Dieses Protokoll wurde ursprünglich auf Fred Hutchinson Cancer Research Center in Seattle durch Xiaolan Ye und Michael Petrascheck entwickelt im Labor von Linda Buck. Die ausführliche Version über wurde erstellt, um das gesamte Verfahren zur Verfügung, um der größeren Gemeinschaft zu machen. Wir bedanken uns bei Carol Taylor, Sarah LeBoeuf und Andy Tomacelli für die kritische Durchsicht des Protokolls. Dies ist Manuskript # 2866 von The Scripps Research Institute. Die Petrascheck Lab wird von der Novartis ADI-Programm finanziert.

Überblick: Das Protokoll ist in vier Teile aufgeteilt. Teil 1 beschreibt, wie die Fütterung Bakterien vorbereiten. Teil 2 beschreibt, wie der Wurm Kultur vorzubereiten. Teil 3 beschreibt die Lebensdauer des Gastes. Teil 4 zeigt einige repräsentative Ergebnisse, und Teil 5 beschreibt, wie die erforderlichen Lösungen herzustellen. Lebensdauer Experimente dauern mehrere Wochen in Anspruch. Für jeden Schritt des Protokolls Woche, Tag und Uhrzeit des Tages aufgenommen, um die Planung zu erleichtern. Die L4 Stadium (Tag 0) wird als Bezugspunkt für das gesamte Protokoll verwendet. 1. Vorbereitung der Fütterung Bakterien Dieser Abschnitt beschreibt die Vorbereitung der Fütterung Bakterien. Die spezifische E. coli-Stamm verwendet, um C.elegans feed heißt OP50. Vor diesem Protokoll, um eine Kreuzkontamination der Wurm Kultur mit anderen Bakterien zu verhindern, hat die OP50 Belastung gemacht Carbenicillin / Ampicillin resistent 21. Bereiten Sie das OP50 vier vor fünf Tage im Voraus. Alle Materialien in Kontakt kommen mit OP50 müssen steril sein. Tag -7: Donnerstag (Woche 1): Impfen 5 ml TB mit 100 ug / ml Ampicillin und 0,1 ug / ml Amphotericin B mit einem OP50 Kolonie und Inkubation über Nacht bei 37 ° C in einem bakteriellen Schüttler. Tag -6: Freitag (Woche 1). Morgen 8:30 Uhr. Impfen früh, um genügend Zeit für die Kultur bis zur Sättigung zu erreichen <ol><li> Verdünnen Sie die Nacht-Kultur von OP50 1:2000 in 300 ml TB mit 50 ug / ml Ampicillin. Inkubieren Sie die Kultur in einem bakteriellen Schüttler für 8-12 Stunden bei 37 ° C bis zur Sättigung erreicht ist. Nicht in die Kultur zu wachsen länger als 14 Stunden. </li><li> Übertragen Sie die OP50 in eine sterile, pre-gewichteten Zentrifugenröhrchen. Pellet der OP50 durch Zentrifugation für 10 min bei 3500 rpm (2200 xg) in einer Tischzentrifuge. </li><li> Überstand verwerfen und wieder aussetzen OP50 Pellet in sterilem Wasser und re-Pellet durch Zentrifugation. Wiederholen Sie diesen waschen zweimal. </li><li> Nach dem zweiten Waschen, entfernen Sie sorgfältig alle das restliche Wasser. Darf kein Wasser in die Röhre gelassen werden. Wiegen Sie das Zentrifugenröhrchen mit dem Pellet und subtrahieren das Gewicht des leeren Zentrifugenröhrchen, um das Gewicht der Pellets zu bestimmen. </li><li> Gründlich resuspendieren Sie das Pellet in S-complete zu einer Konzentration von 100 mg / mL. Keine Klumpen überlassen werden sollte. </li><li> Die Konzentration von 100 mg / mL OP50 auf 2 x10 10 Bakterien / ml entsprechen. Verwenden Sie ein Foto-Spektrometer, um die Anzahl der Bakterien pro ml zu bestimmen, ob die Beziehung zwischen der optischen Dichte und der Anzahl der Bakterien pro ml bekannt ist. Falls erforderlich, die Konzentration der OP50 Fütterung Lösung zu 2 x10 10 Bakterien / ml. </li><li> Bewahren Sie die OP50solution bei 4 ° C, bis es für den Wurm Kultur verwendet. </li></ol> 2. Erstellung eines Synchron-Worm Kultur Dieser Abschnitt beschreibt die Herstellung des Wurms Kultur. Sein Ziel ist es, ein Alter-Synchron-Bevölkerung von Würmern zu generieren. Alle Materialien in Kontakt kommen mit C.elegans nach der Bleiche Behandlung in Schritt 5 müssen steril sein. Die Platten werden bei 20 ° C, sofern nicht anders angegeben. Tag -6: Freitag (Woche 1), 04.00 Uhr: Transfer der Tiere auf eine frische Platte <ol><li> Nehmen Sie etwa 5-10 Tage alten NGM Teller, auf dem die Mehrheit der Wurm Bevölkerung besteht aus verhungert L1-Larven. </li><li> Sterilisieren einem Spatel durch kurzes Erhitzen über einem Bunsenbrenner. Lassen Sie sie abkühlen. Verwenden Sie den gekühlten Spatel zum Ausschneiden Agar Stücke von der Platte mit den verhungerten Würmer. Übertragen mehrere dieser Stücke auf eine frische 10 cm NGM-Platte ausgesät mit OP50. Inkubieren für ca.. 65 Stunden bei 20 ° C, bis die Mehrheit der Wurm Bevölkerung besteht aus gravid Erwachsene. Die Zeit, die für die ausgehungerten Tiere L1 in gravid Erwachsenen wachsen kann von Stamm zu Stamm unterschiedlich. </li></ol> Tag -3: Montag (Woche 2) 10.00: Einführung eines synchronen Bevölkerung <ol start="3"><li> Sammeln Sie Würmer aus dem 10 cm Platte durch Waschen Sie die Platte mit 5-10 mL sterilem Wasser. Übertragung der Wurm / Wasser-Lösung in einen 15 mL konischen Rohr. </li><li> Waschen Sie die Würmer durch Zentrifugation 2 min in einer Tischzentrifuge bei 1200 rpm (280 xg). Überstand verwerfen und 10 ml Wasser. Wiederholen. </li><li> Überstand entfernen und 5 ml frisch zubereitete Bleiche / NaOH-Lösung (2,5 ml Bleiche, 1 mL 10 N NaOH, 6,5 mL H 2 O). Inkubieren für 5 Minuten bei RT, bis die Würmer offenen Bruch. Achten Sie darauf, vortexen jede Minute. Überwachen Sie den Fortschritt der Reaktion unter dem Binokular. </li><li> Sobald alle Erwachsenen zu lösen, 5 ml M9-Puffer, um die Reaktion zu neutralisieren. </li><li> Waschen Sie die Eier dreimal mit 10 mL M9-Puffer durch Zentrifugation 2 min bei 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Waschen Sie die Eier einmal mit 10 mL S-complete durch Zentrifugation 2 min bei 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Entfernen Sie den Überstand, 10 ml S-complete und die Lösung in ein frisches 50 mL konischen Rohr. 30 ml S-complete, um ein Endvolumen von 40 mL. Schütteln Sie das Rohr über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Kolbenpendel oder ein ähnliches Gerät. </li></ol> Tag -2: Dienstag (Woche 2), 12:00 Uhr: Seed die Tiere in Platten <ol start="10"><li> Unter dem Binokular, zu prüfen, ob die Würmer in der Nacht geschlüpft. Bestimmen Sie die Konzentration von Würmern in der S-Komplettlösung durch Zählen der Anzahl der Würmer in 10 ul Tropfen mit einem Binokular. Graf mindestens 10 Tropfen für jede Probe. </li><li> Re-suspend die Würmer in einer Konzentration von 80-100 Würmer / mL in S-abgeschlossen. Add Carbenicillin (Bestand 100 mg / mL) zu einer Endkonzentration von 50 ug / mL und Amphotericin B (Bestand 250 ug / mL) zu einer Endkonzentration von 0,1 pg / mL. Schütteln auf einem Kolbenpendel. Wenn die Herstellung größerer Mengen von Würmern, verwenden Sie einen 600 mL Nunclon Kolben mit Filterdeckel. </li><li> Am 14.30 Uhr fügen Sie die OP50 in Teil 1 bis zu einer Endkonzentration von 6 mg / mL (= 1,2 x10 9 Bakterien / ml) hergestellt. Senden Sie das OP50 bis 4 ° C. </li><li> Transfer-120 ul der worm/OP50 Lösung in jedes Well einer 96-Well-Platte. Verwenden Sie 96-Well Platten mit transparentem Boden. Vergewissern Sie sich, um die Würmer in der Schwebe zu halten beim Pipettieren. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit einem Tape-Versiegelung auf Kontamination und Verdunstung zu vermeiden. Schütteln Sie die Platte auf einem Schüttler für 2 min und Inkubation für 2 Tage bei 20 ° C, bis die Tiere die L4 Stadium zu erreichen. </li></ol> Tag 0: Donnerstag (Woche 2) vor dem Mittag: Sterilisieren Tiere, indem Fluordeoxyuridin (FUDR) <ol start="15"><li> Um die Tiere zu sterilisieren add 30 ul einer 0,6 mM FUDR Stammlösung in jede Vertiefung. Dieser Schritt bringt das Endvolumen in jeder Vertiefung zu 150 ul und reduziert die Endkonzentration des OP50 von 6 mg / ml bis 5 mg / mL (1x10 9 Bakterien / ml). Verschließen Sie die Platte mit Klebeband Versiegelungen und schütteln Sie sie für 2-3 min auf einem Schüttler. Wenn das OP50 war um 2:30 am Tag -2 hinzugefügt, ist es wichtig, dass die FUDR vor Mittag wird hinzugefügt. Zurück Platten, die 20 ° C Inkubator </li></ol> Tag 1: Freitag (Woche 2): Fügen Sie Medikamente zur Kultur <ol start="16"><li> Um 9:00 Uhr die meisten der Tiere sollten gravid und enthalten mehrere Eier jeden. Fügen Sie die Medikamente, deren Wirkung auf die Lebensdauer ist in der gewünschten Konzentration getestet werden. Wenn die Auflösung der Drogen in DMSO die Endkonzentrationen von DMSO sollte nicht mehr als 0,6%, wie DMSO-Konzentrationen höher als 0,6% zu verkürzen C.elegans Lebensdauer. Nach Zugabe des Medikaments, dichten die Platten mit Klebeband Versiegelung und schütteln Sie sie für 2-3 min auf einem Schüttler. Zurück Platten, die 20 ° C Inkubator </li><li> Hinzufügen der Medikamente können gelegentlich zu töten ein paar Tiere pro Platte, besonders wenn mit einem anderen Lösungsmittel als Wasser. Verwenden Sie eine inverse Mikroskop für lebende Tiere zu überprüfen. Generell sollte es weniger als 10 tote Tiere pro 96-Well-Platte sein. Zurück Platten, die 20 ° C Inkubator. </li></ol> Tag 4: Montag (Woche 3): Change Versiegelungen <ol start="18"><li> Um frischen Sauerstoff in die Kultur geben entfernen Sie die Versiegelung, warten Sie 1 Minute und verschließen die Platte. Schütteln Sie die Platte für 2-3 Minuten auf einem Schüttler. Wiederholen Sie jede Woche einmal. </li></ol> Tag 5: Dienstag (Woche 3): Add new OP50 zum Verhungern zu verhindern <ol start="19"><li> Add 5 ul der 100 mg / mL OP50-Lösung, die in Teil 1 zu jedem der 96 Löcher, um Hunger zu verhindern, wurde hergestellt. </li></ol> 3. Scoring der Lebensdauer. In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie das Überleben der synchronisierten Wurm Bevölkerung von Teil 2 überwacht wird, bis die Tiere starben. Zur Beobachtung der Tiere in den 96-Well-Platten, verwenden Sie einen inversen Mikroskop mit 2x oder 2.5x Ziel. Rekord Überlebensdaten dreimal in der Woche, Montag, Mittwoch und Freitag. Verwenden Bewegung, um festzustellen, ob die Tiere lebend oder tot sind. Starkes Licht, vor allem blaues Licht, induziert die Tiere sich zu bewegen. Entfernen Sie nicht tote Tiere aus dem Test. Gelegentlich kann Tiere, die nicht verschoben hat und tot waren in den vorhergehenden Zählung bestimmt später zu verschieben. <ol><li> Am Tag 0, am Anfang des Experiments zählen die Gesamtzahl der Würmer in jede Vertiefung. Censor Brunnen, die mehr als 18 Tiere aus der Analyse enthalten wie die Tiere in diesen Brunnen nicht mehr genügend OP50 und Effekte der diätetischen Restriktion zeigen. </li><li> Um die Chance, dass die Tiere schütteln den 96-Well-Platte auf einem Schüttler für 2 min bewegen zu erhöhen. vor dem Zählen. </li><li> In jedem Zählen Sitzung record date und Anzahl der Tiere, diebewegen, wie lebende Tiere. Bewegung in flüssiger ist viel einfacher als auf festen Medien und kann durch starkes Licht induziert werden. Die Verwendung einer höheren Vergrößerung kann helfen, sehr subtile Bewegungen wie die der Spitze des Pharynx vor Ort. Solche subtilen Bewegungen sind oft die einzige Bewegung in sehr alten Tieren beobachtet. </li><li> Zurück Platten, die 20 ° C Inkubator </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2-4 alle zwei vor drei Tagen bis alle Tiere tot sind. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse. Dieser Abschnitt zeigt ein Beispiel, wie man Aufzeichnungen über die Lebensdauer von Daten durch diese Tests und einige repräsentative Ergebnisse generiert halten. Abbildung 1A zeigt ein Beispiel, wie man Lebensdauer Daten während dieses Tests aufzuzeichnen. Eine Excel-Tabelle wird verwendet, um das Überleben der Populationen in jede Vertiefung zu halten. Für jeden gut ist es in der Platte zu koordinieren, Dehnung, Drogen, Konzentration des Medikaments und die Gesamtzahl der Tiere am Leben am Tag 0 (X0) wird am Anfang des Experiments aufgezeichnet. Stichtag sowie die Anzahl der lebenden und toten Tieren dreimal in der Woche, um das Überleben der verschiedenen Bevölkerungsgruppen in jede Vertiefung folgen. Um die Ergebnisse grafisch, berechnen den Anteil der Tiere am Leben für jeden Tag und Handlung als eine Funktion der Zeit in Tagen. P-Werte zu berechnen mit Hilfe statistischer Pakete wie STATA oder ähnliche Software. Das Medium Lebensdauer von C. elegans ist temperaturabhängig. Abbildung 1B zeigt, dass temperaturabhängige Veränderungen in Lebensspanne genau durch die Mikrotiterplatten basierten Lebensdauer Assay 22 wiedergegeben. Ebenso gibt die Mikrotiterplatte Assay Veränderungen in Lebensspanne von Mutanten berichtet, Lebensdauer, die von Wildtyp N2 Tiere 23-24 25 (Abb. 1C) unterscheiden können. Der Test kann auch verwendet werden, um mehr quantitative Aussagen zu machen. In Fig1D bedeuten Lebensdauer beträgt in Abhängigkeit von der Konzentration Mirtazepine 7 dargestellt. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert Lebensdauer von 7-12 Bevölkerung, jedes Lebewesen in ein anderes auch. Auch wenn die Anzahl der Tiere pro Well ist relativ gering (5-15 Tiere) der Well-to-Well-Variante ist relativ gering, wie aus der Fehlerbalken zu sehen ist. <img src="/files/ftp_upload/2496/2496fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Die Mikrotiterbasis Lebensdauer-Test reproduziert Veränderungen in Lebensdauer in der Literatur berichtet. (A) Sample-Daten in eine Excel-Tabelle gesammelt. Während jeder Sitzung Zählen Datum, der gut zu koordinieren und die Anzahl der lebenden und toten Tieren aufgenommen wurde. Zu Beginn des Experiments wurde die Gesamtzahl der Tiere in jeder Vertiefung bestimmt. (B) Survival-Kurve von Wildtyp-(N2) Tiere bei 20 ° C gezüchtet und 25 ° C. (C) Überlebenskurven von Stämmen, die Mutationen, die die Lebensdauer beeinflussen. Alle vier Stämme wurden in parallel bei 20 ° C getestet (D) Dosis-Wirkungs-Kurve von Mirtazepine behandelt N2 Tiere. Mittlere Lebensdauer ist als eine Funktion der Mirtazepine Konzentration aufgetragen. Fehlerbalken zeigen den SEM von 8 Wells pro Zustand. 5. Materials. M9-Puffer, 1000 ml <ul><li> 6 g Na 2 HPO 4 </li><li> 3 g KH 2 PO 4 </li><li> 5 g NaCl </li><li> 0,25 g MgSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> Add entionisiertem Wasser auf 1000 mL </li><li> Autoclave </li></ul> Potassiumphosphate pH 6,0, 1000 ml <ul><li> 136 g KH 2 PO 4 </li><li> Add entionisiertem Wasser auf 900 ml </li><li> Der pH-Wert auf 6,0 mit 5M KOH </li><li> Add entionisiertem Wasser auf 1000 mL </li><li> Autoclave </li></ul> Trace Metall-Lösung <ul><li> 1,86 g Na 2 EDTA </li><li> 0,69 g FeSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0,20 g MnCl 2 ∙ 4H 2 O </li><li> 0,29 g ZnSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0,016 g CuSO 4 </li><li> 1000 mL VE-Wasser </li><li> Autoklaven und dunkel lagern. </li></ul> S-Basalmedium, 1000 ml <ul><li> 5,9 g NaCl </li><li> 50 ml 1 M Kaliumphosphat, pH 6,0 </li><li> 1000 mL VE-Wasser </li><li> Autoclave </li><li> Lassen Sie die Lösung abkühlen lassen und dann 1 mL 5 mg / mL Cholesterin (gelöst in Et-OH). </li></ul> Kaliumcitrat 1M, 1000 ml <ul><li> 268,8 g Trikaliumcitrat </li><li> 26,3 Zitronensäuremonohydrat </li><li> Add 900 ml VE-Wasser </li><li> Der pH-Wert auf 6,0 mit 5M KOH </li><li> Add entionisiertem Wasser auf 1000 mL </li><li> Autoclave </li></ul> S-Vollmedium, 1000 ml <ul><li> 977 ml S-basalen </li><li> 10 mL 1M Kaliumcitrat pH 6 (steril) </li><li> 10 mL Spurenmetalle Lösung (steril) </li><li> 3 ml 1M CaCl 2 (steril) </li><li> 3 mL 1M MgSO 4 (steril) </li></ul> NGM-Agar <ul><li> 3.0g NaCl </li><li> 2,5 g Pepton(Aus Casein-, Bauchspeicheldrüsen-Digest) </li><li> 17g Agar </li><li> Add entionisiertem Wasser auf 975 ml und einen Rührstab </li><li> Autoclave </li><li> Nach dem Autoklavieren abkühlen auf 55 ° C und fügen Sie die folgenden Komponenten: <ul><li> 0,5 ml 1M CaCl 2 (steril) </li><li> 1 ml 5 mg / ml Cholesterin in Ethanol </li><li> 1 ml 1M MgSO 4 (steril) </li><li> 25 mL Potassiumphosphate Puffer, pH 6,0 (steril) </li></ul></li></ul> TB, 1000 ml <ul><li> 12g Bacto Trypton </li><li> 24 g Hefe-Extrakt </li><li> 4 mL Glycerol </li><li> Add 900 ml VE-Wasser </li><li> Autoclave </li><li> Nach dem Autoklavieren abkühlen auf 55 ° C und fügen Sie die folgenden Komponenten: <ul><li> 100 ml 0,17 M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 </li></ul></li></ul> 0,6 mM Fluordeoxyuridin (FUDR, sigma cat # F0503), 1000 ml <ul><li> 100 mg FUDR </li><li> Man löst in 670 ml sterile S-abgeschlossen ist, machen 10 mL oder 45 mL Aliquots. </li><li> Lagerung bei -20 ° C. </li></ul> 100 mg / mL Carbenicillin, 10 mL <ul><li> 1 g Carbenicillin </li><li> 10 mL sterilem, deionisiertem Wasser </li><li> Sterile Filtrat und aliquoten </li><li> Lagerung bei -20 ° C. </li><li> Verwenden Sie bei einer Endkonzentration von 50 ug / mL </li></ul> 250ug / mL Amphotericin B, 4 ml <ul><li> 1mg Amphotericin B </li><li> 4 mL Et-OH </li><li> Lagerung bei -20 ° C </li><li> Verwenden Sie bei einer Endkonzentration von 0,1 pg / mL </li></ul>

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A. 96, 7394-7397 (1999).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li><li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+life-span+in+Caenorhabditis+elegans+by+four+clock+genes.">Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes.</a> Science. 272, 1010-1013 (1996).</li></ol>

Das Protokoll vorgestellt ermöglicht die Messung von C.elegans Lebensdauer in 96-Well Mikrotiterplatten. Wie in den repräsentativen Ergebnissen gezeigt Abschnitt es zuverlässig repliziert bisherigen Erkenntnisse und liefert quantitative Informationen. Mit diesem Test haben wir erfolgreich mehr als 89.000 Molekülen auf ihre Wirkung auf C.elegans Lebensdauer untersucht. Für die Zwecke der Drogen-Screening, Mess-Lebensdauer in einer 96-well Mikrotiterplatten-Format hat mehrere Vorteile gegenüber den klassischen festen Medien-Assay. Es reduziert die Arbeitskosten für die mediale Aufbereitung, die Höhe der Inkubation Raum, und die Menge des Medikaments erforderlich erforderlich. Der 96-well-Format und die Mikroskopie Setup ermöglicht die Automatisierung des gesamten Tests für hohen Durchsatz-Screenings. Bei der Entwicklung des Assays mehrere Werte für jede Variable und deren Kombinationen wurden auf ihre Auswirkungen auf C.elegans Lebensdauer getestet. Diese Tests enthalten verschiedene OP50 Konzentration im Bereich von 3 bis 10 mg / mL (3, 4, 6, 8, 10 mg / mL), unterschiedliche Anzahl von Würmern pro Vertiefung reicht von 7 bis 45 (7, 10, 15, 22, 45 Würmer / well), andere Kultur Volumina von 40 bis 150 ul pro Well (40, 60, 80, 100, 120, 150 mL), und Änderungen in der Zusammensetzung des Puffers. Wenn gefüttert mit Carbenicillin-resistente OP50, angegeben weder Carbenicillin noch Amphotericin B in den Konzentrationen gefunden wurden, um C.elegans Lebensdauer beeinflussen. Kontinuierliche leichtem Schütteln der Platten, wie so oft in C. elegans Flüssigkultur empfohlen, wurde festgestellt, entbehrlich für die kleinen Volumina in diesem Test verwendet. Leichtem Schütteln ist jedoch erforderlich, wenn Mikrotiterplatten mit größeren Bohrungen verwendet werden sollen. Die angegebenen Werte in diesem Protokoll wurden sorgfältig auf der Grundlage statistischer Vergleich der verschiedenen Bedingungen getestet ausgewählt. Die größte Überraschung an diesem Test ist wohl die Tatsache, dass C.elegans in 96-Well-Platten, die mit Klebeband verschlossen werden kann gehalten werden. Side-by-Side-Vergleiche zeigten keine Unterschiede in Lebensspanne von Tieren in unverschlossenen Platten kultiviert, in Platten mit einer Kunststoff-Versiegelung versiegelt, oder in Platten mit Versiegelungen, die den Luftaustausch ermöglichen versiegelt. In allen drei Bedingungen, entwickelten die Tiere sehr homogen von L1 bis gravid Erwachsenen innerhalb von 65 Stunden und zeigte sehr vergleichbar Lebensdauer. Tiere parallel auf NGM gewachsen entwickelt etwas schneller, aber dieser Unterschied war unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von einer Versiegelung. Das vorgestellte Protokoll ist am lebenden Bakterien, sondern kann für tote Bakterien adaptiert werden. Allerdings in einer Flüssigkeit Assay einem einzigen überlebenden Bakterien schnell vermehren, und füllen Sie die Kultur. In unsere Hände ist die einzige zuverlässige Methode, um Bakterien in dem Maße, dass sie für flüssige Kultur verwendet werden kann töten bei längerer Behandlung der Bakterien mit Gamma-Bestrahlung. Ein wichtiger Punkt bei der Planung von einer Lebensdauer Experiment prüfen, ist die Macht der Nachweisgrenze. Abhängig von der Größe des Effekts, muss die Wirkung der Droge von Interesse in mehreren Bohrlöchern getestet werden. In einem typischen Assay 4 Arzneimittel-behandelten und 4 Kontroll-Wells, was in etwa auf 40-50 Tiere jeder sollte ausreichen, um eine 30% ige Erhöhung der Lebensdauer in mehr als 95% der Versuche zu erkennen. Erhöht um 14% sind nur in 60% der Fälle erkannt und daher mehr replizieren Brunnen. Der Reichtum der Lebensdauer von Daten mit diesem Test erzeugt wird, kann genutzt werden für Versuche zu entwickeln oder sich anstrengen, bestimmte parametrische Modelle Gompertz 1 sein. Diese Gompertz Modelle sind nützlich, um die Macht der Erkennung zu ermitteln und die Anzahl der False Positives und Negative für große Bildschirme zu schätzen. Wir überprüfen die Vorhersagen der Modelle in blinden Experimente und nutzte sie, um die Zahl der falsch-negativen in großen Bildschirmen (unveröffentlichte Ergebnisse) zu schätzen. Zusammenfassend erwarten wir, dass die vorgelegten Test wird von großem Nutzen, um kleine Moleküle, die Lebensdauer von C. elegans zu erweitern und die zugrunde liegenden Mechanismen zu studieren zu identifizieren.

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Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<table><tbody><tr><td>Amphotericin B</td><td>Calbiochem</td><td>cat# 171375</td><td>Also called Fungizone</td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat# F0503</td><td>FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water</td></tr><tr><td>Mianserin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2525-250MG</td><td>Use as positive control at 50&amp;#x03BC;M final concentration</td></tr><tr><td>Cyproheptadine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat#C6022-MG</td><td>Alternative positive control at 10 &amp;#x03BC;M final concentration</td></tr><tr><td>Sealing Tape</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 236370</td><td>Polyester, non-sterile</td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Falcon BD</td><td>cat# 351172</td><td>Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene</td></tr><tr><td>Nunclon flask</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 178883</td><td>used for large volumes</td></tr></tbody></table>

measuring caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates

Lebensdauer ist ein biologischer Prozess, durch mehrere genetische Signalwege reguliert. Eine Strategie, um die Biologie des Alterns befassen, ist es, Tiere zu erforschen, die Hafen-Mutationen in Komponenten des Alters-Regulationswege. Wenn diese Mutationen stören die Funktion des Alters-Regulationsweg und somit verändern die Lebensdauer des gesamten Organismus, liefern sie wichtige mechanistische Einblicke 1-3. Eine andere Strategie, um die Regulierung der Lebensdauer zu untersuchen ist, um kleine Moleküle zu stören Alter Regulationswege verwenden. Bis heute sind eine Reihe von Molekülen bekannt Lebensdauer in verschiedenen Modell-Organismen zu erweitern und werden als Instrumente verwendet werden, um die Biologie des Alterns 4-16 zu studieren. Die Zahl der identifizierten Moleküle so weit ist klein im Vergleich zu den genetischen &quot;Toolset&quot; findest, die Biologie des Alterns zu studieren. Caenorhabditis elegans ist einer der bedeutendsten Modelle zur Untersuchung Alterung wegen seiner ausgezeichneten Genetik und kurze Lebensdauer von drei Wochen. In jüngerer Zeit hat C.elegans als Modellorganismus für Phänotyp basierte Drogen-Bildschirme 5,7,16-20 wegen seiner geringen Größe und seiner Fähigkeit, in Mikrotiterplatten wachsen entstanden. Hier präsentieren wir einen Test, um C.elegans Lebensdauer in 96 well Mikrotiterplatten zu messen. Der Assay wurde entwickelt und erfolgreich eingesetzt, um große Bibliotheken für Moleküle, die C.elegans Lebensdauer 7 erstrecken Bildschirm. Die Zuverlässigkeit des Tests wurde in mehreren Tests untersucht: erstens durch die Messung der Lebensdauer von Wildtyp-Tieren bei unterschiedlichen Temperaturen angebaut, zweitens durch die Messung der Lebensdauer von Mutanten mit veränderten Lebenserwartung, drittens durch die Messung von Veränderungen der Lebenserwartung in Reaktion auf unterschiedliche Konzentrationen des Antidepressivums Mirtazepine. Mirtazepine wurde zuvor gezeigt, auf Lebenszeit in C.elegans 7 erstrecken. Die Ergebnisse dieser Tests zeigen, dass der Test in der Lage, frühere Ergebnisse aus anderen Untersuchungen repliziert wird und quantitativ. Die Mikrotiter-Format macht es auch Lebensdauer-Test mit automatisierten Liquid-Handling-Systeme und ermöglicht die Integration in automatisierte Plattformen.

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Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In diesem Protokoll wird eine Methode zur Messung<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Lebensdauer in 96-Well Mikrotiterplatten.

Messung Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Mikrotiterplatten

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

36.4K Aufrufe.  The Scripps Research Institute. In diesem Protokoll wird eine Methode zur Messung Caenorhabditis elegans Lebensdauer in 96-Well Mikrotiterplatten.

Serie: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on animal physiology and behavior. Recently, we showed that modulation of longevity in the nematode Caenorhabditis elegans by food abundance is more complex than previously recognized. The responsiveness of the lifespan to changes in food level is determined by specific genes that act by controlling information processing within a neural circuit. Our framework combines genetic analysis, high-throughput quantitative imaging and information theory. Here, we describe how these techniques can be used to characterize any gene that has a physiological relevance to broad-range dietary restriction. Specifically, this workflow is designed to reveal how a gene of interest regulates lifespan under broad-range dietary restriction; then to establish how the expression of the gene varies with food level; and finally, to provide an unbiased quantification of the amount of information conveyed by gene expression about food abundance in the environment. When several genes are examined simultaneously under the context of a neural circuit, this workflow can uncover the coding strategy employed by the circuit.

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Here, we present a framework to relate broad-range dietary restriction to gene expression and lifespan. We describe protocols for broad-range dietary restriction and for quantitative imaging of gene expression under this paradigm. We further outline computational analyses to reveal underlying information processing features of the genetic circuits involved in food-sensing.

Quantifizierung der Information kodiert durch Gene Expression Ebenen während der Lebensdauer Modulation unter breiter Palette diätetische Einschränkung in C. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Forschung

Genetik

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Biochemie

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus allowing a single investigator to screen more treatments or conditions over the same amount of time without loss of data quality. The method requires common equipment found in most laboratories working with C. elegans and is thus simple to adopt. The approach centers on assaying independent samples of a population at each observation point, rather than a single sample over time as with traditional longitudinal methods. Scoring entails adding liquid to the wells of a multi-well plate, which stimulates C. elegans to move and facilitates quantifying changes in healthspan. Other major benefits of the Replica Set method include reduced exposure of agar surfaces to airborne contaminants (e.g. mold or fungus), minimal handling of animals, and robustness to sporadic mis-scoring (such as calling an animal as dead when it is still alive). To appropriately analyze and visualize the data from a Replica Set style experiment, a custom software tool was also developed. Current capabilities of the software include plotting of survival curves for both Replica Set and traditional (Kaplan-Meier) experiments, as well as statistical analysis for Replica Set. The protocols provided here describe the traditional experimental approach and the Replica Set method, as well as an overview of the corresponding data analysis.

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Here we describe the Replica Set method, an approach to quantitatively measure C. elegans lifespan/survival and healthspan in a high-throughput and robust manner, thus allowing screening of many conditions without sacrificing data quality. This protocol details the strategy and provides a software tool for analysis of Replica Set data.

Die Replica-Set-Methode: Eine Hochdurchsatz-Ansatz zu quantitativ Messen Caenorhabditis Elegans Lebensdauer

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Messung Caenorhabditis elegans Life Span auf festen Medien

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Biologie

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many historical and contemporary studies have identified thousands of lifespan-altering paradigms, including genetic mutations, transgenic gene expression, and hormesis, a beneficial, low-grade exposure to stress. With its many advantages, including a short lifespan, easy and low-cost maintenance, and fully sequenced genome with homology to almost two-thirds of all human genes, C. elegans has quickly been adopted as an outstanding model for stress and aging biology. Here, several standardized methods are surveyed for measuring lifespan and healthspan that can be easily adapted into almost any research environment, especially those with limited equipment and funds. The incredible utility of C. elegans is featured, highlighting the capacity to perform powerful genetic analyses in aging biology without the necessity of extensive infrastructure. Finally, the limitations of each analysis and alternative approaches are discussed for consideration.

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans serve as an excellent model system with robust and low-cost methods for surveying healthspan, lifespan, and resilience to stress.

Erhebung kostengünstiger Methoden zur Messung von Lebensdauer und Gesundheitserwartung bei Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Hochdurchsatz-Assay zur Messung der Nahrungsaufnahme und Lebensdauer von Caenorhabditis elegans

Quantifying Food Intake in Caenorhabditis elegans by Measuring Bacterial Clearance

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of Caenorhabditis elegans&#160;(C. elegans), an important parameter when studying the genetics of aging or metabolism. In most species, feeding is determined by measuring the difference between the amount of food provided and the amount left after a given time interval. The method presented here uses the same strategy to determine the feeding of C. elegans. It measures the amount of bacteria, the food source of C. elegans, cleared within 72 h. This method uses 96-well microtiter plates and has allowed the screening of hundreds of drugs for their ability to modulate food intake at a speed and depth not possible in other animal models. The strength of this assay is that it allows to measure feeding and lifespan simultaneously and directly measures the disappearance of food and, thus, is based on the same principles used for other organisms, facilitating species-to-species comparison.

Autor im Rampenlicht: Erforschung des Zusammenhangs zwischen Lipotoxizität und HFpEF 

This protocol describes an assay to quantify Caenorhabditis elegans feeding rate based on measuring the clearance of bacteria in liquid culture.

Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of ...

Verhalten

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A non-mammalian soil round worm, Caenorhabditis elegans, is a valuable model organism for toxicology studies due to its convenience and lack of animal ethics issues compared with mammalian animal systems. In this protocol, a detailed procedure of toxicological evaluation of chemicals in C. elegans is described. A clinical anticancer drug, etoposide, which targets human topoisomerase II and inhibits DNA replication of human cancer cells, was selected as a model testing chemical. Age-synchronized C. elegans eggs were exposed to either dimethyl sulfoxide (DMSO) or etoposide, and then the growth of C. elegans was monitored every day for 4 days by the stereo microscope observation. The total number of eggs laid from C. elegans treated with DMSO or etoposide was also counted by using the stereo microscope. Etoposide treatment significantly affected the growth and reproduction of C. elegans. By comparison of the total number of eggs laid from worms with different treatment periods of chemicals, it can be decided that the reproductive toxicity of chemicals on C. elegans reproduction is reversible or irreversible. These protocols may be helpful for both the development of various drugs and risk assessment of environmental toxicants.

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

A basic protocol to evaluate the toxicity of chemicals in a model animal, Caenorhabditis elegans, is described. The method is convenient and useful for the development of pharmaceuticals as well as for the risk assessment of various environmental pollutants.

Messung der Wirkung von Chemikalien auf das Wachstum und die Vermehrung von Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

Medizin

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Mess Oxidativer Stress Widerstandsrat<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In 96-Well-Mikrotiterplatten

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Messung Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Mikrotiterplatten

Zusammenfassung

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Quantifizierung der Information kodiert durch Gene Expression Ebenen während der Lebensdauer Modulation unter breiter Palette diätetische Einschränkung in C. elegans

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Die Replica-Set-Methode: Eine Hochdurchsatz-Ansatz zu quantitativ Messen Caenorhabditis Elegans Lebensdauer

Messung Caenorhabditis elegans Life Span auf festen Medien

Erhebung kostengünstiger Methoden zur Messung von Lebensdauer und Gesundheitserwartung bei Caenorhabditis elegans

Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Messung der Wirkung von Chemikalien auf das Wachstum und die Vermehrung von Caenorhabditis elegans

Mess Oxidativer Stress Widerstandsrat