この作品は、自然科学とカナダ（NSERC）の工学研究会、イノベーションのためのカナダ財団（CFIプロジェクト番号30381）からCDCBへジョンR.エバンスリーダー基金研究基盤の助成金、およびによってからCDCBにディスカバリーグラントによってサポートされていましたNSERCからNJMに発見グラント。 ELLオンタリオ大学院奨学金によっておよびゲルフ大学のオンタリオ獣医大学からOVC奨学金によってサポートされていました。 CDSはNSERCからの学部学生の研究助手によってサポートされていました。 ALMはNSERCからアレクサンダー・グラハム・ベル奨学金によっておよびゲルフ大学のオンタリオ獣医大学からOVC奨学金によってサポートされていました。

大人の女性のCD1 - ひずみマウスは、本研究に使用しました。同様の染色は、様々な年齢で男女ともを用いて達成することができます。実験動物は、原則と動物ケアのカナダの協議会のガイドラインに従って世話し、実験プロトコルはグエルフの動物管理委員会の大学により承認されました。 1.ゴルジ - コックス染色<ol><li> 脳のゴルジ-コックス含浸 <ol><li>別々に高品質の水に重クロム酸カリウム及びクロム酸カリウムを溶解し、1％のゴルジコックス溶液（w / v）の重クロム酸カリウム、0.8％（w / v）のクロム酸カリウムと1％（w / v）の塩化第二水銀を行います。溶液を混合、塩化第二水銀を追加して、等級1濾紙を用いて最終溶液を濾過します。までの1ヶ月間暗所でのソリューションを保管してください。 </li><li> 5％のイソフルランを用いてマウスを麻酔。 </li><li>断頭によりマウスを安楽死させるとすぐに脳を取り除きます。 </li><li>ゴルジコックス溶液17 mLを含む20mLのガラスシンチレーションバイアルに脳を置き、25日間室温にて暗所でインキュベートします。 </li><li> 24時間4℃で暗所でスクロース凍結防止剤（0.1 Mリン酸緩衝液、pH7.4中の30％（w / v）のスクロース）の40 mLを含む50mLのコニカルチューブにそれを置くことによって脳をCryoprotect。 注：以下のオプションの3つのステップが、長期保存のために、この段階で脳を凍結するために、主プロトコルの代替として使用することができます。 </li><li>ドライアイスで予冷された200 mLのイソペンタン中にそれを浸漬することにより、脳全体をフリーズします。 </li><li> -80℃で暗所で50 mLコニカルチューブとストアに凍結脳を置きます。 </li><li>準備が進行する場合、24時間4℃で暗所でスクロース凍結防止剤の40 mLを含む50mLのコニカルチューブにそれを配置することにより脳を解凍。 </li></ol></li><li> 脳セクショニング <ol><li>スクロースおよびブロックから脳を削除しますカミソリの刃を使用して、小脳を切除し、脳の残りの尾側端部に平坦な縁部を残すことによってセクショニングのためにそれをKです。 </li><li>熱寒天培地（3％（w / v）の水で）それが溶融し、その融点よりわずかになるまで冷ますれるまで。 </li><li>その尾側端面ダウンと小型の使い捨て量る皿に脳を置き、脳をカバーするために溶融寒天の十分な量を追加します。 </li><li>寒天が固化した後、約2出る過剰寒天をトリミング - 脳を囲む4ミリメートルを、エチルシアノアクリレート接着剤の少量を使用して尾側端面ダウンとビブラトームのステージに脳を接着。 </li><li> 400のスライス厚で脳および脳セクションをカバーするためにスクロース凍結防止剤の十分な量とビブラトームのステージ領域を埋める - 86ヘルツの振動周波数を使用して（検査すべき脳の領域に依存する）は500μmと0.125ミリメートル/秒のブレード前進速度。 </li><li>小さなペイントブラシを使用して市販のメッシュ底インサートを含む0.1 Mリン酸緩衝液、pH7.4中の6％（w / v）のスクロース10mLで予め充填された6ウェル組織培養プレートのウェルに、場所脳切片を。 </li><li> 4°CO / Nで暗所でセクションをインキュベートします。 </li></ol></li><li> 脳切片を開発 <ol><li>メッシュ底インサートを使用して、0.1 Mリン酸緩衝液、pH7.4中の新しいウェルの2％の5 mLを含む（w / v）のパラホルムアルデヒド（PBD）に脳切片を転送します。 15分間RTで暗所に低速で移動しロッカー上でインキュベートします。 </li><li> 5mLの水を含む新しいウェルにそれらを転送することにより、二回のセクションを洗ってください。 5分間RTで暗所中速で移動しロッカーに洗います。 </li><li> 2.7％（v / v）の水酸化アンモニウムの5 mLを含む新しいウェルに転送部。 15分間RTで暗所に低速で移動しロッカー上でインキュベートします。 </li><li> 5mLの水を含む新しいウェルにそれらを転送することにより、二回のセクションを洗ってください。ウォッシュO5分間RTで暗所で適度な速度で移動ロッカーナ。 </li><li>元の購入濃度から水10倍に希釈したウェル固定液Aの5 mLを含む新しいに転送部（ 材料表を参照）。 25分間RTで暗所に低速で移動しロッカー上でインキュベートします。 </li><li> 5mLの水を含む新しいウェルにそれらを転送することにより、二回のセクションを洗ってください。 5分間RTで暗所中速で移動しロッカーに洗います。 </li></ol></li><li> 脳切片をマウント <ol><li>小さなペイントブラシを使用して、顕微鏡スライド上に切片をマウント。過剰の水を除去し、ピンセット、小さな組織を使用した寒天。脱水を進める前に、すべての寒天が削除されていることを確認してください。 </li><li>約45分（400枚のμmの切片）または90分（500枚のμmの切片）を室温で空気乾燥させるセクションを可能にします。 注：乾燥のタイミングと適切なレベルは重要であり、そしてそれぞれにおいて決定される必要があるかもしれません実験室周囲温度および湿度レベルに応じ。あまりにも短い乾燥時間は、その後の脱水工程の間に、スライドの脱落セクションにつながり、そしてあまりにも長い乾燥時間が割れセクションにつながります。セクションは、まだ乾燥の適切なレベルで光沢のように見えるだろう。 </li><li>示されるように、コプリン染色ジャーにスライドを配置することにより、クレシルバイオレットで染色切片。 注：このオプションのステップは、クレシルバイオレットと神経細胞核を染色するためには、凍結されていなかったセクションのために使用することができます。私たちは、クレシルバイオレットでのインキュベーションの前のセクションをクリアして再水和することも、セクション全体の背景を染色し、低につながることを発見しました。 <ol><li> 5分間のエージェントをクリアするに置きます。一回繰り返します。 </li><li> 5分間、100％エタノールに入れます。一回繰り返します。 </li><li>水中の95％エタノール、水で、次いで75％エタノール、2分間、水中で、次いで50％エタノール中場所。 </li><li> 5分間水に置きます。 </li><li> 0.5％（w / v）のCRE内の場所7分間水にSYLバイオレット。 </li><li> 2分間水に置きます。一回繰り返します。 </li></ol></li><li>示されるように、コプリン染色ジャーにスライドを配置することによって切片を脱水。 <ol><li>水中50％エタノール、水で、次いで75％エタノール、2分間、水で、次いで95％エタノール中の場所。 </li><li> 5分間、100％エタノールに入れます。一回繰り返します。 </li><li> 5分間のエージェントをクリアするに置きます。一回繰り返します。 注：これらの脱水とクリア時間は、この原稿で説明したように、マウスの脳を処理するのに十分です。しかし、我々は最後のクリアステップは15分の合計まで延長する必要があるかもしれないことを、ラットおよびcowbirdを含む他の種のために観察しました。 </li></ol></li><li>無水マウンティング培地を用いてカバースリップセクション。 </li><li>スライドは、少なくとも5日間RTで暗所で水平に乾燥することができます。 </li></ol></li></ol>太い脳切片内の2イメージングステンドニューロン<ol><li> 画像スタックをキャプチャ </強いです&gt; <ol><li>顕微鏡の電球、カメラ、およびステージコントローラをオンにします。 </li><li>顕微鏡ソフトウェア（ 例えば 、Neurolucida）を開きます。 </li><li>顕微鏡ステージ上にスライドを置きます。 </li><li>例えば1.25×0.4 NA PlanAPO又は4X 0.16 NAのような低倍率の対物レンズを用いて脳切片の2D広視野画像をキャプチャ<ol><li>画像をフォーカスと露出時間やホワイトバランスなどのカメラの設定を調整します。 </li><li>セクションの任意の場所を左クリックして基準点を作成します。 </li><li>画像取得ウィンドウ内の「単一の画像を取得」を選択することにより、画像をキャプチャします。 </li></ol></li><li> 10×0.3 NA UPlan FL N対物レンズを使用して、関心のニューロン（単数または複数）を含む領域の中間解像度画像スタックを取り込みます。 <ol><li>画像の焦点、露光及びホワイトバランスなどのカメラ設定を調整します。 </li><li>セクションAの頂部に焦点を合わせることによって画像スタックの上限および下限を設定しますND画像取得ウィンドウ内の次の「スタックの最上部」に「設定」、及び、セクションの底に焦点画像取得ウインドウ内の「スタックの底部」の次の「設定」を選択する選択。 </li><li>画像取得ウインドウ内の「画像間の距離」次へ「を5μm」を入力することにより、5ミクロンまでのステップ距離を設定します。 </li><li>画像取得ウインドウ内の「画像スタックを取得する」を選択することにより、画像スタックを取り込みます。 </li><li>すべての画像スタックは、X軸とY軸に少なくとも10％重なることを確認し、関心のある領域全体をキャプチャするために上記の手順を繰り返します。 </li></ol></li><li> 30X 1.05 NAシリコーン油浸対物レンズを使用して、関心のニューロンを含む領域の高解像度画像スタックをキャプチャします。 <ol><li>スライドにシリコーン浸オイルの4滴とスライドの上に目的を置いて、目的とOIとの間の接触を作るために確保 - 3を適用します。リットル。 </li><li>画像の焦点、露光及びホワイトバランスなどのカメラ設定を調整します。 </li><li>セクションの上部に集束及び画像取得ウィンドウ内の次に「スタックの最上位」を「設定」を選択することにより、画像スタックの上下の境界を設定し、区間及び選択「セット」の底部に焦点画像取得ウィンドウ内の「スタックの一番下」の隣にあります。 </li><li>画像取得ウインドウ内の「画像間の距離」次へ「を1μm」を入力することによって、1ミクロンまでのステップ距離を設定します。 </li><li>画像取得ウインドウ内の「画像スタックを取得する」を選択することにより、画像スタックを取り込みます。 </li><li>すべての画像スタックは、X軸とY軸に少なくとも10％重なることを確認し、関心のある領域全体をキャプチャするために上記の手順を繰り返します。 </li></ol></li><li>データファイルを保存し、外部処理のためのTIFF形式のすべての画像ファイルを保存します。 </li></ol> &lt;/ LI&gt; <li> Z-投影画像とイメージのモンタージュを作成します <ol><li> ImageJの中のZ-投影画像を作成します<ol><li>バイオフォーマットプラグインがインストールされているオープンImageJソフトウェア。 </li><li> 「プラグイン」を選択 - &gt;「バイオフォーマット」 - &gt;「バイオフォーマットのインポーター」。 </li><li>オープンする画像スタックファイルを選択します。 </li><li>ファイルを開くと、「イメージ」を選択することで、RGBの形式を変更 - &gt;「タイプ」 - &gt;「RGB色」。 </li><li> &quot;イメージ&quot; を選択することで、Z-投影を作成する - &gt; &quot;スタック&quot; - &gt; &quot;Zプロジェクト...&quot;。 </li><li> TIFFファイルとして、二次元Z投影画像を保存します。 </li></ol></li><li>関心の領域全体の2次元画像モンタージュを作成します。 <ol><li> （ 例えば 、Adobe Photoshopの）ソフトウェアを開きます。 </li><li> &gt; &quot;自動化&quot; - - &gt; &quot;Photomergeの&quot; &quot;ファイル&quot; を選択します。 </li><li>選択して「参照」し、すべてのIMAGを追加ESファイルがマージされます。 </li><li> 「一緒に画像をブレンド」が選択されていることを確認し、「OK」を選択します。 </li><li> TIFFファイルとして関心の領域全体の結果のモンタージュ画像を保存します。 </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Golgi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulla+struttura+della+sostanza+grigia+del+cervello.">Sulla struttura della sostanza grigia del cervello.</a> Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).</li><li>Cox, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impr&#228;gnation+des+centralen+Nervensystems+mit+Quecksilbersalzen.">Impr&#228;gnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen.</a> Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).</li><li>Zaqout, S., Kaindl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi-Cox+Staining+Step+by+Step.">Golgi-Cox Staining Step by Step.</a> Front Neuroanat. 10, 38 (2016).</li><li>Levine, N. 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F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+binge-like+alcohol+exposure+decreases+dendritic+complexity+while+increasing+the+density+of+mature+spines+in+mPFC+Layer+II/III+pyramidal+neurons.">Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons.</a> Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).</li><li>Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. 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A., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-induced+changes+in+dendritic+structure+and+complexity+in+the+adult+hippocampal+dentate+gyrus.">Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus.</a> Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).</li><li>Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+alpha5+subunits+drive+developmental+changes+in+the+activation+and+morphology+of+prefrontal+cortex+layer+VI+neurons.">Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons.</a> Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).</li><li>Lytton, W. 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著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

私たちは、厚い脳切片内の神経細胞を可視化するために、ここで2つの有用な変種と一緒にゴルジコックスの染色プロトコルを記述します。代表的な結果に示すように、長い800μmの作動距離を持つ高解像度の対物レンズの使用は、500μmので切断脳切片の深さを通して全体ニューロンの信頼性の可視化が可能になります。比較的厚い脳切片のこの研究では、任意のタイプの染色されたニューロン...

組織サンプル内の個々の神経細胞の可視化は、脳の我々の理解を進めて大きくしており、それは、内因性疾患または外因性の環境要因によって影響を受ける可能性がどのようにニューロンの形態学的特性のその場での分析を可能にします。ゴルジ - コックスの染色方法は、脳内の神経細胞のランダムなサンプルを染色の費用対効果の高い、比較的簡単な手段です。第ゴルジ1によって開発され、1800年代コックス2によって修飾、研究者らはさらに、樹状ツリー形態および棘密度3,4の両方を可視化し、定量化するために使用することができる透明な、十分に染色されたニューロンを産生するために長年にわたってこの技術を洗練しています5、6、7、8、9。 脳切片中の染色されたニューロンの可視化のための主要な技術的な考慮事項は、使用可能な高倍率/高解像度の顕微鏡対物レンズの作動距離によって制限される最大スライス厚、です。 60で共通の油浸対物レンズ - 100Xは、優れた分解能を提供する範囲であるが、一般的には200μmよりも大きくない彼らの作動距離によって制限されています。 200μmの範囲で切断脳切片は、大脳皮質10の浅い層で例示錐体ニューロン、11、12、のCA1領域における錐体ニューロンのために、このスライスの厚さ内に収容することができる特定のニューロンタイプを視覚化するのに十分であってもよいです海馬13、14、及び海馬15の歯状回における顆粒細胞。比較的長いとニューロンこうした脳は全体の樹状突起の木を含むように完璧な角度で切断する必要があるため、セル本体16から800以上ミクロンを拡張することができ、マウスのために、より大きな挑戦を提供大脳皮質の深い層内の錐体細胞として樹状突起、 200枚のμmの切片内。デンドライトまたはその枝のいずれかが吻側または尾側方向に延びている場合、これはさえ実現可能ではないかもしれません。それは複数の隣接する脳切片を横切ってニューロンを追跡することによってこの制限に対処することは可能であるが、このアプローチは17をトレースするための正確セクションを整列させるに重要な技術的課題を紹介します。より実用的なアプローチは、より大きな厚さで切断された脳切片内に含まれる全体のニューロンを可視化することであろう。 ゴルジ - コックス法を用いたマウスの500ミクロン厚の脳切片、および彼らのMOを視覚化するために - 私たちはここに400内のニューロンを染色する技術を報告しますrphology800μmの作動距離を有する高分解能シリコン油浸対物レンズを使用。我々は説明ゴルジコックス含浸処理プロトコルは文献6に最も引用現代プロトコルのいずれかから変更されています。厚い脳切片との我々のアプローチは、完全にセクション内に含まれる任意のタイプのニューロンを同定する確率を増加させるという利点を提供します。ユニークな利点を提供するメインプロトコル、我々もまた、本2つのバリエーションに加えて：取り付けられた部分の表面にクレシルバイオレット対比（1）ゴルジコックス染色、脳領域の境界を画定するための層を識別するために切片および最終処理の前に含浸全脳の長期保存のための中間凍結ステップと大脳皮質、及び（2）ゴルジコックス染色。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="775">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">potassium dichromate</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">P188-100</td>
			<td style="width:167px;">Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">potassium chromate</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">P220-100</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">mercuric chloride</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">S25423</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Whatman grade 1 filter paper</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">1001-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">isoflurane</td>
			<td style="width:147px;">Pharmaceutical Partners of Canada</td>
			<td style="width:175px;">CP0406V2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">20 mL scintillation vial</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">03-337-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">sucrose</td>
			<td style="width:147px;">Bioshop Canada</td>
			<td style="width:175px;">SUC700.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">S5011-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">S9390-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">50 mL conical tube</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">12-565-271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">isopentane</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">AC126470010</td>
			<td>also known as 2-methylbutane. Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">agar</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">A1296-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">small weigh dish</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">02-202-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">vibratome</td>
			<td style="width:147px;">Leica</td>
			<td style="width:175px;">VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">6 well tissue culture plates</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">08-772-1b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">mesh bottom tissue culture inserts</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">07-200-214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:288px;">paraformadelhyde, 16%</td>
			<td style="width:147px;">Electron Microscope Sciences</td>
			<td style="width:175px;">15710-S</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">A669S-500</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Kodak Fixative A</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">P7542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">superfrost plus slides</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">CitroSolv clearing agent</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">22-143-975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">anhydrous ethyl alcohol</td>
			<td style="width:147px;">Commercial Alcohols</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">cresyl violet</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">C1791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">permount</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">upright microscope</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:175px;">BX53 model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">colour camera, 12 bit</td>
			<td style="width:147px;">MBF Biosciences</td>
			<td style="width:175px;">DV-47d</td>
			<td style="width:167px;">QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:288px;">three-dimensional motorized microscope stage, controller and enoders</td>
			<td style="width:147px;">MBF Biosciences</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td>Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">4x microscope objective</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:175px;">4x 0.16 N.A. UplanSApo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10x microscope objective</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:175px;">10x 0.3 N.A. UPlan FL N&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">30x microscope objective</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td>30x 1.05 N.A. UPlanSApo&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">60x microscope objective</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td>60x 1.42 N.A. PlanAPO N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">silicone immersion oil</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:175px;">Z-81114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Neurolucida software</td>
			<td style="width:147px;">MBF Biosciences</td>
			<td style="width:175px;">Version 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:147px;">U. S. National Institutes of Health</td>
			<td style="width:175px;">Current version</td>
			<td>With the OME Bio-Formats plugin installed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Photoshop software</td>
			<td style="width:147px;">Adobe</td>
			<td style="width:175px;">version CS6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging neurons within thick brain sections using the golgi-cox method

ニューロン染色のゴルジ - コックス方法は、組織学的脳サンプル内のニューロンの形態の我々の理解を進めるために以上の200年のために採用されています。それは完全に単一のセクション内に含まれる染色されたニューロンを同定する確率を高めるために、可能な最大の厚さで脳切片を調製するために実用的な観点から好ましいが、このアプローチは高いの作動距離によって技術的な観点から制限されています-magnification顕微鏡対物レンズ。ここでは500μmの厚さで切断されているマウスの脳切片にゴルジ - コックス法を用いた神経細胞を染色するために、高解像度30X 1.05 NAシリコーンを装着した正立顕微鏡を使用して、これらのセクションの深さ全体のニューロンを可視化するために、プロトコルを報告します800μmの作動距離を持つ油浸対物レンズ。また、表面を対比染色するために使用することができるこのプロトコルの2つの有用な変種を報告しますクレシルバイオレットニッスル染色で脳切片をマウントし、または処理を区画し、最終の前に長期保存のために全脳を凍結します。主プロトコルとその2つの変異体は、完全なニューロンの樹状ツリーと樹状突起棘を確実に可視化および定量化することができる全体ステンド厚い脳切片を、生成します。

500μmの厚さの脳切片 - このゴルジコックス染色プロトコルと、その2つの任意の変異体を説明400内の個々のニューロンを可視化するために使用することができます。 10×対物レンズ及びZ軸に5μmの手順を使用してキャプチャ二次元Z-突起の代表画像のモンタージュは、 図1に示されている：A1 -前帯状皮質領域1と含む冠状脳切片の大面積のために...

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Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

我々は、単一の組織サンプル内に含まれる長い樹状ツリーとニューロンを可視化するために、厚い脳切片にゴルジコックス染色法を使用するためのプロトコルを提示します。このプロトコルの二つの変異体はまた、クレシルバイオレットの対比、および長期保存のために未処理の脳の凍結を伴うが提示されています。

ゴルジ - コックス法を用いた太い脳切片内のイメージングニューロン

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.2K ビュー.  University of Guelph. 我々は、単一の組織サンプル内に含まれる長い樹状ツリーとニューロンを可視化するために、厚い脳切片にゴルジコックス染色法を使用するためのプロトコルを提示します。このプロトコルの二つの変異体はまた、クレシルバイオレットの対比、および長期保存のために未処理の脳の凍結を伴うが提示されています。 

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A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

セミ厚い脳スライスにおける高解像度蛍光イメージングへの迅速なアプローチ

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

神経科学

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

網膜切片の形態学的解析

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile stimulation is a positive early experience that mimics maternal licking and grooming in the rat. Exposing rat pups to this positive experience can be completed easily and cost-effectively by using highly accessible materials such as a household duster. Using a cross-litter design, pups are either stroked or left undisturbed, for 15 min, three times per day throughout the perinatal period. To measure the neuroplastic changes related to this positive early experience, Golgi-Cox staining of brain tissue is utilized. Owing to the fact that Golgi-Cox impregnation stains a discrete number of neurons rather than all of the cells, staining of the rodent brain with Golgi-Cox solution permits the visualization of entire neuronal elements, including the cell body, dendrites, axons, and dendritic spines. The staining procedure is carried out over several days and requires that the researcher pay close attention to detail. However, once staining is completed, the entire brain has been impregnated and can be preserved indefinitely for ongoing analysis. Therefore, Golgi-Cox staining is a valuable resource for studying experience-dependent plasticity.

This paper describes the procedures for tactile stimulation of rat pups and subsequent Golgi-Cox staining of neuronal morphology. Tactile stimulation is a positive experience that is administered in the perinatal period by stroking pups with a household duster. Golgi-cox staining is a reliable procedure permitting the visualization of entire neurons.

ゴルジコックス染色で樹状形態とシナプス接続に関するポジティブ初期の経験、触覚刺激の効果を可視化する

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal&#8217;s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.

This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

アラート、頭部拘束ラットの皮質下脳構造内の単一ニューロンのJuxtacellular監視とローカリゼーション

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

CLARITY / CUBIC技術を用いたマウスの脊髄にセロトニン繊維のイメージング

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Golgi-Cox法を用いた老齢マウスにおける海馬の樹状突起の複雑さの評価

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Β42 アミロイド毒性と大人のゼブラフィッシュ脳の神経変性をモデリング

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

2次元培養系を用いた主な大脳皮質細胞のイメージングをライブします。

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニック マウス

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...