この作品は、NIH R01EY012949、R21EY018885、T32 EY0707133からの補助金によって部分的にサポートされていました。我々は彼の技術支援のためにダーウィンハングに感謝。

動物の使用に関する声明：動物は、ミネソタ動物実験の大学および使用委員会によって承認されたプロトコルを使用して、 実験動物の管理と使用に関するガイドに記載されているガイドラインに準拠して世話をした。 1）溶液の調製は、 <ol><li>電気生理学的細胞内記録、、外、及び酵素のソリューションを実行する前に準備する必要があります。 </li><li>細胞外溶液：H 2 Oと炭酸水素ナトリウム1.9gの（23 mM）を1リットルと粉末エイムズ&quot;メディアのミックスを一瓶（8.8グラム）（シグマ）。すべての点で、細胞外溶液を95％O 2 / 5％CO 2混合ガスで飽和されている。網膜のストレージのためのビーカーに200 mlを入れる。網膜がマウントされると、重力の灌流のための灌流システムコンテナ内の残りの溶液を置きます。 </li><li>細胞内液：細胞内液は、以前行われ、その後、500から1000μLアリコートに分注し、-20℃で保存されているはず125 K -グルコン酸、2のCaCl 2、2のMgCl 2、10 EGTA、10 HEPES、2ナトリウム2 - ATP、0.5mMのNaGTP：細胞内液は、我々が使用するここに示されている現在のクランプ記録（mMで）のために、必要な実験によって異なりますKOH 5の7.2にpHを。このような10μMAlexafluor - 594のような蛍光トレーサーヒドラジド（Invitrogen）を実験中に樹状突起を可視化するために追加することができます、とneurobiotin（0.3％）も録音後の細胞の解剖学の分析のために含めることができます。ときに録音する準備ができて、細胞内液を解凍。 </li><li>酵素溶液：細胞外液の4.150 mLに83 mgのヒアルロニダーゼ（ワーシントンの化学薬品）で104単位コラゲナーゼを（ワージントンの化学）結合。 -20℃で50μL分注し店アリコートを、数週間に使用することができます。ときに網膜を治療するために準備ができて、バブル細胞外液の500μLに分注して希釈する。 </li><li>リン酸溶液（PBS）をバッファ：H 2 O 800ml中にNaClを8gを、塩化カリウム0.2gのは、Na ​​2 HPO 4 1.4 gおよびKH 2物0.24g PO 4を追加。 NaOHで7.4にpHをもたらす。 1リットルの音量を調節する</li><li> 0.2 Mリン酸緩衝液：H 2 Oを800mlのNa 2 HPO 4 21.8 gおよびのNaH 2 PO 4 6.4 gを加える。 1リットルの容積をもたらす</li><li> 4％パラホルムアルデヒド溶液：ヒート60〜50ミリリットルH 2 O℃の4gのパラホルムアルデヒドを追加、数分間攪拌する。 1MのNaOH（5滴程度）を数滴を追加、溶液が透明になるまで攪拌してください。ビーカーに50ミリリットルの0.2 Mリン酸緩衝液を追加します。 pHのストリップを（〜7.4）を使用してpHを確認してください。フィルタと涼しい。 </li><li>ブロッキング溶液（10％ヤギ血清、0.5％TritonX100は）：PBSの1.8 mlにヤギ血清および10μLのトリトンX - 100 0.2 mlを加える。 TritonX - 100は、組織をpermeabiliseに提供しています。 </li><li>ストレプトアビジン溶液（5％ヤギ血清、0.5％TritonX100、1:500ストレプトアビジン594）：PBSの1.9 mlに10μLトリトンX - 100およびストレプトアビジン594 4μL、ヤギ血清の0.1 mlを加える。 </li></ol> 2）マウスから網膜の単離は、 必要な解剖ツール：1＃2鉗子、2＃5鉗子、眼科用はさみ<ol><li>この場合には、承認されたプロトコールに従って、マウスを安楽死させるには優しく目の後ろ斜めに第2鉗子を挿入し、眼球を持ち上げて2窒息と摘出眼球のCO。 </li><li>細胞外液で35ミリメートルシャーレに眼球を置きます。視神経と眼科はさみを使用して接続されているすべての外眼筋や結合組織をカット。眼科はさみで角膜を切り取ると＃5鉗子を用いてレンズを引き出します。 ＃5ピンセットを使用して強膜を引き裂き、網膜と強膜が視神経乳頭に会う視神経を切断するために鉗子を使用する。静かにアイカップから網膜ピール。ヒント：時間を最小限に抑えるために、次のステップに進む前に、両方の網膜上の各ステップを行います。 </li><li>網膜に接続されている硝子体を除去するために鉗子を使用してください。これは、鉗子で網膜上に透明な硝子を&quot;つかん&quot;で行うことができます。硝子体は、正常に除去されている場合、鉗子で明確に、ゼラチン状の物質として見えるはずです。ヒント：硝子体の半分以下の除去のスライスの網膜は、使用可能な組織の量を最大化し、チャンバー内に取り付けが容易になります。 </li><li>彼らは消化できるようになるまで、最小限の環境光で暗い環境で室温で酸素細胞外液中で網膜をしてください。網膜は〜6時間のためにこの方法で保存することができます。 </li></ol> 3）酵素混合物と網膜の治療と録音室に取り付け<ol><li> 500μLの細胞外液中のコラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼの分量は35mmシャーレ内の場所のソリューションを希釈し、網膜を転送する。 </li><li>網膜は、含まれておいてください穏やかに振とうしながら15分間95％O2 / 5％CO 2環境で暗闇に覆われ、INGペトリ皿、、。このステップでは、残りの硝子体の消化にも役立ちますし、神経節細胞層に容易にアクセスすることができます。ヒント：以下の硝子体の有無に悪影響が認められた場合には、若い動物から網膜のために、時間が〜5分に短縮することができます。 </li><li>酵素含有培地から網膜を取り出して、細胞外液中に広範囲に洗う</li><li>下向きに光受容体層とのチャンバ6を記録するに網膜を移す。ピペットまたは組織のいずれかで、残りの液体を離れて芯と、特に神経節細胞層との接触を避ける網膜の端だけを、触れないように注意して組織をフラット化する網膜の側面をロールアウト。組織を固定し、すぐに細胞外溶液チャンバーを埋めるために網膜上のナイロンメッシュでプラチナのリングを置きます。 </li><li> 、顕微鏡のステージに録音室をマウントする重力流と真空吸引用チューブを接続し、アース線を取り付けます。 </li></ol> 4）EGFPを発現する神経節細胞の局在と光刺激<ol><li>を1 mL / minまたはより速い速度で細胞外液で重力によって網膜を灌流。ヒントは：灌流速度が遅すぎる場合は、組織が十分に酸素化されず、シナプスのシグナル伝達が中断されることがあります。 </li><li>細胞内液と記録ピペットを記入し、ピペットホルダーに挿入します。ヒント：3〜5MΩの範囲の抵抗値を持つピペットは最良の結果を与える。 </li><li>記録ピペットをローカライズするために、低倍率（10倍目標、NA 0.3）で赤外線微分干渉コントラスト（DIC）光学系の下で網膜を視覚化する。赤外光は、可視光に対する網膜の露出を最小限に抑え、明順応を最小限に抑えるために使用されます。より高い倍率（40倍目標、NA 0.8）に移動して、単に組織上のビューに電極をもたらす。 </li><li>高倍率（40倍目標）で、落射蛍光（EGFPは480 nm）を網膜に点灯し、テープ（図1A）を使用してコンピュータのモニター上で蛍光神経節細胞とマーク]を選択します。 </li><li> DICと赤外線照明下で、標的神経節細胞（図1A）の近くに記録電極を配置します。すぐにポリエチレンチューブとピペットホルダーに接続されている12ccプラスチック製の注射器を介して、記​​録電極に穏やかな陽圧を印加することにより、セルをカバーするクリーンエリア。アンプでは、任意の電圧オフセットをゼロに。ディンプルは、細胞表面上に表示されるまで、選択された神経節細胞に電極を配置。 </li><li>電圧クランプモードのアンプでは、テストパルスを適用し、ピペットを流れる電流を監視します。電極とセルの間にシールを作成するために負圧を適用します。セルが保持電流は、細胞の膜とピペット間GΩ電気的シールの指標になるまで封印して待つことから始まる負圧を離します。容量性の過渡現象が現れるまで、負圧の穏やかなパルスを適用し、圧力の任意のアプリケーションをリリースする。ヒント：アクセス（シリーズ）抵抗が高い場合（&gt;30mΩ以下）、これは多くの場合、負圧の追加、非常に穏やかな、パルスによって改善することができる。 </li><li>いったん安定したシールが負圧のパルスを印加達している。全細胞モードが得られた後、セルが濃い5分間に適応することができます。フルフィールド、白色光刺激（図1B）に記録、電流クランプモードでは、応答。 </li><li>記録に続いて、Alexafluor - 594は、樹状突起への拡散があります。トレーサーは、594 nmで落射蛍光で可視化すると神経節細胞は、オン、オフ、または落射蛍光とDIC赤外線光学系5の間の切り替えによるBi -成層であるかどうかを判断するために使用できます。 </li><li> neurobiotinはピペットと網膜に含まれている場合は、ピペットを静かに膜の中断を最小限に抑えるを提供するために撤回されている必要があります、免疫組織化学のために処理されようとしています。 </li></ol>記録された神経節細胞の解剖学の5）の分析 neurobiotinで充填すると、記録は、次の神経細胞の詳細な形態学的な分析が可能になります。ヒント：記録された神経節細胞と詳細な形態との間の特定の相関関係が必要な場合は、それは準備に1つだけRGCを記録して記入するのがよいでしょう。 <ol><li> neurobiotinが細胞内液に含まれていた場合は、パラホルムアルデヒド溶液で網膜を配置し、4℃で一晩固定し℃、 </li><li> 、少なくとも2時間、PBSで少なくとも6変更をすすいでください。ブロッキング溶液を含むプレートに網膜を転送します。シェーカー上で、2時間室温をブロッキング溶液で残す。 </li><li>ストレプトアビジン溶液とブロッキング溶液を交換してください。 4℃で2日間振とう機上でCをインキュベートする。 PBSで網膜、6すすぎ、20分ごとにすすいでください。 </li><li>スライドガラスにVectashieldと網膜をマウントします。網膜は神経節細胞にまで配置する必要があります。共焦点顕微鏡（図1C）を実行します。 </li></ol>代表的な結果網膜が正常であると解離が成功した場合、個々の神経節細胞は、高倍率（図1A）でDICの下に表示されるはずです。不健康な網膜は、大規模な、粒状の核を持つことになりますし、破棄する必要があります。特定の神経節細胞のシナプス応答が変更されていない場合は、その後、細胞は本質的に感光性神経節細胞（図1B）、持続的な脱分極の場合には、光開始時に応答したり、活動電位を相殺してください。 <img src="/files/ftp_upload/2367/2367fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。ローカライゼーション、録音、および蛍光標識網膜神経節細胞の染色は、（A）GFP陽性RGCは40X倍率（左パネル）およびDIC照明（右パネル）の下で落射蛍光照明の下で可視化した。蛍光標識されたRGCからホールセル電流クランプモードで記録されたM2本質的に感光性の網膜神経節細胞の（B）シナプスの光の応答。 （C）neurobiotinで満たされた細胞全体の記録を対象と落射蛍光で識別されたM1本質的に感光性の網膜神経節細胞を、、、そしてその後、免疫組織化学用に処理。

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	<li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+processing+in+the+mammalian+retina.">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li><li>Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+extrinsic+light+responses+in+melanopsin-expressing+ganglion+cells+during+mouse+development.">Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development.</a> J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).</li><li>Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion.">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62, 327-334 (2009).</li><li>Siegert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+address+book+for+retinal+cell+types.">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells.">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29, 476-482 (2009).</li><li>Newman, E. A., Bartosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eyecup+preparation+for+the+rat+and+mouse.">An eyecup preparation for the rat and mouse.</a> J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).</li><li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines.">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li><li>Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+retinal+dopaminergic+neurons+underlying+their+multiple+roles+in+vision.">Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision.</a> J Neurosci. 27, 692-699 (2007).</li><li>Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flattened+retina-eyecup+preparation+suitable+for+electrophysiological+studies+of+neurons+visualized+with+trans-scleral+infrared+illumination.">A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination.</a> J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).</li><li>Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+circuitry+mediating+light-evoked+signals+in+dark-adapted+mouse+retina.">Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina.</a> Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).</li></ol>

この手法は、単離網膜から網膜神経節細胞の録音にも適用可能である。本質的に感光性の上に使用されるマウスのラインでも、メラノプシン発現RGCsがEGFP 2、5で標識され、このプロトコルは、他の蛍光標識RGCラインに容易に譲渡することはできませんかだけでなく、ランダムに選ばれたRGCsから記録するために一般化することができる。各RGCとそのそれぞれの入力ニューロンの樹状東?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ames&#x2019; Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A1420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whorthington Biochemical</td>
<td>LS005273</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whorthington Biochemical</td>
<td>LS002592</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S5761</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>AlexaFluor 594 Hydrazyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A10442</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurobiotin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>SP1120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>BF120-69-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ophthalmologic Scissor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin 594</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S32356</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Goat Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>005-000-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>19210</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells

光が網膜1のロッドと錐体光受容体を刺激するときに脊椎動物のビジョンの最初の手順が行われます。その後、この情報は、ONとOFF経路として知られているものに分けています。光強度の増大（BCSオン）または減少（BCSオフ）に反応して脱分極、双極細胞に光受容体の信号光情報（BCS）、。光情報のこの分離は、彼らがオフのBCから直接興奮性入力を受け取る内網状層（IPL）のオフsublamina、のいずれかで層化樹状突起を持つ網膜神経節細胞（RGCs）、のレベルで維持、またはに階層化され彼らはBCの上から直接興奮性入力を受け取るIPLの上sublamina、。照明の増減に関する情報（経路オンとオフ）のこの分離は、保存と並行して脳に通知されます。 RGCsは、網膜の出力細胞であるため、光情報は脳内の視覚的な核に通知される方法を理解するために勉強する重要な細胞です。ここ数十年にわたって、マウス遺伝学の進歩により、特定のRGC集団が電気生理学的記録のために標的とRGCサブタイプ2 3 4と特定の識別を可能にするために蛍光タンパク質で標識されている蛍光レポーターマウス系統の様々をもたらしました。ここで、我々はそのまま、孤立した網膜準備で蛍光標識神経節細胞からの光の応答を記録するための手法を提案する。この孤立した網膜の準備は、樹状アーバが損なわれていないと全体のRGC樹あずまやでの入力が保たれているRGCsから録音することができます。このメソッドは、神経節細胞のサブタイプの多様にわたって適用可能であり、単一細胞生理学的手法を用いての多種多様に従順です。

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An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

この記事では、細かく分析し、マウスで分離された網膜の準備から記録する方法の説明を提供します。特に、我々は、蛍光標識神経節細胞集団からの光の応答を記録し、続いてその形態を特定し分析する方法について説明します。

遺伝的に標識された網膜神経節細胞からの光は応答を記録するために隔離された網膜の準備

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K ビュー.  University of Minnesota. この記事では、細かく分析し、マウスで分離された網膜の準備から記録する方法の説明を提供します。特に、我々は、蛍光標識神経節細胞集団からの光の応答を記録し、続いてその形態を特定し分析する方法について説明します。

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

神経科学

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

網膜神経節細胞の生存を研究するために視神経挫滅モデルマウス

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

両生類網膜スライス標本における感光体と2次ニューロンからの同時ホールセル録音

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

マウスの網膜神経節細胞におけるシナプスと人工コンダクタンスによるダイナミッククランプの実装

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

蛍光色素で大人のゼブラフィッシュの網膜神経節細胞の逆行性標識

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

網膜神経節細胞の定義されたサブセットの単一細胞RNA-Seq

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

光干渉断層計: マウス網膜神経節細胞In Vivoイメージング

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

免疫組織化学用マウスレチンクライオ切片の調製

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

網膜神経節細胞を研究するためのマウス網膜単離とメタノール処理

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

著者スポットライト:網膜神経節細胞の研究のためのメタノールベースのホールマウント調製  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

網膜神経節細胞の研究のためのメタノールベースのホールマウント調製

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...