このプロトコルは、海のエレガンスの老化を提供するための最も低いコストと最も低い技術方法を提示します。老化生物学において影響力のあるモデル生物。これらの方法の最大の利点は、低コストの機器と材料を使用した実装の容易さです。
経験や利用可能な資金に関係なく、どの研究者にも従順になるようにします。古い老化研究として、集団内の健康には自然なばらつきがあります。したがって、実験は健康で、十分に給餌され、緊密に同期された動物で行われることが不可欠です。
リップ障害を確実にするために 1リットルの線虫増殖培地またはNGMオーガープレートの調製を開始します。2.5グラムのペップトーン、3.0グラムの塩化ナトリウム、20グラムのオーガーを攪拌子付きの1リットルのフラスコに加え、蒸留水を最終容量970ミリリットルまで加えます。NGMオーガー溶液を1リットルフラスコで、標準的なオートクレーブまたは培地滅菌器を使用して滅菌します。
そして、それが摂氏60〜75度に冷えるまで溶液を攪拌します。溶液が冷えている間に、ビーズバスを摂氏65〜70度に加熱します。NGMオーガー溶液が摂氏60〜75度に冷却されると。
液体添加剤を加え、溶液を5分間完全に混合させます。次に、フラスコを摂氏65〜70度のビーズバスに浸して、プレートに注ぐときにメディアが固化するのを防ぎます。各60ミリリットルプレートに9〜11ミリリットルの溶液をピペットで入れます。
完了したら、ピペットを加熱溶液に戻し、温度を維持し、媒体がピペット内で固まるのを防ぎます。すべてのプレートに対してこの手順を繰り返し、NGM aプレートを一晩固化させます。固まったら、プレートにバクテリアを播種するか、プレートを密閉容器に摂氏4度で最大3か月間保管して、漂白を介してワームを同期させます。
ペトリ皿をいっぱいにすることなく、ワームを含むプレートに少量のM9溶液を注ぐことにより、線虫を収集します。次に、M nine溶液を穏やかに回転させて、細菌の芝生からワームを緩めます。次に、成虫の妊娠虫を血清学的ピペットで15ミリリットルのチューブに集めます。
ピペットチップでオーガーを突き刺さないでください。1100倍Gで30秒間セントrにより動物をペレット化し、上清を吸引した。5ミリリットルの新しく調製した漂白溶液をワームペレットに加え、すべての成虫の体が溶解し、卵だけが混合物に残るまで、断続的に激しく振とうしながら、数分ごとに解剖顕微鏡でワームをチェックします。
次に、卵漂白ミックスを1100倍Gで30秒間スピンダウンして卵をペレット化し、漂白液を吸引します。次に、最大15ミリリットルのM9溶液を加え、チューブを4〜5回反転させて卵と溶液を分散させることにより、ペレット化された卵を洗浄します。再度、チューブを1100倍Gで30秒間遠心分離して卵をペレット化し、M9溶液を吸引します。
卵ミックスから漂白剤を除去するために4回洗浄を実行します。4回目の洗浄遠心分離後、漂白されたワームの総数に応じてM9溶液を100マイクロリットルから2ミリリットルに吸引する。卵をよく振って塊を砕き、卵がM9溶液に完全に再懸濁されていることを確認します。
あるいは、動物は、15ミリリットルのクロニクルチューブ内の卵ペレットに10〜12ミリリットルのM9溶液を加えることによって、より緊密な時間的同期のためにL1を逮捕することができる。ワームをローテーター内で摂氏20度で最大24時間回転させます。卵またはL1濃度ピペット4マイクロリットルの卵混合物を細菌を装着したNGMプレート上に近似する。
次に、培地のマイクロリットルあたりに存在する卵を数えて計算します。近似を改善するためにカウントを3〜4回繰り返し、近似プレートに基づいて、適切な数の卵またはL1匹を、選択した細菌を播種したNGMオーガープレート上に1匹の動物を逮捕する。スラッシングを介してワームの機関車の行動を測定するため。
少数の初日成虫をNGMオーガープレートから解剖スコープ下で10〜20マイクロリットルのM9溶液に移します。次に、一度に1つのワームに焦点を合わせ、標本が15秒で凹状から凸状に切り替わる回数を数えます。ハンドカウンターとタイマーを使用して、10〜15個のワームに対して手順を繰り返します。
ワームを希望の年齢にエイジアウトし、すべての希望の年齢でスラッシング測定を繰り返します。視覚化されているように、古いワームはかなり遅い速度で叩きます。量と出生力の測定用。
10〜15匹のカエノラブディティスエレガンスワームでは、L4匹のワームを選び出し、選択した細菌を播種した別のNGMオーガープレートに入れます。動物を摂氏20度で一晩成長させ、新しく播種したプレートのバッチが翌日の準備ができていることを確認します。Caenorhabditis elegansによって産まれた卵の量を測定するために、成虫をその略奪されたバクテリアを播種した新鮮なNGMオーガーブレードに7〜8日間、または卵が見えなくなるまで移し、プレートに置かれた卵の数を数えます。
Caenorhabditis elegansのひなサイズを測定するには、成虫を12〜24時間ごと、または7〜8日ごと、または子孫が見えなくなるまで細菌を播種した新鮮なNGMオーガープレートに移します。卵を含むすべてのプレートを摂氏20度に保ちます。ワームを転送してから2日後。
プレート上で発達した子孫を数えます。L 4段階以前のすべての生きているワームと発達中のワームを数えて、F 2世代が結果を混乱させないようにします。カウントされたら、プレートからすべてのワームを削除します。
プレートをさらに1〜2日間維持してから再度採点し、孵化や発育が遅れた動物を見逃さないようにします。野生型N2線虫の寿命に及ぼす殺菌法の影響は、NGMオーガープレートで増殖した線虫の寿命の変化またはNGMオーガープレートで増殖したglp 4つのBN2変異動物の寿命の変化と類似していることを示した。短命のHSF1ノックダウン動物は、すべての条件で寿命の有意な低下を示しました。
産卵数とひなのサイズの大幅な減少は、野生型対照と比較して、発現動物よりもHSFで見られました。一部のHSF一過剰発現動物は完全な不妊を示し、リプロダクティブヘルスが寿命と逆相関し得ることを示している。スラッシング率は、若い動物と比較して老いた動物のスラッシングの有意な減少によって測定されるように、老化中の健康を測定するための信頼できる方法を提供しました。
ストレスに対する生存は、生物の健康状態を測定するための信頼できるアッセイであり、細網ストレスを引き起こすツニカマイシンは、DMSO対照と比較して濃度に関係なく寿命の低下をもたらした。高レベルのパラコートは寿命を著しく短くし、低濃度のパラコートはホルミティック効果のために寿命を延ばしました。耐熱性アッセイでは、HSF 1の過剰発現により、すべての寿命および老化実験で摂氏37度での耐熱性が増加しました。
滅菌技術は生物の健康に多面的な影響を及ぼし、結果に影響を与える可能性があることを覚えておくことが重要です。転写、翻訳タンパク質凝集、オルガネラ、形態、代謝機能の測定など、機器やインフラストラクチャが利用可能であれば、健康寿命を測定するための多くの追加的かつ補完的なアプローチが存在します。
