Gostaríamos de agradecer Michael Feyder e Terrell Holloway por sua assistência durante a configuração inicial da técnica e laboratório do Dr. Fumi Ono s para o acesso ao seu microscópio confocal. Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto Nacional de Saúde através do programa intramural da NIAAA e NINDS.

1. Preparando DII / Tungsten Bullets Bead: DII (1-1&#39;-Dioctadecyl-3, 3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perclorato) balas devem ser preparadas com antecedência de cortar fatias de cérebro. O procedimento demora cerca de 2-4 horas, dependendo de quantas balas são preparados de uma só vez. <ol><li> Se a partir de um novo lote de contas de tungstênio, prepare alíquotas de 300 mg cada. Alíquotas são preparados através da suspensão de 6 gramas de tungstênio em 2 ml de cloreto de metileno. Então, pipetar 100 ml de solução em tubos de microcentrífuga talão para produzir alíquotas de 300 esferas de tungstênio mg alíquotas Conservar à temperatura ambiente (Nota: o cloreto de metileno evapora muito rapidamente álcool também pode ser usado minimizar a evaporação).... </li><li> Quando a partir de alíquotas de contas, ressuspender cada alíquota (300 esferas de tungstênio mg) em 300 ml de cloreto de metileno e cobrir rapidamente para evitar a evaporação. Esta quantidade é suficiente para 3 lotes de balas. </li><li> Preparar a solução corante, pesando 13,5 mg de DII corante lipofílico e adicionando 450 mL de cloreto de metileno (concentração final = 3mg/100μl). </li><li> Brasão as contas com corante. Coloque uma lâmina de vidro em um pedaço de cera revestido de papel e pesar Pipetar 100 mL de contas para o slide. Adicione 100 ml de solução DII, misturar bem usando pipeta ponta, e ar seco, até virar cinza contas de luz. </li><li> Use uma lâmina para raspar contas fora da lâmina de vidro e corte as contas em um pó fino (Nota: use uma lâmina nova, se fazendo mais de uma cor de balas de modo a não contaminar os corantes).. </li><li> Contas de raspar para o pesar contas de papel e funil para um tubo de 15 ml. Adicionar 3 ml de água e sonicado em banho-maria por 10-30 minutos em temperatura ambiente (Nota: cortar o pó e sonicação são aplicadas para minimizar a formação de aglomerados de grânulos revestidos que pode atrapalhar a rotulagem esparsos de neurônios individuais).. </li></ol> 2. Preparar solução de polivinilpirrolidona (PVP) e tubos: Para melhorar a penhora de contas para a tubulação de bala (tubulação TEZFEL), bata-a com polivinilpirrolidona solução (PVP). <ol><li> Prepare 10 ml de solução de PVP em água a uma concentração de 10 mg PVP / ml. </li><li> Use uma seringa de 12 ml com adaptador de tubo (tubo flexível com diâmetro ligeiramente maior) para passar a solução PVP através do tubo de bala e, em seguida, expulsá-lo do outro lado. Reutilização solução para tubo de revestimento mais bala se vários lotes são preparados simultaneamente. Descartar PVP solução após o uso. </li><li> Para adicionar as contas para o tubo vortex bala, as contas para produzir uma solução homogênea e usar a seringa para puxar a solução talão através do tubo de forma que contas são distribuídas uniformemente pela tubulação. ((Nota:) tentam minimizar o número de bolhas de ar na tubulação). </li><li> Alimentar o tubo através da estação de preparação e permitir que as contas para resolver. Use a seringa para remover suavemente a água de modo que somente as contas permanecem. </li><li> Girar a tubulação na estação de preparação e seque com gás nitrogênio até as gotas de água não são mais visíveis. Esta etapa irá demorar cerca de 10-20 min. </li><li> Cortar balas com cortador de tubos em 13 mm e comprimentos lugar em frascos de cintilação contendo Drierite ou algum tipo de sulfato de cálcio anidro. Embrulhe em uma folha de frascos para proteger da luz. </li></ol> 3. Coloração DII: Esta técnica rotulagem pode ser usado para manchar neurônios no tecido cerebral de diversas espécies, neste caso particular, a partir do mouse (3-6 meses de idade) e primatas não-humanos (9-15 anos). É preferível que as fatias são preparados a partir de tecido cerebral fixa obtidos por perfusão intracardíaca de solução de fixador, pois a preservação de tecido deve ser melhor nessa condição. No entanto, a fixação por perfusão nem sempre é viável (como foi o caso com o tecido macaco) e rotulagem DiOLISTIC ainda pode ser aplicado com sucesso em diferentes procedimentos de preparo de tecidos. Aqui nós descrevemos três procedimentos diferentes para a preparação do tecido: <ol class="lalpha"><li> Fix cérebro por perfusão intracardíaca → remover cérebro → postfix por 10 min → fatia cortada mancha → </li><li> Remover cérebro → bloco de corte de tecido → bloco corrigir → lavar em PBS fatia corte → → mancha </li><li> Remover cérebro → fatias cortadas → corrigir → lavar → mancha </li></ol> No presente estudo, os cérebros de macacos foram obtidas de indivíduos que foram transcardially perfundidos com líquido gelado cerebral artificial espinhal (ACSF) antes da colheita do cérebro e um bloco (4 mm de espessura) de tecido que contém o núcleo caudado umnd putâmen foi fixado por 60 min em temperatura ambiente. Para todos os procedimentos, a solução fixadora contém paraformaldeído a 4% de sacarose e 4% em PBS (preparada fresca ou utilizados dentro de 15 dias). É importante notar que os tempos de fixação são cruciais para a coloração bem sucedida. Overfixation pode afetar a coloração por perturbar a integridade da membrana plasmática e causando o vazamento de corante para fora da célula (veja mais informações em resultados). <ol><li> Para o procedimento a e b, fatias (200μm) são cortadas a partir do cérebro fixo ou bloco de tecido e fatias colocado em 24 poços da placa com PBS. Para o procedimento c, fresco fatias cerebral aguda (200 mm) são cortados com uma vibratome em solução corte a frio contendo (em mM) 110 Colina Cl-, 25 de NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 25 de glicose, 11,6 ácido ascórbico, ácido pirúvico 3,1 (osmolaridade = 310 mOsmols) e imediatamente após as fatias são colocadas em placas de 24 poços e fixado em 30 min com solução fixadora à temperatura ambiente. </li><li> Lave as fatias com PBS, três vezes. </li><li> Antes de fatias de tiro, retire a PBS dos poços e, usando um pincel, coloque a fatia no centro do poço. </li><li> Atirar balas DII até 3.0 M de papel de filtro usando um sistema de Helios Gene Gun em 120-180 a pressão do gás hélio psi, colocando a arma a uma distância de 1,5 cm entre a amostra ea ponta do cano. (Nota importante:. Neurônios Somente dentro de 50 mm da superfície fatia será marcado por este método por isso é importante para manter o mesmo lado da fatia voltada para cima durante a lavagem e para a montagem Desta forma, você irá certificar-se que o neurônios rotuladas será dentro da distância focal, quando de imagem com um microscópio confocal). </li><li> Lave as fatias com PBS três vezes e armazená-los em PBS durante várias horas para permitir que a DII a se espalhar ao longo dos dendritos. </li><li> Monte fatias numa lâmina de vidro com Prolongar Antifade Ouro e cubra com uma lamela 18X18 milímetros No.1. (Nota: para c processo, o melhor é montar fatias no mesmo dia em que a integridade das fatias não é bem conservado durante a noite). </li><li> Seal com unhas polonês claro depois meios de montagem secou. </li><li> Alternativamente, as fatias podem ser marcadas com anticorpos antes da montagem, conforme descrito abaixo. (Nota: Slides pode ser usado pelo menos 6 meses a um ano se armazenado no escuro a 4 ° C. DII é a exposição sensível e longo prazo luz à luz fará com que a mancha a desvanecer-se). </li></ol> 4. Coloração de anticorpos: A imunocoloração deve ser realizada após o passo 3.4 e antes da montagem. <ol><li> Permeabilização: fatias Incubar em 0,01% Triton X-100 em solução de PBS por 15 min em temperatura ambiente (300-500 mL por poço). NOTA: Não use maiores concentrações de detergente, pois isso irá dissolver DII e reduzir significativamente a coloração fluorescente. Tentar minimizar o tempo em detergente como incubações extensiva também irá reduzir a rotulagem DII. Se incubações estendida são necessárias, manter fatias em PBS, e não em solução de bloqueio. </li><li> Bloqueio: fatias Incubar em solução de bloqueio contendo soro de cabra 10%, 0,01% Triton X-100 em PBS por 30 min em temperatura ambiente. </li><li> Anticorpo primário: Adicionar anticorpo na diluição desejada em solução de bloqueio (por exemplo, coelho anticorpo anti-GFP em 1:1000 diluição). Adicionar 300-500 mL por poço e incubar por 1-2 hrs. (Nota: se incubações durante a noite são necessárias, retire o detergente do solução de bloqueio). </li><li> Lave as fatias com PBS por 5 - 15 min, 3 vezes. </li><li> Anticorpo secundário: Incubar com anticorpo secundário por 30 min em temperatura ambiente. Prepare a solução de anticorpo secundário na diluição desejada em solução de bloqueio (por exemplo, Alexa Fluor 488-anticorpo conjugado na diluição 1:1.000). </li><li> Lave as fatias com PBS por 5-15 min, 4 vezes. </li><li> Monte fatias de slides com Prolongar Antifade Ouro e cubra com uma 18x18 milímetros No.1 lamela. Seal com unha polonês após meios de montagem secou. </li></ol> 5. Resultados representativos: <ol><li> Verificação de rotulagem correta: Seção podem ser visualizados em um escopo fluorescentes dissecar equipado com uma lâmpada de mercúrio e fluorescentes cubo vermelho filtro para confirmar rotulagem DiOLISTIC sucesso. A Figura 1 mostra imagens exemplar de secções cerebrais muito bem marcado obtidas com pequeno aumento. Duas características importantes estão a olhar para um padrão de rotulagem esparsos (Figura 1A) e a capacidade de identificar individualmente os componentes celulares (Figura 1B-C). </li&gt; <li> Solução de problemas de rotulagem DiOLISTIC: Figura 2 mostra exemplos de seções em que a rotulagem DiOLISTIC trabalhou de forma incorreta. Em nossa experiência, existem três causas principais para a rotulagem ineficiente: <ul><li> Rotulagem é muito esparsa ou densa: Muito poucas células são rotulados por seção em um caso ou muitas células são rotulados impedindo o isolamento e estudo de elementos celulares única. Solução: ajustar a concentração de grânulos com revestimento na solução final utilizada para o revestimento da tubulação bala TEFZEL (seção 1.6). Diminuir ou aumentar o volume de água (3 ml valor inicial) utilizado para dissolver as contas em ordem para corrigir a rotulagem demasiado escassa ou muito densa, respectivamente. Além disso, baixa eficiência de rotulagem podem ser causados ​​por menos de pressão do gás ideal para fotografar as contas revestido em seções. Esta possibilidade pode ser descartada, certificando-se que a tubulação de bala TEFZEL lançou a maior parte dos grânulos revestidos e parece claro após o disparo. Caso contrário, a pressão do gás para a fotografia deve ser aumentada. </li><li> Balas ruins: as grandes aglomerações ou clusters de contas corante revestido de tungstênio são formadas durante a preparação de bala. Seções se assemelhará exemplos na Figura 2A-B. Solução: fazer novas balas com especial atenção o ponto 1.5 e / ou prolongar o tempo de sonicação no ponto 1.6. </li><li> Prazo de fixação: o tecido é mantido em solução de paraformaldeído por mais tempo do que o tempo ideal necessário para a fixação (30 minutos para seções 200-300 mM, 1 hora para 4 seções mm). Isso compromete a integridade da membrana plasmática e produz seções rotuladas que se parecem com aqueles mostrados na Figura 2C-D em que a rotulagem parece fora de foco devido à dispersão de corante para fora das células. Solução: reduzir o tempo de fixação. </li></ul></li><li> Imagem confocal: pilhas de imagens são adquiridas através de um microscópio confocal (Zeiss LSM 510 META) com um objetivo de 20x para a célula inteira e objetiva de imersão 63x de água para os segmentos de dendrite. DII estava animado usando uma linha de laser 561 DPS nm e fluorescência verde do anticorpo secundário foi animado usando uma linha de laser 488 nm. A secção óptica da amostra rotulada alcançado quando usando microscopia confocal permite ainda para o isolamento de células marcadas única na amostra. Figura 3A mostra um neurônio estriatal spiny médio do cérebro do rato e seu padrão de ramificação complexa dendrite. Imagens de alta ampliação de ramos dendrite desses neurônios a partir de roedores (Figura 3B) e primatas não-humanos (Figura 3C) demonstram o grau de coloração em dendritos e espinhas dendríticas usando esta técnica em ambas as espécies. Dendritos e suas saliências (espinhas) aparecem bem definidos, mesmo quando se considera a coluna, longo e fino cabeças tão abundante nos neurônios espinhosos médios. Ao combinar DiOLISTICS com imunomarcação, imagem confocal também é útil para localizar a mancha de forma inequívoca para o mesmo plano focal e mesma célula. A Figura 4 mostra um exemplo de co-localização de DII rotulagem e imunomarcação para GFP em uma única célula. A imagem é uma pilha (0,7 mM z-seção) obtido a partir de uma fatia estriatal de um camundongo transgênico expressando a proteína fluorescente GFP sob o promotor receptor D1 de dopamina. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. DII rotulagem de neurônios em fatias de cérebro de primatas não-humanos. (A) imagem de baixa ampliação de uma fatia do cérebro manchada contendo o núcleo caudado de um macaco cynomolgus que mostra escassa rotulagem de neurônios com DII. (BC) neurônios isolados spiny meio pode ser facilmente identificado usando um escopo fluorescentes de dissecação. <img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Rotulagem DiOLISTIC Resolução de Problemas. (AB) fatias de estriado dorsal Stained de macaco (A) e mouse (B) mostrando grandes aglomerações de corante revestido contas e, como conseqüência, não há elementos individuais de celular podem ser distinguidos. (CD) Imagens que exemplificam o resultado da aplicação DiOLISTIC rotulagem para as seções que foram mantidos em solução fixadora por períodos prolongados de tempo, ou quando a preservação de tecido falhou em macaco (C) e tecido mouse (D). <img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Confocal imagem de estriatal médio spiny neurônio corados com DII. (A), pilha de Imagem de uma célula inteira permite a análise morfológica dos ramos dendríticas. Segmentos (BC) Dendrite de mouse (B) e macaco (C) neurônios espinhosos médios mostram uma rotulagem clara de dendrite e espinhas. <img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Combinando rotulagem DiOLISTIC com imunocoloração. (A) Dii rotulados <strong&gt; médio spiny neurônio do estriado de BAC GFP camundongo transgênico expressando sob o promotor receptor D1 de dopamina. imunocoloração (B) usando anticorpos anti-GFP, como descrito por métodos adaptados de Lee et al. (2006). Mesmo campo como A. imagem (C) composto de vermelho e de fluorescência verde identifica neurônio DII marcado como um neurônio GFP-positivo.

<ol>
	<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+"DiOLISTIC"+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor "DiOLISTIC" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system.">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harb Protoc. , pdb.prot5202-pdb.prot5202 (2009).</li><li>Grutzendler, J., Tsai, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+labeling+of+neuronal+populations+by+ballistic+delivery+of+fluorescent+dyes.">Rapid labeling of neuronal populations by ballistic delivery of fluorescent dyes.</a> Methods. 30, 79-85 (2003).</li><li>Lee, K. W., Kim, Y., Kim, A. M., Helmin, K., Nairn, A. C., Greengard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocaine-induced+dendritic+spine+formation+in+D1+and+D2+dopamine+receptor-containing+medium+spiny+neurons+in+nucleus+accumbens.">Cocaine-induced dendritic spine formation in D1 and D2 dopamine receptor-containing medium spiny neurons in nucleus accumbens.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 3399-3404 (2006).</li><li>Matsubayashi, Y., Iwai, L., Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+double-labeling+with+carbocyanine+neuronal+tracing+and+immunohistochemistry+using+a+cholesterol-specific+detergent+digitonin.">Fluorescent double-labeling with carbocyanine neuronal tracing and immunohistochemistry using a cholesterol-specific detergent digitonin.</a> J Neurosci Methods. 174, 71-81 (2008).</li><li>Neely, S. t. a. n. w. o. o. d., Deutch, G. D., Y, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+diOlistic+labeling+with+retrograde+tract+tracing+and+immunohistochemistry.">Combination of diOlistic labeling with retrograde tract tracing and immunohistochemistry.</a> J Neurosci Methods. 184, 332-336 (2009).</li><li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diolistics:+incorporating+fluorescent+dyes+into+biological+samples+using+a+gene+gun.">Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun.</a> Trends Biotechnol. 25, 530-534 (2007).</li><li>Shen, H. W., Toda, S., Moussawi, K., Bouknight, A., Zahm, D. S., Kalivas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+dendritic+spine+plasticity+in+cocaine-+withdrawn+rats.">Altered dendritic spine plasticity in cocaine- withdrawn rats.</a> J. Neurosci. 29, 2876-2884 (2009).</li></ol>

Todos os procedimentos foram realizados em animais a seguir a orientação do Animal Care e do Comitê Use a NIAAA eo Oregon National Primate Research Center. Os autores não têm nada a revelar.

Rotulagem DiOLISTIC é uma das técnicas mais versáteis disponíveis para as células fluorescente rotulagem, porque pode ser aplicado a seções de tecido de diversas espécies, para uma ampla gama de idades, e para o tecido obtido frescos ou de fixador-perfundidos animais (ver também Gan et al ., 2009). O processo é relativamente rápido, uma vez que leva 1-2 dias e pode ser combinada com outras abordagens rotulagem mais clássicos, como imunocoloração (Lee et al., 2006). Atenção especial deve ser dada para evitar o excesso de fixação e uso de detergente de alta concentração em soluções de incubação porque estes compreendem a integridade da membrana lipofílica e fazer com que o corante vazar para fora das células. Penetração de anticorpos pode ser facilitado por baixas concentrações de Triton X-100 (Lee et al., 2006), bem como digitonina ou saponina na solução de incubação (Matsubayashi et al., 2008). Algumas modificações que podem ser aplicadas para esta técnica incluem o uso de balas com diversas tinturas e, como descrito por Gan et al. (2000) ou mudar o tamanho e tipo de exposição de anticorpos (Neely et al., 2009). Tradicionalmente, a DII tem sido usado para traçar projeções neuronais no cérebro. Rotulagem DiOLISTIC amplia sua aplicação, descrevendo um método útil para analisar a morfologia das células. Morfologia neuronal é de grande interesse por causa da grande diversidade encontrada no cérebro e as especulações de que a forma da célula pode refletir sobre a multiplicidade função de populações neuronais no sistema nervoso. Um exemplo disso é o fato de que muitos neurônios do sistema nervoso protrusão mostrar mamíferos pequenos chamadas espinhas dendríticas, que são o local das sinapses glutamatérgicas. Desta forma, a densidade de sinapses glutamatérgicas em uma célula pode ser correlacionada com a densidade de espinhas dendríticas, que pode ser medido utilizando a técnica de rotulagem descritos neste documento. Além disso, outros parâmetros morfológicos, tais como comprimento total dendrite, padrão de ramificação, forma espinha dendrítica e densidade podem ser quantificados e estudados. O uso de marcação fluorescente para estudar a morfologia neuronal tem muitas vantagens quando comparado com técnicas mais tradicionais que dependem de microscopia de campo claro (por exemplo, a coloração de Golgi), pois permite maior resolução de imagem confocal. Outra vantagem de usar DII como um fluoróforo em experimentos destinados a medir a densidade espinha dendrítica e morfologia é suas propriedades lipofílicas. Partições DII na membrana plasmática e proporciona um contorno bem definido dos processos neuronais e saliências dendríticas. Dado o pequeno volume de mais espinhas dendríticas (menos de 1 femtoliter), coloração da membrana é mais eficiente e permite uma melhor visualização de pequenas saliências finas de coloração citoplasmática.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1-1&#x2019;-dioctadecyl-3,3,3&#x2019;,3&#x2019;- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D-282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methylene chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
<td>H485-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tungsten beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2269</td>
<td>1.7 &mu;m diameter</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyvinylpyrrolidone </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>529504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tefzel bullet tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2441</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing cutter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2422</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helios Gene Gun</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2431</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isopore membrane filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>TSTP02500</td>
<td>3.0 &mu;m pore size</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold Antifade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alfa Aesar</td>
<td>30525-89-4</td>
<td>(16% w/v)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

diolistic labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices

Coloração DiOLISTIC usa a arma gene para introduzir corantes fluorescentes, como o DII, em neurônios de fatias do cérebro (Gan et al, 2009;. O&#39;Brien e Lummis, 2007; Gan et al, 2000).. Aqui nós fornecemos uma descrição detalhada de cada etapa necessária em conjunto com imagens exemplares de resultados bons e ruins que ajudarão ao configurar a técnica. Em nossa experiência, a poucos passos mostrou crítico para o sucesso da aplicação DiOLISTICS. Estas considerações incluem a qualidade das balas revestidas de DII, o grau de exposição fixador, ea concentração de detergente utilizado nas soluções de incubação. Dicas e soluções para problemas comuns são fornecidos. Esta é uma técnica rotulagem versátil que pode ser aplicado a várias espécies de animais em uma ampla gama de idades. Ao contrário de outras técnicas de rotulagem fluorescentes que são limitados para a preparação de animais jovens ou restrita a camundongos, porque eles contam com a expressão de um transgene fluorescentes, rotulagem DiOLISTIC pode ser aplicado a animais de todas as idades, espécies e genótipos e pode ser usado em combinação com imunocoloração para identificar uma sub-população específica de células. Aqui nós demonstrar o uso de DiOLISTICS aos neurônios etiqueta em fatias de cérebro de camundongos adultos e adultos primatas não-humanos com o objetivo de quantificar dendrite ramificação e morfologia espinha dendrítica.

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DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Nós demonstramos o uso da arma para introduzir gene corantes fluorescentes, como DII, em neurônios em fatias de cérebro de roedores e primatas não-humanos de diferentes idades. Neste caso particular, nós usamos camundongos adultos (3-6 meses de idade) e adultos macacos cynomologus (9-15 anos). Esta técnica, descrita originalmente pelo laboratório do Dr. Lichtman (Gan<em&gt; Et al</em&gt;., 2000), é bem adequado para o estudo da ramificação dendríticas e morfologia da coluna dendríticas e pode ser combinado com imunocoloração tradicional, se os detergentes são mantidas a uma baixa concentração.

Labeling DiOLISTIC de Neurônios de roedores e não-humanos fatias do cérebro do primata

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

diolistic-labeling-neurons-from-rodent-non-human-primate-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.8K visualizações.  NIH. Nós demonstramos o uso da arma para introduzir gene corantes fluorescentes, como DII, em neurônios em fatias de cérebro de roedores e primatas não-humanos de diferentes idades. Neste caso particular, nós usamos camundongos adultos (3-6 meses de idade) e adultos macacos cynomologus (9-15 anos). Esta técnica, descrita originalmente pelo laboratório do Dr. Lichtman (Gan Et al., 2000), é bem adequado para o estudo da ramificação dendríticas e morfolo...