著者は、比較脊椎動物の生物学コースの管理における役割についてはシラキュース大学と博士マリリンカーで生物学科に感謝したい。アルバートソンの研究室は、歯科および顎顔面研究所の健康/国立研究所の国立研究所からの助成金R21DE019223だけでなく、老化健康/国立研究所の国立研究所からの助成金R01AG031922によってサポートされています。

1。ターゲットcDNAのプラスミド形質転換パートI：プラスミドの形質転換 （所要時間：3時間プラス一晩インキュベーション） <ol><li> 42℃の水浴中で暖かいSOC栄養ブロス（反応あたり500μL） </li><li>氷上でコンピテントセルを融解</li><li> 25μLのコンピテントセルにプラスミド1μLを追加</li><li> 20分間氷上に置き、 </li><li> 45秒間42℃の水浴中で熱ショック細胞</li><li>すぐに2分間氷上で細胞を配置</li><li>細胞の各バイアルに42℃の栄養ブロスの500μLを追加</li><li> ° C毎分255回転で2時間（回転数）で37振る</li><li>ルリアベルターニ（LB）寒天プレート上にプレートを75μL変換ミックス</li><li> 37℃で一晩反転プレートをインキュベートする</li></ol>パートII：E.大腸菌の培養 （所要時間：15分プラス一晩インキュベーション） <ol><li>それぞれの反応、アリコート3 mlのLB培養液および培養チューブに50 mg / mLのアンピシリンの3μLのための</li><li>寒天プレートから1細菌のコロニーをかき取り、それぞれの培養チューブに加える</li><li> 37℃で培養試験管を振る° Cを255 rpmで一晩</li></ol>パートIII：プラスミドプレップ （所要時間：1.5時間） <ol><li> 5内閣総理FastPlasmidミニキット（カタログ＃230万）を使用して一晩培養液からプラスミド分離する</li><li>調製したプラスミドの存在を確認するには、エチジウムブロマイドで染色1パーセントトリス - 酢酸- EDTA（TAE）ゲルでキットから溶出したDNAを実行する</li></ol> （2） その場 DIG標識RNAプローブの合成で パートI：プラスミドの直線化 （所要時間：2.5時間） <ol><li> 1.5mlマイクロチューブに、組み合わせる。 <table border="1"><tbody><tr><td>プラスミド準備</td><td> 20 mLの</td></tr><tr><td>制限酵素* </td><td> 2 mLの</td></tr><tr><td>バッファー** </td><td> 10mLの</td></tr><tr><td> 10Xウシ血清アルブミン（BSA） </td><td> 10mLの</td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート（DEPC）水</td><td> 58 mLの</td></tr><tr><td></td><td> 100mLの</td></tr></tbody></table></li><li> 37℃で2時間インキュベート *プラスミドにより異なる **制限酵素により異なる</li></ol>パートII：トランスクリプション （所要時間：3時間） <ol><li> 1.5mlマイクロチューブに、組み合わせる。 <table border="1"><tbody><tr><td>線状プラスミド</td><td> 4 mLの</td></tr><tr><td> 10X転写バッファー** </td><td> 4 mLの</td></tr><tr><td>ジゴキシゲニンでラベルのミックス</td><td> 4 mLの</td></tr><tr><td>ポリメラーゼ* </td><td> 2 mLの</td></tr><tr><td> RNase阻害剤</td><td> 2 mLの</td></tr><tr><td> DEPC水</td><td> 24 mlの</td></tr><tr><td></td><td> 40mLの</td></tr></tbody></table></li><li> 1時間、37℃でインキュベートする</li><li>ポリメラーゼ* 2μLを追加</li><li> 1時間、37℃でインキュベートする</li><li> DNaseの2μLを追加</li><li> 37℃を20分間 *プラスミドにより異なる **ポリメラーゼにより異なる</li></ol>パートIII：降水量 （所要時間：一晩のインキュベーション、1時間に5分プラス2時間は、遠心分離と再サスペンドする） <ol><li> 0.2M EDTAの4μLを追加</li><li> 4M塩化リチウムの5μLを追加</li><li>氷冷100％エタノールを150μLを追加</li><li>一晩は-80℃で2時間インキュベート</li><li> 4℃、デカント離れて上清を、30分間、14,000 rpmで遠心</li><li> 7分のドライペレット</li><li> 20μLのDEPC水に再懸</li><li> 37℃を5分間</li></ol>パートIV：分画 - プローブのサイズが0.6 KBより大きい場合にのみ実行 （所要時間：通常は、プローブのサイズに基づいて20分以上を可変しない） <ol><li> 1.5mlマイクロチューブに、組み合わせる。 <table border="1"><tbody><tr><td> RNAプローブ</td><td> 20 mLの</td></tr><tr><td> DEPC水</td><td> 12mlの</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td> 4 mLの</td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム</td><td> 4 mLの</td></tr><tr><td></td><td> 40mLの</td></tr></tbody></table></li><li> 60℃の水浴でインキュベートする。方程式でのインキュベーション時間をベース： 時間（分）=（開始KB - キロバイトを希望する）/（KB X希望のKBを開始0.11 X） 平均的な希望のサイズ= 0.6キロバイト</li></ol>パートV：決勝降水量 （所要時間：5分一晩のインキュベーションにユートプラス2時間、遠心分離し、再一時停止する1時間、ゲル電気泳動のための1時間） <ol><li> 40μLDEPC水を加える</li><li> 8μL酢酸ナトリウムを追加</li><li> 1.04μL氷酢酸を追加</li><li> 240μLの氷冷した100％エタノールを加えます</li><li>一晩は-80℃で2時間インキュベート</li><li> 4℃、デカント離れて上清を、30分間、14,000 rpmで遠心</li><li> 7分のドライペレット</li><li> 20μLのDEPC水に再懸</li><li>ミックスする渦</li><li>リボプローブの存在を確認するには、エチジウムブロマイドで1％TAEゲル染色した上、再懸濁液を実行する</li></ol> 3。 in situハイブリダイゼーション全山パートI：胚の固定およびプロテイナーゼK消化 （所要時間：修正晩プラス4時間のストレージのための次の日、2.5時間記憶からパートIIまで） <ol><li>ゼブラフィッシュ胚の段階収集し、4℃で一晩4％パラホルムアルデヒド（PFA）で修正° C </li><li>リン酸固定胚を洗うことは10分ごとのTween - 20（PBST）で3回0.1％を含む緩衝生理食塩水</li><li>先の細いピンセットを用いて実験的な試薬は、手動でdechorionate胚（必要に応じて）への胚の曝露を確保するため</li><li>一時間ごとに洗浄を25％の段階的な一連の洗浄及びPBSTで50％メタノールで胚を脱水し、-20℃で100％メタノールに保存する</li><li>するときに使用する準備ができて、10分ごとに、PBSTで50％（2回）および25％（1時間）、メタノールで洗浄してPBSTで胚を再水和する。最終的に100％PBSTで10分間ずつ2回洗浄する。正確なタイミングは、PBST /メタノール洗浄のために重要ではありません。 </li><li> PBSTで10％の過酸化水素溶液中での漂白剤の胚は、必要に応じて、暗い色素を除去する。胚は、胚の年齢に応じて、10〜20分間過酸化水素溶液でインキュベートする必要があり、マイクロチューブのキャップは、空気の圧力の蓄積を防止するために開いたままにしてください</li><li> 50 mg / mLのプロテイナーゼKでダイジェストの胚は、胚の年齢に応じて、3-15分間PBSTで1:5000に希釈</li><li>その後、再修正の30分間、4％PFAで胚、および5分間ずつPBSTで3回洗浄</li></ol>パートII：リボプローブのハイブリダイゼーション （所要時間：3時間プラスハイブリダイゼーションのために一晩、1.5時間のパートIIIの翌日） <ol start="9"><li> 2〜3時間予熱した70℃の水浴中でプレハイブリダイゼーション溶液（PHS）で胚をプレハイブリダイゼーション</li><li> 、PHSを取り除く70℃で一晩インキュベート0.5mLのハイブリダイゼーション溶液および1.5μL先に合成したジゴキシゲニン標識したリボプローブを、追加してください。温度は、リボプローブのターゲットに応じて数度以内に変動することができます</li><li>翌日、70で胚を洗浄℃で10分間ごとに、2X生理食塩水、クエン酸ナトリウム（SSC）におけるPHS 75％、50％、25％の段階的なソリューションで、その後68℃30分間0.2 × SSCで洗浄° C </li><li>室温で10分間ずつのマレイン酸バッファー（MAB）2回で洗浄する</li></ol>パートIII：抗ジゴキシゲニン（α- DIG）抗体のインキュベーション （所要時間：3時間プラス第IV部に次の日、2.5時間をブロックするために一晩） <ol start="13"><li> 12ウェルプレートに胚を移す</li><li>室温で少なくとも3時間は1-2 mlのブロッキング溶液中でプレブロックの胚</li><li>同時に、このソリューションでブロッキング溶液の2番目のボリュームを準備し、抗ジゴキシゲニン抗体1:2000希釈して抗体を事前に遮断する</li><li>事前にブロックを取り外し、事前にブロックされたα- DIGソリューション1〜2 mLを加え、4℃で一晩インキュベート</li><li>翌日、MABで胚を洗浄する。胚は最初の5分間MABでインキュベートすることを許可し、バッファの変更を行うと、2つの10分、1 30分一​​60分間隔でインキュベートする。正確なタイミングは必要ありません</li><li>アルカリホスファターゼ（AP）バッファ内の胚の各5分間3回洗浄</li></ol>パートIV：染色と最終処理 （所要時間：1時間染色のための晩​​には、使用するリボプローブに応じて、グリセリンソープ、グリセリン洗浄あたり6〜10時間、の先頭に4時間はグリセロールに保存されていることがあります） <ol start="19"><li>染色が十分になるまで、胚に1 - 2mLの染色液を追加箔でプレートをラップし、定期的な間隔（20分毎程度）で染色をチェック</li><li>染色反応を停止するために各5分間PBSTで2回胚を洗う</li><li>バックグラウンド染色を削除するには、その後100％メタノールで、PBSTで25％（1時間）と50％（2回）メタノールで10分間洗浄を使用して、胚を脱水する</li><li>胚は、室温で少なくとも2時間、100％メタノールでインキュベートすることができます</li><li> 50％で10分間洗浄（2回）および25％（1時間）PBSTでメタノールを使用して、PBSTで再水和する、その後100％PBST 2回洗浄</li><li>ステンドメールを転送する4で段階的な一連の洗浄、およびストアを使用してPBSTで80％グリセロール溶液にmbryos、℃の</li></ol>レシピ： <ul><li> LB寒天プレート - 10 gのLB寒天+ 250mLの蒸留水、オートクレーブは、ときにタッチにクール各シャーレに15-20 mLの温溶液を注ぎ、250μLアンピシリンを追加、寒天が固化することができます</li><li> LBブロス- 12.5 gのLB培地+ 200mLの蒸留水、オートクレーブは、使用前に冷却することができます</li><li> 1％TAEゲル- 0.4 Gアガロース、40 mLの1X TAE、2μLのエチジウムブロマイド、負荷7μLプラスミドを（プラスミドcDNAターゲットの変換）または3μLリボプローブと4μLDEPC水（ その場 DIG標識RNAプローブの合成語 ）+ 1μLローディング色素、5μLのDNAラダー</li><li>プレハイブリダイゼーション溶液、50％ホルムアミド、5X SSC、9.2mMクエン酸、1％のTween - 20 </li><li>ハイブリダイゼーション溶液プレハイブリダイゼーション溶液に加えて500μg/ mlとtRNAと50μg/ mlのヘパリン</li><li> MAB - 100mMのマレイン酸、150mmの塩化ナトリウム、7.5〜0.2MのNaOH、0.1％のTween - 20、pHは</li><li> MABでのブロッキング溶液、3部MAB、1部10パーセントベーリンガーブロッキング試薬、1部の熱は、子羊血清を非アクティブに</li><li> 9.5〜APバッファ- 60mmのトリス- HCl pHは、60mmの塩化ナトリウム、30mMのMgCl 2を 、0.1％のTween - 20 </li><li>染色液- 5 - ブロモ-4 - クロロ-3 - インドリルリン酸（BCIP）とのニトロブルーテトラゾリウム（NBT）APのバッファ</li></ul> 4。駐在結果正しく実行する場合は、NBT、BCIP、およびアルカリホスファターゼとの反応では、紫色の染色としてゼブラフィッシュ胚に表示される紫色の沈殿物を形成します。リボプローブは、以前は次の目的の遺伝子に対応するcDNAから合成する必要があります。したがって、それはあらゆる汚れを可視化が目的の遺伝子がその特定の発生段階で転写されているゼブラフィッシュの領域を表すと結論することができます。 fgf8a（Reifersら 、1998; 図2）。deltaC（オーツら、2005。）当コースの目的のために、リボプローブはaldh1a2（; Begemann ら、2001;図1以前raldh2）から合成された。 myod1（ワインバーグら、1996）; shha（。クラウスら、1993）、pax2a（ブランドら 、1996; 図 3）とmyl7（以前cmlc2;。Yelonら 、1999）cDNAを。染色は、正中線にし、体節、tailbud、筋節、脳、および心臓を含む解剖学的構造に期待されていた。Ace/fgf8a変異体は、これらの構造の多くの欠陥を持っていると予想された。染色が容易に標準的な解剖顕微鏡を用いて可視化した。 （Schoenwolf、2009。D&#39;コスタリカら 、2009; Schmoldt ら 、2009年。クラーク、2003）その他の情報源はここに記載されたものと同様の手法をウィッシュについての詳細およびトラブルシューティングが含まれています。 <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig1.jpg" alt="図1" /> aldh1a2のための特定のリボプローブとハイブリダイズされている図1。ゼブラフィッシュ胚24時間後に受精、。特定の染色は、目、後脳、胸びれ芽原基、および体節で見ることができます。前方の上部にある、後は一番下にあります。 <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。fgf8a用プローブの特異的にハイブリダイズされた開発の13体節期ではゼブラフィッシュ胚。特定の染色は、終脳、間脳背側、中脳後脳境界、体節、およびtailbudで見られます。腹側が左側に、背側は右側にあります。 <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。pax2a、神経系を可視化するための有用な堅牢なマーカーのためのリボプローブの特異的にハイブリダイズされた22時間後に受精のゼブラフィッシュ胚。特定の染色は、脈絡膜裂、中脳後脳境界、耳胞、および脊髄の神経細胞で見ることができます。左前方と背側ビュー。

<ol>
	<li>Albertson, R. C., Yelick, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+fgf8+signaling+in+left-right+patterning+of+the+visceral+organs+and+craniofacial+skeleton.">Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton.</a> Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).</li><li>Aramaki, M., Kimura, T., Udaka, T., Kosaki, R., Mitsuhashi, T., Okada, Y., Takahashi, T., Kosaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+expression+profile+of+chicken+CHD7,+the+ortholog+of+the+causative+gene+for+CHARGE+syndrome.">Embryonic expression profile of chicken CHD7, the ortholog of the causative gene for CHARGE syndrome.</a> Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 79, 50-57 (2007).</li><li>Begemann, G., Schilling, T. F., Rauch, G. J., Geisler, R., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+neckless+mutation+reveals+a+requirement+for+raldh2+in+mesodermal+signals+that+pattern+the+hindbrain.">The zebrafish neckless mutation reveals a requirement for raldh2 in mesodermal signals that pattern the hindbrain.</a> Development. 128, 3081-3094 (2001).</li><li>Brand, M., Heisenberg, C. P., Jiang, Y. J., Beuchle, D., Lun, K., Furutani-Seiki, M., Granato, M., Haffter, P., Hammerschmidt, M., Kane, D. A., Kelsh, R. N., Mullins, M. C., Odenthal, J., van Eeden, F. J., Kane, D. A., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+zebrafish+genes+affecting+the+formation+of+the+boundary+between+midbrain+and+hindbrain.">Mutations in zebrafish genes affecting the formation of the boundary between midbrain and hindbrain.</a> Development. 123, 179-190 (1996).</li><li>Clark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ Hybridization: Laboratory Companion. , (2003).</li><li>D'Costa, A., Shepherd, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+development+and+genetics:+Introducing+undergraduates+to+developmental+biology+and+genetics+in+a+large+introductory+laboratory+class.">Zebrafish development and genetics: Introducing undergraduates to developmental biology and genetics in a large introductory laboratory class.</a> Zebrafish. 6, 169-177 (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 1. , (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , (2010).</li><li>Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+in+limb+organogenesis.">Wnt signaling in limb organogenesis.</a> Organogenesis. 4, 109-115 .</li><li>Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M., Huang, R., Christ, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+in+somite+development.">Wnt signaling in somite development.</a> Ann Anat. 190, 208-222 .</li><li>Huelsken, J., Behrens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+signaling+pathway.">The Wnt signaling pathway.</a> J Cell Sci. 15, 3977-3978 (2002).</li><li>Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functionally+conserved+homolog+of+the+Drosophila+segment+polarity+gene+hh+is+expressed+in+tissues+with+polarizing+activity+in+zebrafish+embryos.">A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos.</a> Cell. 75, 1431-1444 (1993).</li><li>Oates, A. C., Mueller, C., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+function+of+deltaC+and+her7+in+anterior+segment+formation.">Cooperative function of deltaC and her7 in anterior segment formation.</a> Dev. Biol. 280, 133-149 (2005).</li><li>Pizard, A., Haramis, A., Carrasco, A. E., Franco, P., L&#243;pez, S., Paganelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridization+and+detection+of+RNAs+in+vertebrate+embryos+and+isolated+organs.">Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2004).</li><li>Reifers, F., Bohli, H., Walsh, E. C., Crossley, P. H., Stainier, D. Y., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+is+mutated+in+zebrafish+acerebellar+(ace)+mutants+and+is+required+for+maintenance+of+midbrain-hindbrain+boundary+development+and+somitogenesis.">Fgf8 is mutated in zebrafish acerebellar (ace) mutants and is required for maintenance of midbrain-hindbrain boundary development and somitogenesis.</a> Development. 125, 2381-2395 (1998).</li><li>Schmoldt, A., Forecki, J., Hammond, D. R., Udvadia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+differential+gene+expression+in+zebrafish+to+teach+basic+molecular+biology+skills.">Exploring differential gene expression in zebrafish to teach basic molecular biology skills.</a> Zebrafish. 6, 187-199 (2009).</li><li>Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Studies of Vertebrate and Invertebrate Embryos: Guide and Atlas of Descriptive and Experimental Development. , (2008).</li><li>Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somite+development+in+zebrafish.">Somite development in zebrafish.</a> Dev Dyn. 219, 287-303 (2000).</li><li>Weinberg, E. S., Allende, M. L., Kelly, C. S., Abdelhamid, A., Murakami, T., Andermann, P., Doerre, O. G., Grunwald, D. J., Riggleman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+zebrafish+MyoD+in+wild-type,+no+tail+and+spadetail+embryos.">Developmental regulation of zebrafish MyoD in wild-type, no tail and spadetail embryos.</a> Development. 122, 271-280 (1996).</li><li>Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restricted+expression+of+cardiac+myosin+genes+reveals+regulated+aspects+of+heart+tube+assembly+in+zebrafish.">Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish.</a> Dev. Biol. 214, 23-37 (1999).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

WISHは、学生が既知の遺伝子発現パターンの可視化によって解剖学的発達における遺伝学の役割を理解するための比較脊椎動物生物学の実験室のコースで使用されていました。コー​​スの前半では、学生はそれらの十分な時間が、勉強の理解、比較、およびコントラストの脊椎動物の解剖できるように、いくつかの異なる脊索動物の分類群を代表する生物に解剖を行った。 もちろん第二部への導入として、生徒たちはゼブラフィッシュの開発と解剖学を記述する正式な講義を与えられた。 WISHの実験の方法と期待される結果についても議論された。学生はその後、体節形成と発展のプリム- 6ステージでのライブゼブラフィッシュを与えられた、そして2および5日後に受精（DPF）で解剖顕微鏡下で調べることができます。これは、学生がゼブラフィッシュの胚はどのようなものをより深く理解し、個体発生を介して起こる形態学的変化の種類を提供することでした。 次のラボセッションでは、生徒が以前に実行された希望するゼブラフィッシュ胚を与えられた。彼らは、関心の各遺伝子（リボプローブ使用）のために遺伝子の発現パターンを研究し、記述するように求めていた。 WISHのために使用される胚は、ヘテロ接合ace/fgf8aラインのメンバーの間で交配から得られた。メンデル遺伝に基づいて、ace/fgf8aの交配からの胚の25％はホモ接合変異体であることが、このコースに焦点を当てた解剖学的構造の多くの欠陥を示すことが期待されていた。アルバートソンの研究室で発表された報告と未発表の観察に基づいて、脳や不適切な心臓のルーピングに欠陥が期待されただけでなく、体節の欠損（ブランドら、1996;。アルバートソンとYelick、2005;個人的な観察 ​​）。 学生は提示、各遺伝子の発現パターンのために、すべての標本、野生型（ヘテロ接合の動物は、開発の早い段階で野生型の兄弟から区別できない）とホモ接合変異体を調べるように求めていた。彼らはその後、欠陥のある遺伝子の発現は、解剖学的奇形が沈殿している可能性がありますか、それらの結果を記述する実験レポートを書くように頼まれ、解剖学や遺伝学の知識に基づいていた。 学生は、興奮と好奇心でこの実験室での練習を受け取るように見えた。最も前にウィッシュ使用がなかったと極めて当然のこの部分に興味を持っていた。学生が興味をそそるゼブラフィッシュ胚における遺伝子発現の異なるパターンを見つけ、いくつかにも説明した染色パターンは、スマイリーフェイスのようなよく知られているデザインや記号、それらを関連付けることによって可視化。その結果、ラボのレポートは、学生がWISHのプロトコルと、特定の解剖学的構造における遺伝子の発現の一般的な理解を持っていた示した。 。。Huelskenら、2002;。Geetha - Loganathan ら 、2008A、Geetha - Loganathan ら 、2008bの研究室（スティックニーら 、2000年にウィッシュを用いて調べた生徒も遺伝子の特定の機能を理解する必要がありました。 ）。それは、特定の学生が限られたバックグラウンドのシグナル伝達経路の知識と関心のある遺伝子を持っていたこと、しかし、明らかになった。これらの概念の詳細については、導入の講義は、将来の比較脊椎動物の生物学のコースでWISHの使用に歓迎さかもしれない願っています。 プロトコルは一般的にコースのスケジュールに応じて、4日連続がかかるので、学生はクラスとインストラクターが、残りの責任でなければならないの実験の一部を完了することができます。ティーチングアシスタントがすべての前の手順を実行しながら、比較脊椎動物生物学のクラスで、学生は、実験室で染色反応を完了した。それは実行がクラスで希望する学生の方を好まれる方が多い場合、プロトコルは、クラスの時間枠に応じて、いくつかの実験室でのセッションにまたがって実行可能なサブユニットに分割することができる。それが一度だけここで週にラボの会議のためだったので学生は、全体のプロトコルを実行するために実行可能でない場合、学生はクラスの先頭に染色液を追加し、使用するリボプローブに応じて、完全な染色を持つことができます時間内に。それは開発する染色に要する時間は、それぞれのリボプローブとの様々な実験条件によって大きく変化し、クラスの前にあらかじめ決定されるべきである。特に、学生が唯一の研究室で染色を開発する場合、インストラクターは、教室の外でかなりの時間と労力を必要とするすべてのこれまでの手順、責任を負います。必要に応じて、ウィッシュより短い代わりに、タンパク質の局在を可視化する抗体のラベルを使用して、免疫組織化学かもしれない、しかしこの時点で、発達遺伝子のゼブラフィッシュ特異的抗体は、容易に入手可能ではありません。別のオプションは、別の脊椎動物種でWISHを実行する方法です。NDは、学生がさまざまな生物で、同じ遺伝子の発現パターンを比較しています（。。荒巻ら、2007;。新興のモデル生物、2008; Pizard ら 、2004新興のモデル生物、2010）。 比較脊椎動物の生物学コースでWISHを使用しての包括的な目標は、分子生物学的手法、解剖学的発達を研究するために使用される方法を学生に示すことでした。また、遺伝子発現だけでなく発達奇形にも進化的変化につながる可能性がありますどのように変更されたのと推測することは学生のための機会を提供した。進化発生生物学（しばしば&quot;EVO -ディーヴォ&quot;とも呼ばれる）として形式化、研究のこの急速に成長しているフィールドは、開発を通じて遺伝子型と表現型をリンクするために、そして進化的変化の潜在的な機械論的基盤の解明を目指します。このフィールドの上昇に伴い、より多くの生態学者、organismal生物学者、そして生理学者は彼らの研究に分子技術を採用しています。我々は比較脊椎動物生物学コースでWISHの使用が研究中の現在の技術や概念の進歩でこれまでに、生物学的サブフィールドを組み合わせることにより、上位レベルの生物学コースのよりよい水平方向の配置を容易にするためのカリキュラムを維持するために役立つと主張している。また、この統合的なアプローチは、より多様な教育と今後の学際的な科学研究の振興につながる、学生は一つのコースで、生物学的研究手法の品揃えを学ぶ機会を提供します。

<ul><li>オートクレーブ</li><li>マイクロ遠心機</li><li> 37℃のインキュベーター（シェーカー付） </li><li> 4℃のマイクロ遠心</li><li>ウォーターバス</li><li>渦</li><li>ゲル電気泳動装置</li><li> -20℃の冷凍庫</li><li> -80℃の冷凍庫</li><li>ロッカー/シェーカー</li><li> 4℃の冷蔵庫</li><li>解剖顕微鏡（できれば授業の画面やカメラ付） </li></ul>

using whole mount in situ hybridization to link molecular and organismal biology

in situハイブリダイゼーション全体のマウント（WISH）は、全体のマウント標本内の特定のmRNA転写産物の局在によって遺伝子発現を研究するために使用される分子生物学の実験室における一般的な手法です。この技術は（アルバートとYelick、2005年から適応）シラキュース大学の上位学部比較脊椎動物の生物学の実験室の教室で使用されていました。比較脊椎動物の生物学実験講座の最初の3分の2は、学生が主に伝統的な解剖やモデルの使用を介して様々な脊索動物の分類群を表すいくつかの生物の発生学と肉眼解剖学を勉強する機会を与えた。コー​​スの最後の部分は、WISHがゼブラフィッシュ胚で実行された分子技術を採用する脊椎動物の発生の観察を通して解剖学を教えるために革新的なアプローチを含んだ。ヘテロ接合体線維芽細胞増殖因子8（fgf8a）変異体のライン、 エースは 、使用されていました。メンデル遺伝が原因で、エースは生産野生型、ヘテロ接合、そして午前1時02分01秒比率でホモ接合ace/fgf8a変異体をintercrosses。正中線のほか、心臓、体節、tailbud、筋節、脳などの解剖学的構造の開発に公知の発現パターンを持つRNAプローブを使用した。 WISHは、学生がクラス内の染色反応を行うと、13体節とプリム- 6の段階でゼブラフィッシュを用いて行った。開発のさまざまな段階でゼブラフィッシュ胚の研究は、学生がこれらの解剖学的構造は、個体発生を介してどのように変化したか観察する能力を与えた。さらに、いくつかace/fgf8a変異体は、不適切な心臓のルーピング、および体節と脳の発達の欠陥を表示。この研究室の学生は、外部の解剖学だけでなく、遺伝子発現パターンの両方を使用して、さまざまな器官系の正常な発達を観察した。彼らはまた、不適切な解剖学的な開発と遺伝子発現（すなわち、推定変異体）表示胚を特定し、説明した。 既に必要な機器を所有していない機関でまたはラボとカリキュラムの革新のための資金が限られているインストラクターの場合は、試薬と装置の金融コストは、時間と労力の一部に必要とされる、考慮する要因となる可能性があります設定に関係なくインストラクター。それにもかかわらず、私たちは教室の実験室の設定のこのタイプのWISHの使用は発生遺伝学と解剖学の間に重要なリンクを提供できると主張している。技術の進歩と分子レベルでorganismal開発を研究する能力がより簡単に、安く、そしてますます普及しつつあり、多くの進化生物学者、生態学者、そして生理学は分子生物学の分野での研究戦略に目を向けている。比較脊椎動物の生物学の実験室の教室でウィッシュ使用すると、分子と解剖学が単一のコース内に収束する方法の一例です。これは、上位レベルの大学生に、より多様な教育と今後の学際的な科学研究の振興につながる近代的な生物学的研究手法を、実践する機会を与えてくれます。

Watch this Scientific Journal Video about Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology at JoVE.com

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

全体のマウント<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（WISH）は解剖を脊椎動物に加えて、上位学部比較脊椎動物の生物学のコースで使用されていました。これにより、学生は一つのコース内の分子とorganismal生物学の研究を結ぶだけでなく、肉眼解剖学などの遺伝子発現パターンを研究する機会を与えた。

全マウントを使用するその場で</em分子とOrganismal生物学をリンクする>ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

using-whole-mount-situ-hybridization-to-link-molecular-organismal

Research

JoVE Journal

Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

21.5K ビュー.  Syracuse University. 全体のマウントその場でハイブリダイゼーション（WISH）は解剖を脊椎動物に加えて、上位学部比較脊椎動物の生物学のコースで使用されていました。これにより、学生は一つのコース内の分子とorganismal生物学の研究を結ぶだけでなく、肉眼解剖学などの遺伝子発現パターンを研究する機会を与えた。

ビデオ: Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

初期のニワトリ胚のin situハイブリダイゼーションダブルホールマウント

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

生物学

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

チックの全マウントの抗体染色のための方法

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

全体のマウント<em&gt;上皮内</emE11.5マウス胚へのE8.5&gt;ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

自動化を使用して染色体のハイスループット物理マッピング<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

蛍光灯と組み合わせることで染色体の複製タイミング<em&gt;その場</em&gt;ハイブリダイゼーション

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNAを<em&gt;その場</emホールマウント胚および細胞組織学で&gt;ハイブリダイゼーションは、海洋軟骨魚類に適合した

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

高解像度全マウント<em&gt;その場で</em遺伝子発現と機能を研究するためにゼブラフィッシュ胚内&gt;ハイブリダイゼーション

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

全マウントを使用するその場でハイブリダイゼーション