このプロトコルは、もともとリンダバックの研究室では小葉とマイケルPetrascheckによってシアトルのフレッドハッチンソンがん研究センターで開発されました。上記の詳細なバージョンは、より広いコミュニティに利用可能なすべての処理を行うために準備されています。私たちは、批判的にプロトコルを読み込むためのキャロルテイラー、サラルボーフとアンディTomacelliに感謝。これは、スクリップス研究所から原稿＃2866です。 Petrascheckラボは、ノバルティスADIのプログラムによって運営されている。

概要：プロトコルは4つの部分に分割されています。第1部では、摂食バクテリアを準備する方法について説明します。第2部では、ワームの文化を準備する方法について説明します。パート3は、寿命を獲得する方法について説明します。パート4は、いくつかの代表的な結果を示し、そして第5は、必要なソリューションを準備する方法について説明します。寿命の実験が完了するまでに数週間かかる。各プロトコルの週のステップ、一日、一日の時間の計画を容易にするために含まれています。 L4段階（0日）は全体のプロトコルのための基準点として使用されます。 1。摂食菌の調製このセクションでは、摂食細菌の準備について説明します。特定のE.大腸菌は線虫を供給するために使用菌株OP50と呼ばれています。他の細菌とワームの文化の交差汚染を防ぐために、このプロトコルに先立ち、OP50菌株をカルベニシリン/アンピシリン耐性21なされている。事前にOP50 4〜5日を準備します。 OP50と接触するすべての材料は無菌でなければならない。 -7日：木曜日（週1）：接種で、37夜にわたってシングルOP50コロニーとインキュベートします細菌のシェーカーでCと100μg/ mlのアンピシリンおよび0.1μg/ mLのアムホテリシンBを含むTBの5 mLの。 日-6：金曜日（週1）。 朝8時半。文化のための十分な時間が飽和状態に到達できるように早期に接種する<ol><li> 50μg/ mlのアンピシリンを含む300mLのTBでOP50 1:2000の一晩培養を希釈する。飽和状態に達するまで37℃で8-12時間のための細菌シェーカー° Cで培養液を、。文化が14時間よりも長く成長するようにしてください。 </li><li>滅菌、事前に加重遠心分離管にOP50を移す。ペレットテーブルトップ遠心機3500回転（2200 × g）で10分間の遠心分離によってOP50。 </li><li>上清を捨て、遠心分離によって滅菌水及び再ペレットのOP50ペレットを再懸濁する。二回洗浄を繰り返します。 </li><li>回目の洗浄後、残りのすべての水を慎重に取り外します。ない水がチューブ内に残っていない必要があります。ペレットを含む遠心管の重量を測定し、ペレットの重量を決定するために、空の遠心管の重量を引く。 </li><li>徹底的には100 mg / mLの濃度にS -完全にペレットを再懸濁する。いいえ塊が残ってはいけません。 </li><li> 100 mg / mLのOP50の濃度は2 × 10 10細菌/ mlに対応している必要があります。 mL当たり細菌の光学密度と数との関係が知られている場合mL当たりの細菌数を決定するために写真の分光器を使用してください。必要に応じて、2 × 10 10細菌/ mlにOP50栄養溶液の濃度を調整する。 </li><li>それはワームの培養に使用されるまで4℃でOP50solution保管してください。 </li></ol> 2。同期ワームの文化の調製このセクションでは、ワームの文化の準備について説明します。その目標は、ワームの年齢同期人口を生成することです。手順5の漂白剤治療後の線虫との接触のすべての材料は無菌でなければならない。特に断らない限り、プレートを20℃に保たれている。 日-6：金曜日（週1）、16:00に： 新鮮なプレートに動物を転送 <ol><li>ワームの人口の大多数が飢餓のL1幼虫から構成される5〜10日齢のNGMプレートを取る。 </li><li>まもなくブンゼンバーナーの上に加熱することによって、金属へらを滅菌する。それが冷ます。飢えたワームを含むプレートから寒天の塊を切り出すために冷却ヘラを使用してください。 OP50を接種した新鮮な10cmのNGMプレート上に、これらのチャンクのいくつかを移す。約インキュベート。ワームの人口の大半が妊娠成人で構成されています° Cまで20℃65時間。それは妊娠大人に成長するために飢えたL1の動物のために要する時間は、菌株から菌株によって異なる場合があります。 </li></ol> デイ-3：月曜日（週2）午前10:00は： 同期人口を確立 <ol start="3"><li> 50〜10 mLの滅菌水でプレートを離れてそれらを洗浄して10 cmのプレートからワームを収集する。 15 mLコニカルチューブにワーム/水溶液を移す。 </li><li> 1200rpmで（280 × g）で卓上遠心機で2分間の遠心分離することによって、ワームを洗ってください。上清を捨て、10mlの水を加える。繰り返します。 </li><li>上清を除去し、作りたての漂白剤/ NaOH溶液（2.5 mLの家庭用漂白剤、1mLの10N水酸化ナトリウム、6.5 mLのH 2 O）5 mLを加える。ワームが開いて中断するまで、室温で5分間インキュベートする。穏やかにボルテックス毎分にしてください。解剖顕微鏡下で反応の進行状況を監視します。 </li><li>とすぐにすべての大人の反応を中和するために追加、M9バッファー5 mLを溶かす。 </li><li> （2500rpmで2分を遠心分離することによって10mLのM9バッファーで卵を3回洗浄1100 × g）で。 </li><li> 2500 RPM（1100 × g）で2分を遠心分離することによって10mlのS -完全で一度卵を洗ってください。 </li><li>上清を除去、10mLの新鮮な50 mLコニカルチューブに解決策をS -完了し、転送する追加します。 40mlの最終容量にS -完全30mLを追加します。優しくnutatorまたは類似のデバイス上で、室温で一晩チューブを振る。 </li></ol> 日-2：火曜日（週2）、12:00： プレートにシード動物を <ol start="10"><li>解剖範囲の下で、ワームは夜の間に孵化したかどうかを確認してください。解剖スコープを使用して10μL滴のワームの数をカウントすることでS -完全なソリューションで、ワームの濃度を決定する。各サンプルの少なくとも10滴を数える。 </li><li> S -完全に80から100ワーム/ mLの濃度でワームを再び一時停止。は0.1μg/ mlの最終濃度50μg/ mLとし、アムホテリシンB（株式250μg/ mlの）の最終濃度にカルベニシリンを（株式は100 mg / mL）を追加。 nutatorに振る。ワームの大規模な量を準備している場合、フィルタキャップで600mlのnunclonのフラスコを使用してください。 </li><li>午後2時30分に6 mg / mLの（= 1.2 × 10 9細菌/ ml）の最終濃度になるようにパート1で調製したOP50を追加。 OP50〜4℃を返す</li><li> 96ウェルプレートの各ウェルにworm/OP50ソリューションの120μLを転送する。透明な底部を96ウェルプレートを使用してください。ピペッティングしながら懸濁液中にワームを維持することを確認してください。 </li><li>汚染や蒸発を避けるために、テープシーラーを使用してプレートをシール。 2分間のマイクロタイタープレートシェーカー上でプレートをシェイクし、動物がL4段階に達するまで20℃で2日間Cインキュベートする。 </li></ol> 0日目：正午前の木曜日（週2）：Fluorodeoxyuridine（FUDR）を追加することによって、動物を滅菌 <ol start="15"><li>動物を滅菌するために各ウェルに0.6 mMのFUDRストック溶液30μLを加える。このステップでは、150μLを各ウエルに最終的なボリュームをもたらし、5 mg / mLの（1 × 10 9細菌/ ml）に6mgを/ mLからOP50の最終濃度を低減します。テープシーラーを使用してプレートをシールし、マイクロタイタープレートシェーカー上で2〜3分間、それを振る。 OP50は、日-2の2時30分追加されている場合、それはFUDRは正午前に追加されていることが重要です。 20℃インキュベーターにプレートを返す</li></ol> 1日目：金曜日（週2）： 文化に薬を追加 <ol start="16"><li> 9時までの動物のほとんどが妊娠し、それぞれいくつかの卵が含まれていることが必要です。その効果は寿命に所望の濃度で試験される薬剤を追加。 DMSO中で薬物を溶解する場合、DMSOの最終濃度は0.6％が線虫の寿命を短くするよりもDMSOの濃度が高いとして、0.6％を超えないようにしてください。薬剤の添加後、テープシーラーでプレートをシールし、マイクロタイタープレートシェーカー上で2〜3分間、それを振る。 20℃インキュベーターにプレートを返す</li><li>薬を追加すると、時々水以外の溶媒を使用する場合は特に、プレート当たり少数の動物を殺すことができる。動物の死骸を確認するために倒立顕微鏡を使用してください。一般的に、96ウェルプレートあたり10未満の動物の死骸があるはずです。 20℃インキュベーターにプレートを返します。 </li></ol> 4日目：月曜日（週3）： 変更シーラー <ol start="18"><li>シーラーを削除する文化を入力するように新鮮な酸素を許可するには、1分間待ってからプレートを再シール。マイクロタイタープレートシェーカー上で2〜3分間プレートを振る。毎週一回繰り返します。 </li></ol> 第5日：火曜日（第3週）： 飢餓を防ぐために、新しいOP50を追加する <ol start="19"><li>飢餓を防ぐために、96のウェルの各々にパート1で作製した100 mg / mLのOP50溶液5μLを追加。 </li></ol> 3。寿命のスコアリング。 このセクションでは、動物が死ぬまでパート2の同期ワームの人口の生存率が監視されている方法について説明します。 96ウェルプレートで動物を観察するには、2倍または2.5倍を目的とした倒立顕微鏡を使用してください。週3回、生存データを記録し、月曜日、水曜日と金曜日。動物が生きているか死んでいるかどうかを判断する動きを使用してください。強い光、特に青色光は、移動する動物を誘導する。アッセイから動物の死骸を削除しないでください。時折、移動していないと、前のカウントには死んで決定された動物は、後で移動する場合があります。 <ol><li> 0日目に、実験の開始時に各ウェルにワームの総数を数えます。これらの井戸の動物としての分析から、18以上の動物が含まれている井戸の検閲は、十分なOP50を持っていないし、食事制限の効果が表示されます。 </li><li>動物は2分間のマイクロタイタープレートシェーカー上で96ウェルプレートを振る移動する機会を増やすために。カウントの前に。 </li><li>各カウントセッション、基準日と動物の数になる生きた動物のように移動する。液体の動きは、固形培地上でよりもはるかに簡単ですし、強力なライトで誘導することができる。より高い倍率の使用は、咽頭の先端のそれらのような非常に微妙な動きを見つけるのに役立つことがあります。そのような微妙な動きは、しばしば非常に古い動物で観察された唯一の運動です。 </li><li> 20℃インキュベーターにプレートを返す</li><li>すべての動物が死んでいるまで2〜3日ごとに2-4を繰り返します。 </li></ol> 4。代表的な結果。 このセクションでは、このアッセイといくつかの代表的な結果によって生成された寿命のデータの記録を保持する方法の例を示しています。 図1Aは、このアッセイ中に寿命のデータを記録する方法の例を示しています。 Excelシートは、各ウェルにおける集団の生存を追跡するために使用されます。各ウェルは、プレート、ひずみ、薬剤、薬剤の濃度と0日で生きている動物の総数（X0）で調整しているため、実験の開始時に記録されます。レコードの日付だけでなく、生者と死者の動物の数は三回、各ウェル内の様々な集団の生存率を追跡するために週。グラフの結果をするために、それぞれの日の生きている動物の割合を計算し、日数、時間の関数としてプロットします。 P -値は、STATAまたは類似のソフトウェアのような統計パッケージを使用して計算する必要があります。 線虫の培地の寿命は温度に依存しています。図1Bは、寿命の温度依存性の変化が正確に寿命アッセイ22をベースにマイクロタイターで再現されていることを示しています。同様に、マイクロタイタープレートアッセイは、野生型N2の動物23〜24 25（図1C）とは異なる寿命を持つことが報告された変異体からの寿命の変化を再現。 アッセイはまた、より定量的な文を作るために使用することができます。 Fig1Dの平均値での寿命はMirtazepine濃度7の関数としてプロットされます。各データポイントは7-12人口の平均寿命は、別の井戸でそれぞれの生活を表しています。ウェル当たりの動物数は、（5-15動物）が比較的低くてもエラーバーから見られるようにウェル間のばらつきは比較的小さいです。 <img src="/files/ftp_upload/2496/2496fig1.jpg" alt="図1" /> 図1寿命アッセイに基づいてマイクロタイタープレートには、正確に寿命の変化は文献で ​​報告されて再現。 （A）サンプルデータはExcelスプレッドシートに収集。各カウントセッションの日付の間に、うまく座標とのライブや死んだ動物の数を記録した。実験の開始時に、各ウェル中の動物の合計数を測定した。 （B）20℃で成長させた野生型（N2）の動物の生存曲線° Cと25℃寿命に影響を与える変異を持つ菌株の（C）の生存曲線。すべての4つの株は20℃で並行して検定したMirtazepine扱わN2の動物の（D）の用量反応曲線。平均寿命はMirtazepine濃度の関数としてプロットされます。エラーバーは、条件ごとに8連のSEMを示す。 5。材料。 M9バッファー、1000mLの<ul><li> 6グラムのNa 2 HPO 4 </li><li> 3グラムのKH 2 PO 4 </li><li> 5gのNaCl </li><li> 0.25グラムのMgSO 4∙7H 2 O </li><li> 1000mLの脱イオン水を追加します。 </li><li>オートクレーブ</li></ul> Potassiumphosphate緩衝液pH6.0、1000mLの<ul><li> 136グラムのKH 2 PO 4 </li><li> 900mLの脱イオン水を追加します。 </li><li> 5M KOHでpHを6.0に調整する</li><li> 1000mLの脱イオン水を追加します。 </li><li>オートクレーブ</li></ul>微量金属溶液<ul><li> 1.86グラムのNa 2 EDTA </li><li> 0.69グラムのFeSO 4∙7H 2 O </li><li> 0.20グラムMnCl 2を ∙4H 2 O </li><li> 0.29グラムZnSO 4∙7H 2 O </li><li> 0.016グラムのCuSO 4 </li><li> 1000mLの脱イオン水</li><li>オートクレーブと暗闇の中で保管。 </li></ul> S -基礎培地、1000mLの<ul><li> 5.9グラムのNaCl </li><li> 1Mリン酸カリウム、pH6.0の50 mLの</li><li> 1000mLの脱イオン水</li><li>オートクレーブ</li><li> 5mgの/ mLのコレステロール（ET - OHに溶解）を1 mLを追加して解決策を冷ますと。 </li></ul>クエン酸カリウムの1M、1000mLの<ul><li> 268.8グラムのカリウムのクエン酸</li><li> 26.3クエン酸一水和物</li><li> 900mLの脱イオン水を追加します。 </li><li> 5M KOHでpHを6.0に調整する</li><li> 1000mLの脱イオン水を追加します。 </li><li>オートクレーブ</li></ul> S -完全培地、1000mLの<ul><li> 977 mLのS -基底</li><li> 10mLの1Mクエン酸カリウムのpHは6（無菌） </li><li> 10mLの微量金属溶液（滅菌） </li><li> 3ミリリットル1MのCaCl 2（無菌） </li><li> 3 mLの1M MgSO 4を （無菌） </li></ul> NGM寒天培地<ul><li> 3.0グラムのNaCl </li><li> 2.5グラムペプトン（カゼインから、膵臓ダイジェスト） </li><li> 17グラム寒天</li><li>脱イオン水975 mLとし、攪拌バーを追加する</li><li>オートクレーブ</li><li> 55クールダウンオートクレーブ後° Cと、次のコンポーネントを追加します。 <ul><li> 1MのCaCl 2（無菌）の0.5 mLを</li><li>エタノールで5mgの/ mLのコレステロールを1 mL </li><li> 1M MgSO 4を （滅菌）1mLの</li><li> 25mLのPotassiumphosphate緩衝液、pH6.0（無菌） </li></ul></li></ul> TB、1000mLの<ul><li> 12グラムバクトトリプトン</li><li> 24グラムの酵母エキス</li><li> 4 mLのグリセロール</li><li> 900mLの脱イオン水を追加します。 </li><li>オートクレーブ</li><li> 55クールダウンオートクレーブ後° Cと、以下のコンポーネントを追加します。 <ul><li> 0.17M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4の100 mLを加え</li></ul></li></ul> 0.6mmのFluorodeoxyuridine（FUDR、Sigmaカタログ＃F0503）、1000mLの<ul><li> 100mgのFUDR </li><li> S -完全な滅菌670 mLに溶かし、10 mLまたは45 mLのアリコートを行います。 </li><li> -20℃で保存</li></ul>は100 mg / mlカルベニシリン、10 mLの<ul><li> 1グラムカルベニシリン</li><li> 10mLの滅菌脱イオン水</li><li>無菌ろ過し、分注し</li><li> -20℃で保存</li><li>濃度50μg/ mlの最終濃度で使用</li></ul> 250ug / mLのアムホテリシンB、4 mLの<ul><li> 1mgのアムホテリシンB </li><li> 4 mLのET - OH </li><li> -20℃で保存</li><li>は0.1μg/ mlの最終濃度で使用</li></ul>

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A. 96, 7394-7397 (1999).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li><li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+life-span+in+Caenorhabditis+elegans+by+four+clock+genes.">Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes.</a> Science. 272, 1010-1013 (1996).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

提示プロトコルは、96ウェルマイクロタイタープレート中の線虫の寿命を測定することができます。代表的な結果に示すようにセクションには、確実にこれまでの知見を複製し、定量的な情報を提供します。このアッセイを使用して我々が正常に線虫の寿命に与える影響については89000の分子を介してスクリーニングしている。 薬剤スクリーニングの目的のために、96ウェルマイクロタイタープレートフォーマットでの寿命を測定することは古典的な固体培地アッセイに比べていくつかの利点があります。それはメディアの準備、インキュベーションスペースの量、および必要な薬剤の量に要する労力が軽減されます。 96ウェルフォーマットと顕微鏡のセットアップは、ハイスループットスクリーニングのための全体のアッセイの自動化を可能にする。 アッセイの開発中にこれらの各変数との組み合わせに対して複数の値は、 線虫の寿命に与える影響について試験した。これらのテストは、3〜10の範囲の異なるOP50濃度を含めmg / mLの（3、4、6、8、10 mg / mL）は、7〜45（7、10、15、22、45に至るまで、ウェル当たりワームの数が異なるワーム/ウェル）、40から150ウェルあたりμL（40、60、80、100、120、150μL）、および緩衝液組成の変化に至る様々な文化のボリューム。示された濃度のカルベニシリン耐性OP50、カ ​​ルベニシリンもアムホテリシンBのどちらと供給は、 線虫の寿命に影響を及ぼすことが判明した場合。プレートの連続穏やかに振盪しながら、できるだけ頻繁に虫液体培地で推奨されているが、このアッセイで使用されている小さなボリューム用する不要が判明した。大きな井戸とマイクロタイタープレートを使用する場合は穏やかに振盪しながらしかし必要となります。このプロトコールに示された値は、慎重にテストされたさまざまな条件の統計的な比較に基づいて選択されています。 このアッセイの最も驚くべき特徴は、おそらく虫がテープで封印されている96ウェルプレートに保持することができるという事実です。サイドバイサイドの比較はプラスチックシーラーで密封板で、または空気の交換を可能にするシーラーで密閉プレートで、非密閉型プレートで培養した動物の寿命の違いを明らかにしなかった。 3つの条件すべてに、動物はL1から65時間以内に妊娠した大人への非常に均質に開発され、非常に匹敵する寿命を示した。 NGM上で並行して成長の動物は、わずかに速い開発が、この違いは、シーラーの存在または非存在とは無関係であった。 提示プロトコルは、生菌に基づいていますが、死菌に適合させることができる。しかし、液体アッセイで単一の生存細菌が急速に増殖することができると文化を再作成してください。私たちの手で、それらは液体培養に使用できる程度に細菌を殺すために唯一の信頼できる方法では、ガンマ線照射による細菌の長期治療することです。 寿命の実験の計画で考慮すべき重要なポイントの1つは、検出の力です。効果の大きさに依存して、関心の薬剤の効果は、複数のウェルにテストする必要があります。大体40〜50の動物それぞれに対応する典型的なアッセイ4薬物治療と4つの制御井戸で、実験の95％以上の寿命が30％増加を検出するために十分です。 14％の増加は、患者の60％で検出し、従ってより多くの複製井戸が必要とされています。 このアッセイによって生成された寿命のデータの富は、実験を開発したり、特定のパラメトリックゴンペルツモデル1株に使用することができます。これらのゴンペルツモデルは、検出の電力を決定するために、大規模スクリーンのために偽陽性と陰性の数を推定するために便利です。我々は、ブラインド実験では、これらのモデルの予測を検証し、大画面（未発表の結果）で偽陰性の数を推定するためにそれらを使用する。 要約すると、我々は提示アッセイは、 線虫の寿命を延ばすと根本的なメカニズムを研究する小分子を同定するために大いに役立つと期待しています。

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Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Amphotericin B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>cat# 171375</td>
<td>Also called Fungizone</td>
</tr>
<tr>
<td>FUDR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>cat# F0503</td>
<td>FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water</td>
</tr>
<tr>
<td>Mianserin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>M2525-250MG</td>
<td>Use as positive control at 50&mu;M final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyproheptadine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>cat#C6022-MG</td>
<td>Alternative positive control at 10 &mu;M final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Sealing Tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>cat# 236370</td>
<td>Polyester, non-sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>96 well plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>cat# 351172</td>
<td>Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene</td>
</tr>
<tr>
<td>Nunclon flask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>cat# 178883</td>
<td>used for large volumes</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates

寿命はいくつかの遺伝的経路により調節生物学的なプロセスです。老化の生物学を調査する一つの戦略は、年齢、調節経路の成分の港の変異その動物を研究することです。これらの変異は摂動年齢規制経路の機能を、したがって全体の生物の寿命を変更する場合、彼らは1-3の重要なメカニズムの洞察を提供しています。 寿命の規制を調査するために別の戦略は、摂動年齢調節経路に小分子を使用することです。日付に、分子の数は、様々なモデル生物の寿命を延ばすことが知られていると4-16を老化の生物学を研究するためのツールとして使用されます。これまでに同定された分子の数は、高齢化の生物学を研究するために利用できる遺伝&quot;ツールセット&quot;に比べて小さいです。 線虫（Caenorhabditis elegans）は 、その優れた遺伝学と三週間の短い寿命のため経年変化を研究するために使用される原理のモデルの一つです。最近では、 線虫は、その小さなサイズとマイクロタイタープレート中で成長する能力の表現型に基づく薬剤の画面5,7,16-20のためのモデル生物として注目されています。 ここでは、96ウェルマイクロタイタープレート中で線虫の寿命を測定するアッセイを提示する。アッセイを開発し、成功した線虫の寿命7を拡張する分子のために大規模なライブラリーをスクリーニングするために使用されていました。アッセイの信頼性は、複数の試験で評価した：最初に、異なる温度で成長野生型動物の寿命を測定することによって、第二、変更された寿命を持つ変異体の寿命を測定することによって、第三に、異なる濃度に反応して寿命の変化を測定することにより、抗うつMirtazepineの。 Mirtazepineは、以前に虫 7の寿命を延ばすことが示されている。これらのテストの結果は、アッセイは、他のアッセイから、以前の結果を再現することができると定量的であることを示している。マイクロフォーマットは、自動液体ハンドリングシステムとこの寿命アッセイの互換性が高まりますし、自動化されたプラットフォームへの統合を可能にします。

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Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

このプロトコルでは、測定する手法を提案<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em96ウェルマイクロタイタープレートの&gt;寿命。

計測線虫（Caenorhabditis elegans）</em96穴マイクロタイタープレートの>寿命

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

36.4K ビュー.  The Scripps Research Institute. このプロトコルでは、測定する手法を提案線虫（Caenorhabditis elegans）寿命。

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Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

計測線虫（Caenorhabditis elegans）</em固体培地上>寿命

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

生物学

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

高齢者の細胞の伸長によって酵母年表寿命の定量化

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

出芽酵母の複製寿命の測定

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

アイスキャップ：成長させる方法シロイヌナズナ</emハイスループットジェノタイピング用96ウェルプレートで>とトマト

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

基本的な<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans</em&gt;方法：同期との観測

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

におけるプロスタグランジンの抽出と分析<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

の酸化ストレス抵抗を測定<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt; 96ウェルのマイクロタイタープレート中

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

C.エレガンスにおけるRANペプチド毒性の測定

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

計測線虫（Caenorhabditis elegans）寿命

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