この方法は、ショウジョウバエメラノガスターでウイルス感染を効果的に確立する方法に関するウイルス宿主相互作用分野の主要な質問に答えるのに役立ちます。このナノインジェクション法は、ウイルスの感染用量を正確に制御することを可能にし、他の微生物病原体との感染に容易に適用することができる。1時間摂氏25度で追加の二酸化炭素を持たない完全なシュナイダーのショウジョウバエ培地の10ミリリットルを持つ10センチメートルの細胞培養皿の緩い、半接着単層としてミリリットル当たり7番目の生存可能なS2星細胞に10倍成長させることから始めます。
インキュベーション中に、解凍したばかりのショウジョウバエCウイルスまたはDCVを完全培地1ミリリットルで0.01の感染の多重度に再中断し、細胞培養皿にウイルス溶液を加える。その後、プレートを摂氏25度のインキュベーターに3〜5日間戻します。ウイルスは、細胞形態がぼやけて見え、培養培地が細胞の破片を示す黒い粒子でいっぱいである場合、収集の準備ができています。
上清を数回ピペット化して混合してから、細胞培養全体を15ミリリットルチューブに移し、マイナス80°Cで宿主細胞のリシスを行います。ウイルスの働く濃度を生成するには、遠心分離によって細胞の破片をペレットする前に、一定の揺れで25°Cの水浴で細胞懸濁液を解凍します。その後、上清を新しい無菌15ミリリットルチューブに移し、1管あたり最大200マイクロリットルのウイルス溶液をアリコートします。
感染用量の平均ウイルス組織培養を決定するために、最初の種子は、100マイクロリットルの完全な培地で5つのS2スター細胞を100マイクロリットルの96ウェルプレートの12列に8個のウェルに1回10回播種する。その後、プレートを摂氏25度のインキュベーターに戻します。ランダムにマイナス80°Cのストレージからウイルスの5チューブを選択します。
細胞が沈降している間、10無菌1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管を450マイクロリットルの無菌完全培地で満たし、450マイクロリットルの無菌完全培地を含む最初の1.5ミリリットルチューブに50マイクロリットルのウイルスストックを加え、12番目のウェルに10倍の懸濁液を希釈します。インキュベーションの終わりに、各希釈液の50マイクロリットルをウイルスのそのチューブの各列の適切なウェルに加え、ネガティブコントロールウェルとして1列につき1つのウェルにウイルスのない培養培地の50マイクロリットルを加える。その後、プレートを摂氏25度のインキュベーターに3日間置き、毎日20倍の倍率でブライトフィールド顕微鏡の下で各ウイルスストックの細胞パシー効果を評価します。
細胞がぼやけて見え、媒体が正の井戸として断片でいっぱいであるウェルと、細胞の形態が陰性の井戸として正常である井戸を分類する。繁殖前に、テトラサイクリン1ミリリットル当たり50マイクログラムの400マイクロリットルを新鮮な標準コーンミールフライフードの4グラムと十分に混合し、エタノールを蒸発させるために一晩摂氏4度で食品を置きます。翌朝、食べ物を室温まで温め、食べ物と20人の雌と10人の新しく閉鎖された成人ハエを繁殖バイアルに入れ、通常の明暗サイクルで摂氏25度と湿度60%で3〜4日間の繁殖孵化を行います。
十分な卵が産まれたら、新たに閉鎖された成体のハエを二酸化炭素の軽い流れの下で集め、ちょうど実証したようにショウジョウバエを再び2回繁殖させる。テトラサイクリン処理の3世代後、二酸化炭素の軽い流れの下で5つのハエを収集し、二重蒸留水の250マイクロリットルと数0.5ミリメートルの滅菌セラミックビーズでハエを均質化します。1分後、サンプルをマイナス80°Cで凍結する前に、2XバッファAの250マイクロリットルを渦液に加えます。
次に、摂氏25度の水浴でマイナス80度の貯蔵からサンプルを素早く解凍し、続いて70°Cの水浴で30分間のインキュベーションを行い、ゲノムDNAを抽出し、標準的なプロトコルに従ってポリメラーゼ連鎖反応によってDNAを増幅する。標準プロトコルに従ってゲル電気泳動により各フライホモゲネートにウォルバキア16小RNAとwspが存在しないかどうかを確認する。その後、実証されているように、標準的なコーンミールフライ食品にウォルバキアフリーフライストックをリア。
ウイルス感染の場合は、まず、ナノインジェクションに適した直径までガラス毛細血管の先端を切断するために、実体顕微鏡と薄い鉗子を使用します。インジェクターを組み立てるには、大きなディンプルを外側に向けたインジェクタの金属プランジャーの上に天井のOリングとホワイトスペーサーを置きます。30ゲージの針を装備した注射器を使用して、ガラスの針にミネラルオイルを充填し、首輪に針を入れます。
大きなOリングを、針の鈍い端から約1ミリメートルの襟のベースの周りに置き、注射器のプランジャーに針を取り付けます。針をプランジャーに固定し、空のボタンを押してマイクロインジェクターのプランジャーを延長し、可聴信号が聞こえるまで延長します。今度は充填を押してプランジャー5ミリメートルを引き込み、針を100プラーク形成ユニットウイルスサスペンションに浸します。
20個のウォルバキアを含まない男性ショショウジョウバエのバイアルを1つまたは少なくとも3つのバイアルを注射皿にそっと振ります。男性の恵まれたハエは交配中に好まれ、繁殖はメスに影響を与える可能性があります。次に、メソプレウラとプテロプレウラの間のわずかに明るい色の領域で50.6ナノリットルのウイルス溶液を各フライの胸郭に注入し、ちょうど実証したように、細胞変性効果アッセイおよび定量的RT PCRによってDCV負荷を測定する。
注射後、ハエを新鮮なバイアルに慎重に移し、麻酔から回復している間にハエが媒体にくっつくのを防ぐために、バイアルを水平位置に置きます。注入は時間がかかるが、DCVの複製は非常に速いので、各バイアルからのハエがすべて注入された後、管の正確な時間を書き留めるのは非常に重要である。ウイルス感染は細胞のリシスを誘発し、細胞内症の影響は感染後3日で観察される。
ウォルバキア16s rRNAおよびwspプライマーは、実演するようにウォルバキアおよびショウジョウバエの存在を検出するために使用することができる。ウォルバキアフリーハエは、DCV感染後および用量依存的に有意に減少した生存率を示す。DCVは、ジエア2突然変異ハエにおける生存率の低下およびウイルス負荷の増加によって証明されるように、ショウジョウバエにおける抗ウイルス感染に重要である宿主における抗ウイルスシグナル伝達経路を活性化する。
この手順を試みる間、ウォルバキア遺伝子型の汚染は、DCV感染に飛ぶショウジョウバエのメラノガスターの感受性に影響を与える可能性があることを覚えておくことが重要です。この手順に従って、より大規模な遺伝的スクリーンのような他の方法は、ウイルス感染または抗ウイルス応答に必要な定義された宿主遺伝子の下での追加の質問に答えるために行うことができる。その開発後、この技術は、ヒトウイルス疾患の分野の研究者がショウジョウバエメラノガスターモデルにおける固有のヒトウイルス感染の流行の根底にあるメカニズムを探求する道を開いた。
ウイルスの処理は非常に危険であり、適切な保護具を着用するなどの予防措置は、この手順を実行する場合は常に取られる必要があることを忘れないでください。
