を示す。を探すために2つの重要な特性は、疎なラベリングパターン（図1A）と個々の細胞成分を（図1B - C）を識別する能力です。 </LI&gt; <li> トラブルシューティングDiOLISTICラベル ：図2は、DiOLISTICラベルが誤って働いているセクションの例を示します。我々の経験では、非効率的な標識のための3つの主な原因が考えられます。 <ul><li> ラベルには、あまりにも希薄または密である ：非常に少数の細胞があるケースではセクションごとにラベルが付いていますかあまりにも多くの細胞が分離し、単一細胞内の要素の研究を防止ラベルが付いています。解決策：コーティングTEFZEL弾丸のチューブ（1.6節）に使用される最終的な解決策でコーティングされたビーズの濃度を調整する。それぞれ、あまりにも疎すぎたり密ラベルを補正するために、ビーズを溶解するために使用される水（3ml初期値）の音量を増減する。セクション上にコーティングされたビーズを撮影する場合に加えて、ラベリングの低効率は、最適なガス圧よりも小さいことが原因であると考えられます。この可能性はTEFZEL弾丸のチューブがコーティングされたビーズのほとんどをリリースしていると、それは撮影後に明確に表示されていることを確認することで除外することができる。そうでなければ、撮影のためのガス圧を大きくする必要があります。 </li><li> 悪い弾丸 ：染料でコーティングされたタングステンのビーズの大きな塊またはクラスタは、弾丸の準備中に形成される。のセクションでは、図2A - Bの例のようになります。解決策：セクション1.5と/に特に注意を払って新たな弾丸を作るか、またはセクション1.6で超音波処理時間を延長。 </li><li> オーバー固定 ：組織は、固定のための最適な必要な時間（200〜300μmのセクションのための30分、4 mmのセクションの1時間）より長くパラホルムアルデヒド溶液中に保持されます。これは、原形質膜の完全性が損なわれますし、細胞の外色素の分散による焦点外と思われるラベルに図2C - Dに示されているもののように見えるというラベルのセクションを生成します。解決策：固定時間を短縮。 </li></ul></li><li> 共焦点イメージング：画像のスタックは、全細胞と樹状突起セグメントの63x水浸対物レンズ用20倍対物レンズと共焦点顕微鏡（Zeiss LSM 510 META）を使用して取得されています。 DIIは、488 nmのレーザーラインを使用して、興奮した二次抗体からDPS 561 nmのレーザーラインと緑色の蛍光を用いて興奮していた。共焦点顕微鏡を使用するときに達成された試料の光学セクショニングはさらに、サンプル内の単一標識細胞の分離することができます。図3Aは、マウスの脳とその複雑な樹状突起の分岐パターンから線条体中型有棘ニューロンを示しています。げっ歯類（図3B）および非ヒト霊長類（図3C）からこれらのニューロンの樹状突起の枝の高倍率の画像は、両方の種にこの手法を用いて樹状突起と樹状突起棘の染色の程度を示す。長く、細い背骨中型有棘ニューロンのように豊富なヘッドを考慮しても樹状突起とその突起（スパイン）も、定義されて表示されます。 免疫染色でDiOLISTICSを組み合わせるときに、共焦点イメージングは​​、明確に同一の焦点面と同じセルに汚れをローカライズするにも便利です。図4は、単一のセルでGFPのラベリングと免疫染色DIIの共局在の例を示しています。画像は、D1ドーパミン受容体のプロモーター下に蛍光タンパク質GFPを発現するトランスジェニックマウスから線条体スライスから得られたつのスタック（0.7μmのZ -セクション）です。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。ヒト以外の霊長類の脳スライスの神経細胞のDIIのラベリング。 （）DIIを持つ神経細胞の疎なラベリングを示していますカニクイザルから尾状核を含む染色した脳切片の低倍率画像。（BC）絶縁中型有棘ニューロンは、簡単に蛍光解剖スコープを使用して識別することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。トラブルシューティングDiOLISTICラベリング。背側サルの線条体（）とマウス（B）染料でコーティングされたビーズの大きな塊を示し、結果として、何個々の細胞の要素を区別することはできませんから（AB）ステンドスライス。（CD）DiOLISTIC適用した結果を例示する画像時間や場所サル（C）およびマウス（D）組織に障害が発生した組織保存の長期間固定液に保管されたセクションへの標識。 <img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。DIIで染色された線条体中型有棘ニューロンの共焦点画像。 （A）、細胞全体の画像のスタックは（BC）デンドライトセグメントは、マウスから。樹枝の形態学的解析を可能にする（B）およびサル（C）中型有棘ニューロンは樹状突起と棘の明確なラベルを見せる。 <img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。免疫染色でDiOLISTICラベルの組み合わせ。 （A）DIIは、ラベルが付い<strong&gt; D1ドーパミン受容体のプロモーター下にGFPを発現するBACトランスジェニックマウスの線条体からの中型有棘ニューロン。Leeらから適応の方法で説明したように（B）免疫染色は抗GFP抗体を用いた。 （2006年）。赤色と緑色蛍光のA.（C）コンポジット映像と同じフィールドには、GFP陽性ニューロンとしてDII標識ニューロンを識別します。

<ol>
	<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+"DiOLISTIC"+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor "DiOLISTIC" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system.">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harb Protoc. , pdb.prot5202-pdb.prot5202 (2009).</li><li>Grutzendler, J., Tsai, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+labeling+of+neuronal+populations+by+ballistic+delivery+of+fluorescent+dyes.">Rapid labeling of neuronal populations by ballistic delivery of fluorescent dyes.</a> Methods. 30, 79-85 (2003).</li><li>Lee, K. W., Kim, Y., Kim, A. M., Helmin, K., Nairn, A. C., Greengard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocaine-induced+dendritic+spine+formation+in+D1+and+D2+dopamine+receptor-containing+medium+spiny+neurons+in+nucleus+accumbens.">Cocaine-induced dendritic spine formation in D1 and D2 dopamine receptor-containing medium spiny neurons in nucleus accumbens.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 3399-3404 (2006).</li><li>Matsubayashi, Y., Iwai, L., Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+double-labeling+with+carbocyanine+neuronal+tracing+and+immunohistochemistry+using+a+cholesterol-specific+detergent+digitonin.">Fluorescent double-labeling with carbocyanine neuronal tracing and immunohistochemistry using a cholesterol-specific detergent digitonin.</a> J Neurosci Methods. 174, 71-81 (2008).</li><li>Neely, S. t. a. n. w. o. o. d., Deutch, G. D., Y, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+diOlistic+labeling+with+retrograde+tract+tracing+and+immunohistochemistry.">Combination of diOlistic labeling with retrograde tract tracing and immunohistochemistry.</a> J Neurosci Methods. 184, 332-336 (2009).</li><li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diolistics:+incorporating+fluorescent+dyes+into+biological+samples+using+a+gene+gun.">Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun.</a> Trends Biotechnol. 25, 530-534 (2007).</li><li>Shen, H. W., Toda, S., Moussawi, K., Bouknight, A., Zahm, D. S., Kalivas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+dendritic+spine+plasticity+in+cocaine-+withdrawn+rats.">Altered dendritic spine plasticity in cocaine- withdrawn rats.</a> J. Neurosci. 29, 2876-2884 (2009).</li></ol>

すべての動物の手順は、NIAAAとオレゴン国立霊長類研究センターの動物実験委員会からのガイダンスにしたがって行った。著者らは、開示することは何もない。

DiOLISTICラベリングは、それが多様な種から、幅広い年齢層に、そして組織に組織切片に適用することができるため、蛍光標識する細胞のための、最も汎用性の高い技術の一つである（また、ガンらを参照して新鮮なまたはからの固定液で灌流動物を取得。、2009）。プロセスは、1〜2日かかるので、比較的高速であり、そのような免疫染色（Lee ら 、2006）など、他の多くの古典的なラベリングの手法と組み合わせることができます。これらは、親油性膜の整合性を構成すると色素が細胞外に漏出してしまうので、特別な注意は、固定およびインキュベーションのソリューションで高い界面活性剤濃度を使用するよりも避けるために注意を払う必要があります。抗体の浸透は、トリトンX - 100（Lee ら 、2006）、ならびにインキュベーション溶液中のジギトニンまたはサポニン（松林ら 、2008）の低濃度で促進することができる。この手法に適用できるいくつかの修正は、ガンら （2000）または抗体の曝露（ニーリーら 、2009）の長さと種類を変更することで説明され、複数の色素を持つ弾丸の使用を含む。 伝統的に、DIIは、脳内の神経突起をトレースするために使用されています。 DiOLISTICラベリングは、細胞の形態を調べるために有用な方法を記述することによって、そのアプリケーションを拡張します。神経形態は大きな関心のために脳と細胞の形状は、神経系の神経集団の機能の多様性に反映させるかもしれないという憶測に見られるような大きな多様性である。その一例としては、哺乳類の神経系のディスプレイの小さな突起の多くのニューロンはグルタミン酸作動性シナプスの部位である樹状突起と呼ばれるという事実です。この方法では、セル上にグルタミン酸作動性シナプスの密度は、本明細書に記載の標識法を用いて測定することができる樹状突起棘の密度、に相関させることができる。さらに、そのような樹状突起全体の長さ、分岐パターン、樹状突起棘の形状や密度などの他の形態学的パラメータが定量化し、研究することができる。 それは、より高い分解能共焦点イメージングを可能にするため、明視野顕微鏡（例えばゴルジ染色）に依存する従来の技法と比較すると、神経形態を研究するための蛍光標識の使用は、多くの利点があります。樹状突起棘の密度や形態を測定することを目的とした実験では、蛍光体としてDIIを使用してのもう一つの利点は、その親油性の特性です。 DIIは、細胞膜に分割し、神経突起と樹状突起の明確に定義された概要を提供します。ほとんどの樹状突起棘（1未満フェムトリットル）の少量を考えると、膜の染色は、より効率的であり、細胞質染色よりも小さく、細い突起のよりよい視覚化することができます。

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1-1&#x2019;-dioctadecyl-3,3,3&#x2019;,3&#x2019;- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D-282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methylene chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
<td>H485-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tungsten beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2269</td>
<td>1.7 &mu;m diameter</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyvinylpyrrolidone </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>529504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tefzel bullet tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2441</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing cutter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2422</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helios Gene Gun</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2431</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isopore membrane filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>TSTP02500</td>
<td>3.0 &mu;m pore size</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold Antifade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alfa Aesar</td>
<td>30525-89-4</td>
<td>(16% w/v)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

diolistic labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices

DiOLISTIC染色は、脳スライスの神経細胞（。。オブライエンとラミス、2007;。ガンら 、2000ガンら 、2009）に、そのようなDIIなどの蛍光色素を、導入する遺伝子銃を使用しています。ここではテクニックを設定するときに役立つのはいいと悪い結果の典型的な画像と一緒に必要な各ステップの詳細な説明を提供しています。我々の経験では、いくつかの手順はDiOLISTICSの成功したアプリケーションの重要な証明。これらの考慮事項は、DIIでコーティングされた弾丸の品質、固定剤曝露の程度、およびインキュベーションのソリューションで使用される界面活性剤の濃度が含まれています。一般的な問題に関するヒントと解決方法が提供されています。 これは、幅広い年齢層に複数の動物種に適用できる汎用ラベリング技術です。彼らは、蛍光遺伝子の発現に依存しているため、若い動物からの準備に制限、あるいはマウスに制限されている他の蛍光標識技術とは異なり、DiOLISTICの標識は、すべての年齢、種や遺伝子型の動物に適用することができますし、それと組み合わせて使用​​することができます細胞の特定の亜集団を識別するための免疫染色。ここでは、成体マウスと樹状突起分枝と樹状突起スパイン形態を定量化する目的を持つ成人の非ヒト霊長類の脳スライスの神経細胞をラベルするDiOLISTICSの使用方法を示しています。

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DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

我々は、齧歯類と異なる年齢のヒト以外の霊長類の脳スライスの神経細胞に、そのようなDIIなどの蛍光色素を、導入する遺伝子銃の使用を示します。この特定のケースでは、我々は、成体マウス（3-6ヶ月齢）と成人cynomologusサル（9-15歳）を使用します。もともと博士リヒトマン（ガンの研究室で記述されたこの技術、<em&gt;ら</em界面活性剤が低濃度に保たれている場合&gt;。、2000）、、よく分岐樹状突起と樹状突起スパイン形態の研究に適していると従来の免疫染色と組み合わせることができます。

げっ歯類からの神経細胞とヒト以外の霊長類の脳スライスのDiOLISTIC標識

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

diolistic-labeling-neurons-from-rodent-non-human-primate-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.8K ビュー.  NIH. 我々は、齧歯類と異なる年齢のヒト以外の霊長類の脳スライスの神経細胞に、そのようなDIIなどの蛍光色素を、導入する遺伝子銃の使用を示します。この特定のケースでは、我々は、成体マウス（3-6ヶ月齢）と成人cynomologusサル（9-15歳）を使用します。もともと博士リヒトマン（ガンの研究室で記述されたこの技術、ら

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Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

神経科学

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

軸索、樹状突起および脳スライスにおける個々のニューロンの樹状突起棘から電位感受性色素記録

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the adult brain. However, the mechanisms these normally quiescent cells employ to ensure proper functioning of neural networks, as well as their role in recovery from injury and mitigation of neurodegenerative processes are little understood. These cells reside in regions referred to as &#34;niches&#34; that provide a sustaining environment involving modulatory signals from both the vascular and immune systems. The isolation, maintenance, and differentiation of CNS SCs under defined culture conditions which exclude unknown factors, makes them accessible to treatment by pharmacological or genetic means, thus providing insight into their in vivo behavior. Here we offer detailed information on the methods for generating cultures of CNS SCs from distinct regions of the adult brain and approaches to assess their differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. This technique yields a homogeneous cell population as a monolayer culture that can be visualized to study individual SCs and their progeny. Furthermore, it can be applied across different animal model systems and clinical samples, being used previously to predict regenerative responses in the damaged adult nervous system.

Neural stem cells harvested from the adult brain are increasing utilized in applications ranging from the basic research of nervous system development to exploring potential clinical applications in regenerative medicine. This makes rigorous control in the isolation and culturing conditions used to grow these cells critical to sound experimental outcomes.

大人の齧歯類の脳の従来の従来にない地域から神経幹細胞を増殖させる

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

胚性齧歯類の脳から単離、プライマリ脳ドーパミンニューロンの文化と長期メンテナンス

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

プレ埋め込み免疫組織化学および電子顕微鏡のための非ヒト霊長類脳組織の調製

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a challenging and low-throughput technique due to its complexity and high reliance on user operation and control. This manuscript demonstrates an image-guided automatic patch clamp system for in vitro whole-cell patch clamp experiments in acute brain slices. Our system implements a computer vision-based algorithm to detect fluorescently labeled cells and to target them for fully automatic patching using a micromanipulator and internal pipette pressure control. The entire process is highly automated, with minimal requirements for human intervention. Real-time experimental information, including electrical resistance and internal pipette pressure, are documented electronically for future analysis and for optimization to different cell types. Although our system is described in the context of acute brain slice recordings, it can also be applied to the automated image-guided patch clamp of dissociated neurons, organotypic slice cultures, and other non-neuronal cell types.

This protocol describes how to conduct automatic image-guided patch-clamp experiments using a system recently developed for standard in vitro electrophysiology equipment.

脳スライスにおけるニューロン研究のための自動画像誘導パッチクランプの応用

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

海馬の齧歯動物の脳スライスにおけるシナプス密度の評価

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) is a promising approach when pharmacological treatment fails or neurosurgery is not recommended. Acute brain slices coupled to microelectrode arrays (MEAs) represent a valuable tool to study neuronal network interactions and their modulation by electrical stimulation. As compared to conventional extracellular recording techniques, they provide the added advantages of a greater number of observation points and a known inter-electrode distance, which allow studying the propagation path and speed of electrophysiological signals. However, tissue oxygenation may be greatly impaired during MEA recording, requiring a high perfusion rate, which comes at the cost of decreased signal-to-noise ratio and higher oscillations in the experimental temperature. Electrical stimulation further stresses the brain tissue, making it difficult to pursue prolonged recording/stimulation epochs. Moreover, electrical modulation of brain slice activity needs to target specific structures/pathways within the brain slice, requiring that electrode mapping be easily and quickly performed live during the experiment. Here, we illustrate how to perform the recording and electrical modulation of 4-aminopyridine (4AP)-induced epileptiform activity in rodent brain slices using planar MEAs. We show that the brain tissue obtained from mice outperforms rat brain tissue and is thus better suited for MEA experiments. This protocol guarantees the generation and maintenance of a stable epileptiform pattern that faithfully reproduces the electrophysiological features observed with conventional field potential recording, persists for several hours, and outlasts sustained electrical stimulation for prolonged epochs. Tissue viability throughout the experiment is achieved thanks to the use of a small-volume custom recording chamber allowing for laminar flow and quick solution exchange even at low (1 mL/min) perfusion rates. Quick MEA mapping for real-time monitoring and selection of stimulating electrodes is performed by a custom graphic user interface (GUI).

We illustrate how to perform recording and electrical modulation of 4-aminopyridine-induced epileptiform activity in rodent brain slices using microelectrode arrays. A custom recording chamber maintains tissue viability throughout prolonged experimental sessions. Live electrode mapping and selection of stimulating pairs are performed by a custom graphical user interface.

記録と電極アレイに結合された齧歯動物の脳スライスにおけるてんかん活動の変調

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...