Yazarlar Karşılaştırmalı Omurgalı Biyoloji ders yönetim rolleri için, Syracuse Üniversitesi, Dr. Marilyn Kerr Biyoloji Bölümü kabul etmek istiyorum. Albertson laboratuar Sağlık / National Institute of National Institutes Yaşlanma Ulusal Sağlık / Ulusal Enstitüsü Diş ve Kraniofasial Araştırma Enstitüleri, gibi hibe R01AG031922 hibe R21DE019223 tarafından desteklenmektedir.

1. Plazmid cDNA Hedef Dönüşüm Bölüm I: Plazmid Dönüşüm (Gerekli Zaman: 3 saat artı bir gecede inkübasyon) <ol><li> 42 ° C su banyosunda sıcak SOC besin suyu (reaksiyon başına 500 mcL) </li><li> Buz üzerinde yetkili hücreleri Çözülme </li><li> 25 mcL yetkili hücrelere plazmid 1 mcL ekle </li><li> 20 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. </li><li> 45 saniye için 42 ° C su banyosu içinde ısı şok hücreleri </li><li> Hemen 2 dakika boyunca buz üzerinde hücre </li><li> 42 ° C besin suyu hücrelerin her flakon 500 mcL ekleyin </li><li> 37 ° C&#39;de 2 saat boyunca dakikada 255 rotasyonlar (rpm) çalkalayınız </li><li> Plaka 75 Luria Bertani (LB) agar plaklarına mcL dönüşüm karışımı </li><li> Inkübe plakaları 37 ters ° C gecede </li></ol> Bölüm II: E. coli Kültür (Zaman: 15 dakika artı bir gecede inkübasyon) <ol><li> Bir kültür tüp içine her reaksiyon, kısım 3 ml LB suyu ve 50 mg / ml ampisilin 3 mcL </li><li> Agar plaka 1 bakteri kolonisi kazıyın ve her kültür tüpüne ekleyin </li><li> 37 kültür tüpleri çalkalayın ° C 255 rpm gecede </li></ol> Bölüm III: Plazmid Hazırlık (Gerekli Zaman: 1.5 saat) <ol><li> 5 Başbakan FastPlasmid Mini Kit (Katalog # 2300000) kullanarak bir gecede kültürlerden gelen plazmid Isolate </li><li> Hazırlanan plazmid varlığını kontrol etmek için, etidyum bromür ile boyanmış% 1 Tris-asetat-EDTA (TAE) ve jel kiti yıkandı, DNA çalıştırın </li></ol> 2 Situ DIG etiketli RNA Prob Sentezi Bölüm I: Plazmid lineerleştirilmesi (Gerekli Zaman: 2,5 saat) <ol><li> 1.5 mL mikrofuge&#39;de tüp, bir araya getirir:. <table border="1"><tbody><tr><td> Plazmid Hazırlayan: </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Restriksiyon enzimi * </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> Tampon ** </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 10X Bovine Serum Albumin (BSA) </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Dietil Pyrocarbonate (DEPC) Su </td><td> 58 ml </td></tr><tr><td></td><td> 100 mL </td></tr></tbody></table></li><li> 37 ° C&#39;de 2 saat süreyle inkübe * Plazmid ile değişir ** Restriksiyon enzimi ile değişir. </li></ol> Bölüm II: Transkripsiyon (Gerekli Zaman: 3 saat) <ol><li> 1.5 mL mikrofuge&#39;de tüp, bir araya getirir:. <table border="1"><tbody><tr><td> Plazmid Doğrusal </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> 10X Transkripsiyon Tampon ** </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Digoxigenin Etiket Karışımı </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Polimeraz * </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> RNaz İnhibitör </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> DEPC Su </td><td> 24 ml </td></tr><tr><td></td><td> 40 ml </td></tr></tbody></table></li><li> 1 saat için 37 ° C&#39;de inkübe </li><li> Polimeraz * 2 mcL ekle </li><li> 1 saat için 37 ° C&#39;de inkübe </li><li> Ekle 2 DNaz mcL </li><li> 37 ° C&#39;de 20 dakika * Plazmid ile değişir ** Polimeraz ile değişir. </li></ol> Bölüm III: Yağış (Gerekli Zaman: gecede inkübasyon, 1 saat 5 dakika artı 2 saat santrifüj ve yeniden askıya alma) <ol><li> 0,2 M EDTA 4 mcL ekle </li><li> 4M lityum klorür 5 mcL ekle </li><li> Buz gibi% 100 etanol 150 mcL ekle </li><li> Gecede için -80 ° C&#39;de 2 saat süreyle inkübe </li><li> 4 ° C, süzün uzakta supernatant 30 dakika 14.000 rpm&#39;de Santrifüj </li><li> 7 dakika Kuru pelet </li><li> 20 mcL DEPC su yeniden askıya </li><li> 37 ° C&#39;de 5 dakika </li></ol> Bölüm IV: Fraksiyonu - prob boyutu 0,6 kb daha büyük ise gerçekleştirin (Gerekli Zaman: Genellikle hayır, 20 dakikadan fazla prob boyutuna göre değişir) <ol><li> 1.5 mL mikrofuge&#39;de tüp, bir araya getirir:. <table border="1"><tbody><tr><td> RNA Probe </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> DEPC Su </td><td> 12 mL </td></tr><tr><td> Sodyum bikarbonat </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Çamaşır sodası </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td></td><td> 40 ml </td></tr></tbody></table></li><li> 60 ° C su banyosunda inkübe edin. Denklemi inkübasyon süresi Duy: Süresi (dak.) = (kb başlangıç ​​istenilen kb) / (0,11 x kb x itibaren istenilen kb) Ortalama istenen büyüklük = 0.6 kb </li></ol> Bölüm V: Final Yağış (Gerekli Zaman: 5 dak.gecede inkübasyon, 1 saat oda ısısında artı 2 saat) santrifüj ve jel elektroforezi için yeniden askıya alma, 1 saat <ol><li> 40 mcL DEPC su ekleyin </li><li> 8 mcL Sodyum Asetat ekle </li><li> 1.04 mcL Asetik Asit </li><li> 240 mcL buz gibi% 100 etanol ekle </li><li> Gecede için -80 ° C&#39;de 2 saat süreyle inkübe </li><li> 4 ° C, süzün uzakta supernatant 30 dakika 14.000 rpm&#39;de Santrifüj </li><li> 7 dakika Kuru pelet </li><li> 20 mcL DEPC su yeniden askıya </li><li> Karıştırmak için Vortex </li><li> Spastine Özgü Riboprop varlığını kontrol için% 1 TAE jel boyanmış, etidyum bromür ile tekrar askıya çözüm çalıştırmak </li></ol> 3. Tüm Dağı Situ Hibridizasyon Bölüm I: Embriyolar fiksasyonu ve Proteinaz K Sindirim (Gerekli Zaman: Fix gecede artı 4 saat saklama için ertesi gün, 2,5 saat depolama Bölüm II) <ol><li> Zebra balığı embriyolar sahnelenen toplayın ve gece 4,% 4 paraformaldehid (PFA) düzeltmek ° C </li><li> Tween-20 (PBSt) 3 kez 10 dakika her biri için% 0.1 içeren sabit embriyolar yıkayın fosfat tamponlu salin </li><li> Ince uçlu forseps kullanarak deneysel reaktifler, elle dechorionate embriyolar (gerekirse) embriyoların pozlama sağlamak için </li><li> Bir saat süreyle% 25 oranında kademeli bir dizi her yıkama, yıkama ve PBSt% 50 metanol dehydrate embriyolar, daha sonra -20 ° C&#39;de% 100 metanol içinde saklamak </li><li> Kullanıma hazır,% 50 (2 kez) ve% 25 (1 kez), her biri için 10 dakika PBSt metanol yıkama PBSt embriyoların rehidrate. Son olarak, her biri için 10 dakika% 100 PBSt 2 kez yıkayın. Kesin zamanlama PBSt / metanol yıkar için önemli değildir </li><li> Koyu pigmentleri uzaklaştırmak için PBSt% 10 hidrojen peroksit çözeltisi gerekirse, Bleach embriyolar. Embriyolar, 10-20 dakika boyunca, embriyonun yaşına bağlı olarak hidrojen peroksit çözeltisi inkübe gerektiğini ve mikrofuge&#39;de tüp kapağı hava basıncı birikmesini önlemek için açık kalmalıdır </li><li> 50 mg / ml proteinaz K ile Digest embriyolar embriyo yaşına bağlı olarak 3-15 dakika PBSt 1:5000 sulandırılmış </li><li> Re-fix 30 dakika boyunca% 4 PFA embriyolar ve her 5 dakika için, PBSt 3 kere yıkayın </li></ol> Bölüm II: Riboprobes Hibritleşme (Gerekli Zaman: 3 saat artı hibridizasyon için bir gecede, 1.5 saat Bölüm III ertesi gün) <ol start="9"><li> 2-3 saat önceden ısıtılmış 70 ° C su banyosunda prehybridization solüsyonu (PHS) embriyo Prehybridize </li><li> PHS Kaldır 0.5 ml, 70 ° C gece boyunca inkübe hibridizasyon çözüm ve 1.5 mcL önceden sentezlenmiş digoxigenin etiketli riboprobes, ekleyin. Sıcaklık Spastine Özgü Riboprop hedef bağlı olarak birkaç derece içinde dalgalanma </li><li> Ertesi gün, 70 embriyolar yıkayın ° C PHS her biri için 10 dakika tuzlu 2X-sodyum sitrat (SSC)% 75,% 50 ve% 25 oranında kademeli çözümler, sonra 68, 30 dakika boyunca 0,2 X SSC yıkayın ° C </li><li> Her biri için 10 dakika oda sıcaklığında Maleik Asit Buffer (MAB) 2 kez yıkayın </li></ol> Bölüm III: Anti-digoxigenin (α-DIG) Antikor Kuluçka (Gerekli Zaman: 3 saat artı engellemek için bir gecede 2,5 saat Bölüm IV ertesi gün) <ol start="13"><li> 12 plaka embriyolar transfer </li><li> Ön blok embriyolar en az 3 saat boyunca oda sıcaklığında 1-2 ml engelleme çözümü </li><li> Aynı zamanda, bu çözüm engelleme çözümünün ikinci bir birim hazırlıyor ve anti-digoxigenin antikor 1:2000 seyreltilmesi antikor ön blok </li><li> Blok öncesi çıkarın ve 1-2 ml önceden bloke α-DIG çözüm ekleyin, 4 gece boyunca inkübe ° C </li><li> Ertesi gün, MAB embriyoların yıkayın. Embriyolarının ilk 5 dakika MAB inkübe izin ver, sonra tampon değişiklikleri gerçekleştirmek ve iki 10 dakika, bir 30 dakikalık ve bir 60 dakikalık zaman aralığı inkübe edin. Kesin zamanlama gerekli değildir </li><li> Alkalen Fosfataz (AP) tampon her 5 dakika için embriyoların 3 kere yıkayın </li></ol> Bölüm IV: Boyama ve Final İşleme (Gerekli Zaman: 1 saat, geceleme boyama kullanılan Spastine Özgü Riboprop bağlı olarak, gliserol yıkar, gliserol yıkama başına 6-10 saat başına 4 saat gliserol saklanabilir) <ol start="19"><li> Boyama yeterli kadar, 1-2 ml boyama çözüm embriyoların plaka folyo ile sarın ve düzenli aralıklarla (her 20 dakika) boyama kontrol </li><li> Boyanma reaksiyonu durdurmak için her biri için 5 dakika PBSt 2 kez embriyo yıkayın </li><li> Arka plan boyama kaldırmak için,% 100 metanol sonra 10 dakika yıkar% 25 (1 kez) ve% 50 (2 kez) PBSt metanol kullanarak embriyolar dehydrate </li><li> Embriyoların% 100 metanol içinde en az 2 saat oda sıcaklığında inkübe izin verin </li><li> 50% 10 dakikalık yıkama (2 kez) ve% 25 (1 kez) PBSt metanol kullanarak PBSt rehidrate, sonra% 100 PBSt 2 kez yıkayın </li><li> Lekeli e aktarma4 kademeli bir yıkama, bir dizi ve mağaza kullanarak PBSt% 80 gliserol çözüm mbryos ° C. </li></ol> Tarifler: <ul><li> LB agar plakları 10 g LB agar + 250 mL distile su, otoklav, dokunmatik serin her petri kaplarına dökün 15-20 mL sıcak çözüm, 250 mcL ampisilin, agar katılaşmaya izin </li><li> LB besiyeri 12,5 g LB Broth + 200 mL distile su, otoklav, kullanmadan önce soğumasını bekleyin. </li><li> % 1 TAE jel 0.4 g agaroz, 40 ml 1X TAE, 2 mcL etidyum bromür; yük 7 mcL plazmid (cDNA Hedef Plazmid Dönüşüm) veya 3 mcL Spastine Özgü Riboprop ve 4 mcL DEPC su (in situ DIG etiketli RNA Prob Sentezi) + 1 mcL yükleme boya, 5 mcL DNA merdiveni </li><li> Prehybridization çözüm% 50 formamid, 5X SSC, 9.2mM sitrik asit,% 1 Tween-20 </li><li> Hibridizasyon çözüm prehybridization çözümü artı 500 mg / ml tRNA ve 50 mikrogram / ml Heparin </li><li> Maleik Asit MAB-100mm, 150mm NaCl, 0,2 M NaOH,% 0.1 Tween-20, 7.5 pH </li><li> MAB Engelleme Çözüm-3 parça MAB, 1 kısım% 10 Boehringer engelleme reaktif, 1 parçası ısı kuzu serum devre dışı </li><li> 9.5 AP tampon-60mm Tris-HCl pH, 60mm NaCl, 30mm MgCl 2,% 0.1 Tween-20 </li><li> Boyama Çözüm-5-Bromo-4-kloro-3-indolyl fosfat (BCIP) ve Nitro mavi tetrazolium (NBT) AP tampon </li></ul> 4. TEMSİLCİSİ SONUÇLAR Doğru yapıldığında, NBT BCIP ve alkalen fosfataz arasındaki reaksiyon zebrafish embriyo mor bir leke olarak görünmelidir mor bir çökelti oluşacaktır. Riboprobes ilgi gen cDNA ilgili daha önce sentezlenmiş olmalıdır. Bu nedenle, herhangi bir leke görüntülenebilmekte, o belirli gelişimsel aşamada ilgi gen transkripsiyonu edildiği zebrafish alanlarda temsil söylenebilir. Fgf8a (Reifers vd, 1998; Şekil 2); deltaC (Oates ve ark, 2005) Bu dersin amacı, riboprobes aldh1a2 (Begemann ve ark, 2001; Şekil 1, daha önce raldh2) sentezlenmiştir; myod1 (Weinberg ve ark, 1996); shha (. Krauss ve ark, 1993), pax2a (Marka ve ark, 1996; Şekil 3) ve myl7 cDNA (önceden cmlc2; Yelon ve ark, 1999). Boyama, orta hatta ve Somitlerin tailbud, myotome, beyin ve kalp gibi anatomik yapıların bekleniyordu. Ace/fgf8a mutantlar bu yapıların pek çok kusurları olması beklenmektedir . Boyama kolayca standart bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak görüntülendi. (Schoenwolf, 2009; D&#39;Costa ve ark, 2009; Schmoldt ve ark, 2009. Clark, 2003) Ek kaynaklar burada açıklanan benzer teknikleri İSTEDİKLERİ hakkında daha fazla bilgi ve sorun giderme içerir. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 aldh1a2 için özel riboprobes ile melezleşmiştir olmuştur zebrafish embriyo 24 saat gübreleme,. Özel boyama, göz, beyin, göğüs yüzgeci tomurcuk primordia ve Somitlerin görülebilir. Anterior, üst, arka alt etmektir. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. 13 hücre gruplarının gelişme aşamasında zebrafish embriyo fgf8a için bir prob özel melezleşmiştir olmuştur. Özel boyama telencephalon, sırt diensefalon, orta beyin-Beyin sınır, Somitlerin ve tailbud görülür. Ventral sol, sağ dorsal. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 pax2a, sinir sisteminin görüntülenmesi için yararlı güçlü bir belirteç için bir Spastine Özgü Riboprop özel melezleşmiştir 22 saat sonra döllenme zebrafish embriyo. Özel boyama koroid fissür, orta beyin Beyin sınır, otik vezikül ve spinal kord nöronları görülebilir. Dorsal anterior sol görünümü.

<ol>
	<li>Albertson, R. C., Yelick, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+fgf8+signaling+in+left-right+patterning+of+the+visceral+organs+and+craniofacial+skeleton.">Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton.</a> Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).</li><li>Aramaki, M., Kimura, T., Udaka, T., Kosaki, R., Mitsuhashi, T., Okada, Y., Takahashi, T., Kosaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+expression+profile+of+chicken+CHD7,+the+ortholog+of+the+causative+gene+for+CHARGE+syndrome.">Embryonic expression profile of chicken CHD7, the ortholog of the causative gene for CHARGE syndrome.</a> Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 79, 50-57 (2007).</li><li>Begemann, G., Schilling, T. F., Rauch, G. J., Geisler, R., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+neckless+mutation+reveals+a+requirement+for+raldh2+in+mesodermal+signals+that+pattern+the+hindbrain.">The zebrafish neckless mutation reveals a requirement for raldh2 in mesodermal signals that pattern the hindbrain.</a> Development. 128, 3081-3094 (2001).</li><li>Brand, M., Heisenberg, C. P., Jiang, Y. J., Beuchle, D., Lun, K., Furutani-Seiki, M., Granato, M., Haffter, P., Hammerschmidt, M., Kane, D. A., Kelsh, R. N., Mullins, M. C., Odenthal, J., van Eeden, F. J., Kane, D. A., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+zebrafish+genes+affecting+the+formation+of+the+boundary+between+midbrain+and+hindbrain.">Mutations in zebrafish genes affecting the formation of the boundary between midbrain and hindbrain.</a> Development. 123, 179-190 (1996).</li><li>Clark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ Hybridization: Laboratory Companion. , (2003).</li><li>D'Costa, A., Shepherd, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+development+and+genetics:+Introducing+undergraduates+to+developmental+biology+and+genetics+in+a+large+introductory+laboratory+class.">Zebrafish development and genetics: Introducing undergraduates to developmental biology and genetics in a large introductory laboratory class.</a> Zebrafish. 6, 169-177 (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 1. , (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , (2010).</li><li>Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+in+limb+organogenesis.">Wnt signaling in limb organogenesis.</a> Organogenesis. 4, 109-115 .</li><li>Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M., Huang, R., Christ, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+in+somite+development.">Wnt signaling in somite development.</a> Ann Anat. 190, 208-222 .</li><li>Huelsken, J., Behrens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+signaling+pathway.">The Wnt signaling pathway.</a> J Cell Sci. 15, 3977-3978 (2002).</li><li>Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functionally+conserved+homolog+of+the+Drosophila+segment+polarity+gene+hh+is+expressed+in+tissues+with+polarizing+activity+in+zebrafish+embryos.">A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos.</a> Cell. 75, 1431-1444 (1993).</li><li>Oates, A. C., Mueller, C., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+function+of+deltaC+and+her7+in+anterior+segment+formation.">Cooperative function of deltaC and her7 in anterior segment formation.</a> Dev. Biol. 280, 133-149 (2005).</li><li>Pizard, A., Haramis, A., Carrasco, A. E., Franco, P., L&#243;pez, S., Paganelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridization+and+detection+of+RNAs+in+vertebrate+embryos+and+isolated+organs.">Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2004).</li><li>Reifers, F., Bohli, H., Walsh, E. C., Crossley, P. H., Stainier, D. Y., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+is+mutated+in+zebrafish+acerebellar+(ace)+mutants+and+is+required+for+maintenance+of+midbrain-hindbrain+boundary+development+and+somitogenesis.">Fgf8 is mutated in zebrafish acerebellar (ace) mutants and is required for maintenance of midbrain-hindbrain boundary development and somitogenesis.</a> Development. 125, 2381-2395 (1998).</li><li>Schmoldt, A., Forecki, J., Hammond, D. R., Udvadia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+differential+gene+expression+in+zebrafish+to+teach+basic+molecular+biology+skills.">Exploring differential gene expression in zebrafish to teach basic molecular biology skills.</a> Zebrafish. 6, 187-199 (2009).</li><li>Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Studies of Vertebrate and Invertebrate Embryos: Guide and Atlas of Descriptive and Experimental Development. , (2008).</li><li>Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somite+development+in+zebrafish.">Somite development in zebrafish.</a> Dev Dyn. 219, 287-303 (2000).</li><li>Weinberg, E. S., Allende, M. L., Kelly, C. S., Abdelhamid, A., Murakami, T., Andermann, P., Doerre, O. G., Grunwald, D. J., Riggleman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+zebrafish+MyoD+in+wild-type,+no+tail+and+spadetail+embryos.">Developmental regulation of zebrafish MyoD in wild-type, no tail and spadetail embryos.</a> Development. 122, 271-280 (1996).</li><li>Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restricted+expression+of+cardiac+myosin+genes+reveals+regulated+aspects+of+heart+tube+assembly+in+zebrafish.">Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish.</a> Dev. Biol. 214, 23-37 (1999).</li></ol>

DİLEĞİYLE Karşılaştırmalı Omurgalı Biyoloji laboratuvar ders öğrenciler bilinen gen ekspresyonu görselleştirme yoluyla anatomik gelişimi genetik rollerini anlamalarına yardımcı olmak için kullanılmıştır. Dersin ilk bölümü için, öğrenciler, onlara yeterli zaman, çalışma anlamak, karşılaştırın ve kontrast omurgalı anatomi izin, birkaç farklı kordalı takson temsil organizmalar üzerinde diseksiyonu. Dersin ikinci bölümü için bir giriş olarak, öğrenciler zebrafish geliştirme ve anatomi açıklayan resmi bir ders verildi. DİLERİZ deney yöntemleri ve beklenen sonuçları da ele alındı. Öğrenciler daha sonra canlı zebrafish somitogenesis ve gelişim prim-6 aşamaları verildi, 2 ve 5 gün sonrası fertilizasyon (dpf) diseksiyon mikroskop altında incelemek için. Bu öğrenciler zebrafish embriyolar neye benzediğini daha iyi bir anlayış ve ontogeny üzerinde meydana gelen morfolojik değişiklikler türleri vermek oldu. , Bir sonraki laboratuvar oturumda, öğrenciler DİLERİZ daha önce yapılmış olan zebrafish embriyolar verildi. Onlar her gen ilgi (Spastine Özgü Riboprop kullanılan) için gen ekspresyonu incelemek ve açıklamak için istendi. DİLERİZ için kullanılan Embriyolar heterozigot ace/fgf8a hattı üyeleri arasında çiftleşmelerin elde edilmiştir. Mendel kalıtım dayanarak, ace/fgf8a çiftleşmelerin embriyoların% 25 homozigot mutantlar olmak ve bu derste odaklanmış anatomik yapıların birçok kusurlarını sergilemek bekleniyordu. Albertson laboratuarında yayınlanan raporlar ve yayınlanmamış gözlemler göre, beyin ve uygunsuz kalp döngü kusurları Somitlerin hatalarına (Albertson ve Yelick, 2005, kişisel gözlemler Marka ve ark, 1996) yanı sıra, beklenen edildi. Öğrenciler sunulan her gen ekspresyonu desen için, tüm örnekler, yabani türü (geliştirmenin erken aşamalarında heterozigot hayvanlar vahşi tip kardeşleri ayırt edilemez) ve homozigot mutantlar incelemek istendi. Daha sonra kendi sonuçlarını açıklayan laboratuvar raporları yazmak istedi, ve anatomi ve genetik, hatalı gen ekspresyonu anatomik malformasyonlar nasıl tetiklemiş olabileceğini bilgiye göre. Öğrenciler, bu heyecan ve merak ile laboratuar egzersiz almak için görünüyordu. En önce İSTEDİKLERİ hiç kullanılmamış olduğunu ve dersin bu bölümünde son derece ilgilenmişlerdir. Öğrenciler ilginç zebrafish embriyolar gen ifadesinin farklı desen bulundu, hatta bazıları açıklanan boyanma böyle bir gülen yüz olarak bilinen desen ve semboller ile ilişkilendirilmesi tarafından görüntülendi. Sonuçlanan laboratuvar raporları, öğrencilerin DİLERİZ protokol ve belirli anatomik yapıları genlerin ifadesi genel bir anlayış vardı gösterdi. Huelsken ve ark, 2002; Geetha-Loganathan ve ark, 2008a;. Geetha-Loganathan ve ark, 2008b Öğrenciler ayrıca belirli genlerin fonksiyonlarını anlamak için gerekli laboratuar sırasında (Stickney ve ark, 2000 İSTEDİKLERİ kullanılarak çalışıldı .) Bazı öğrenciler sınırlı arka plan sinyalizasyon yollarının bilgi ve ilgi gen olduğunu, ancak açıkça görülmüştür. Bu kavramlar hakkında daha fazla bilgi giriş dersi gelecek Karşılaştırmalı Omurgalılar Biyolojisi içerisinde DİLERİZ kullanımı hoş bir ilave olabilir WISH. Protokol genellikle ders çizelgesi bağlı olarak, arka arkaya dört gün sürer, öğrenciler sadece sınıf ve öğretim geri kalanı için sorumlu olmalıdır deneyinin bir parçası tamamlamak için mümkün olabilir. Öğretim Görevlisi tüm Yukarıdaki adımları gerçekleştirdikten Karşılaştırmalı Omurgalı Biyoloji sınıfta, öğrenciler, laboratuvarında boyama reaksiyonları tamamladı. Gerçekleştirmek sınıf İSTEDİKLERİ öğrencilerin tercih edilirse, protokol sınıfın zaman çerçevesine bağlı olarak, çeşitli laboratuvar oturumda yapılabilir alt birimden ayrılabilir. Burada haftada yalnızca bir kez laboratuvar toplantı nedeniyle olduğu gibi öğrenciler, tüm protokol gerçekleştirmek için bu mümkün değilse, öğrenciler, kullanılan Spastine Özgü Riboprop bağlı olarak sınıf başında boyama çözüm ve boyama tamamlandı bir saat içinde. Leke geliştirmek için gereken süreyi her Spastine Özgü Riboprop ve çeşitli deneysel koşullar büyük ölçüde değişir ve sınıfın önünde önceden belirlenmiş olmalıdır. Özellikle, öğrenciler sadece laboratuarda leke gelişmekte olması durumunda, öğretim, sınıf dışında önemli bir zaman ve çaba gerektiren tüm Yukarıdaki adımları sorumlu olacaktır. İstenirse, kısa bir alternatif DİLERİZ için ancak şu anda gelişim genleri için zebrafish-spesifik antikorların hazır olmayan protein yerelleştirme görselleştirmek için antikor etiketleri kullanarak, immünhistokimya olabilir. Başka bir seçenek de farklı omurgalı hayvan türü DİLERİZ gerçekleştirmek için birnd öğrencilerin farklı organizmalar aynı genlerin ekspresyonu karşılaştırmak (. Aramaki ve ark, 2007; Gelişen Model Organizmalar, 2008; Pizard ve ark, 2004 Gelişmekte olan Model Organizmalar, 2010) . Kullanarak herkesin ortak hedefi Karşılaştırmalı Omurgalı Biyoloji ders moleküler biyoloji teknikleri anatomik gelişimini incelemek için nasıl kullanıldığını öğrencilere göstermek için WISH. Ayrıca gen ekspresyonu sadece gelişimsel malformasyonlar değil, aynı zamanda evrimsel bir değişime yol açabilir nasıl değişmiş olarak spekülasyon yapmak öğrenciler için bir fırsat sağladı. Evrimsel gelişim biyolojisi (genellikle &quot;evo-devo&quot; olarak anılacaktır) olarak tanımlandı, hızla büyüyen bu alanda çalışma geliştirilmesi yoluyla bağlantı genotip ve fenotip ve evrimsel değişimin potansiyel mekanistik üsleri aydınlatmak için amaçlamaktadır. Bu alanın yükselişi ile birlikte, daha ekolojistler, organizma biyolog, ve fizyoloji araştırma moleküler teknikler kullanıyorlar. Biz Karşılaştırmalı Omurgalı Biyoloji ders DİLERİZ kullanımı, güncel teknolojik araştırma ve kavramsal gelişmeler ile güncel ve üst düzey biyoloji derslerinin biyolojik altbaşlıklarla birleştirerek daha iyi bir yatay hizalamayı kolaylaştırmak için müfredat yetişmek için yardımcı olacağını ileri sürmektedir. Ayrıca, bu bütünleştirici bir yaklaşım daha çeşitlendirilmiş bir eğitim ve gelecek disiplinler arası bilimsel araştırma teşviki giden öğrencilerin bir dersten bir çeşit biyolojik araştırma teknikleri öğrenme fırsatı sağlayacaktır.

<ul><li> Otoklav </li><li> Mikro-santrifüj </li><li> 37 ° C inkübatör (çırpıcı ile) </li><li> 4 ° C mikro santrifüj </li><li> Su banyosu </li><li> Girdap </li><li> Jel elektroforezi cihazları </li><li> -20 ° C derin dondurucu </li><li> -80 ° C derin dondurucu </li><li> Rocker / çalkalayıcı </li><li> 4 ° C buzdolabı </li><li> Diseksiyon mikroskobu (tercihen öğretim ekran veya kamera ile) </li></ul>

using whole mount in situ hybridization to link molecular and organismal biology

In situ hibridizasyon Tüm montaj (DİLERİZ) moleküler biyoloji laboratuvarlarında bütün montaj numune içinde spesifik mRNA transkript yerelleştirme yoluyla gen ekspresyonu çalışma için kullanılan yaygın bir tekniktir. Bu tekniği (Albertson ve Yelick, 2005 adapte), bir üst düzey lisans Syracuse Üniversitesi&#39;nde Karşılaştırmalı Omurgalı Biyoloji laboratuar sınıf kullanıldı. Karşılaştırmalı Omurgalılar Biyolojisi lab dersinde ilk üçte ikisi, öğrencilerin öncelikle geleneksel diseksiyonlar ve modellerin kullanımı ile çeşitli kordalı takson temsil eden çeşitli organizmaların embriyoloji ve brüt anatomi çalışma fırsatı verdi. Dersin son bölümünü DİLERİZ zebrafish embriyolar yapıldı moleküler teknikler kullanılarak omurgalı gelişme gözlem yoluyla anatomi öğretim yenilikçi bir yaklaşım söz konusu. Heterozigot fibroblast büyüme faktörü 8 (fgf8a) mutant hattı, as, kullanılmıştır. Mendel kalıtım nedeniyle, ace üretilen vahşi tip, heterozigot ve homozigot ace/fgf8a mutantlar 01:02:01 oranı intercrosses. Orta hatta ve kalp, Somitlerin, tailbud, myotome, ve beyin gibi anatomik yapıların geliştirilmesi bilinen ekspresyonu RNA probları kullanılır. DİLEĞİYLE öğrencilerin sınıfta boyanma reaksiyonu gerçekleştirirken, 13 hücre gruplarının ve prim-6 kademeli zebrafish kullanılarak yapıldı. Gelişmenin farklı aşamalarında zebrafish embriyoların çalışmada, öğrencilerin bu anatomik yapıların ontogeny içinde nasıl değiştiğini gözlemlemek için yeteneği verdi. Buna ek olarak, bazı ace/fgf8a mutantlar uygunsuz kalp döngü ve hücre gruplarının ve beyin gelişimi hatalarına görüntülenir. Bu laboratuvarda, öğrencilerin yanı sıra, gen ekspresyonu hem de dış anatomi kullanarak çeşitli organ sistemlerinin normal gelişimini gözlemledi. Onlar da yanlış anatomik gelişimi ve gen ekspresyonu (yani varsayılan mutantlar) gösteren embriyolar tespit ve tanımlanmıştır. Zaten gerekli donanımları kendi kurumlarında veya laboratuvar ve müfredat inovasyon için fon sınırlı eğitmenler için reaktifler ve cihazları finansal maliyet, zaman ve çaba parçası gerekli, dikkate alınması gereken bir faktör olabilir ayarı ne olursa olsun eğitmen. Bununla birlikte, sınıf laboratuar ortamında bu tip DİLERİZ kullanımı gelişim genetiği ve anatomi arasında önemli bir bağlantı sağlayabilir iddia. Teknoloji gelişmeler ve moleküler düzeyde organizma geliştirme çalışma yeteneği daha kolay, ucuz ve giderek daha popüler hale geldikçe, birçok evrimsel biyolog, ekolojistler, fizyoloji, moleküler biyoloji alanında araştırma stratejileri yönelmektedir. Karşılaştırmalı Omurgalı Biyoloji laboratuvar sınıfta İSTEDİKLERİ kullanarak moleküller ve anatomisi tek bir ders içinde yakınsama nasıl bir örnektir. Bu üst düzey üniversite öğrencileri daha çeşitlendirilmiş bir eğitim ve gelecek disiplinler arası bilimsel araştırma teşviki önde gelen modern biyolojik araştırma teknikleri, pratik yapma imkanı verir.

Watch this Scientific Journal Video about Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology at JoVE.com

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Tüm montaj<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (DİLERİZ) diseksiyonları omurgalı ek olarak bir üst düzey lisans Karşılaştırmalı Omurgalı Biyoloji dersinin kullanılmıştır. Bu öğrencilerin yanı sıra brüt anatomi gibi bir ders çalışma içinde organizma ve moleküler biyoloji bağlayan gen ekspresyonu çalışma fırsatı verdi.

Tüm Dağı In situ Moleküler Biyoloji ve organizma Biyoloji Link Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

using-whole-mount-situ-hybridization-to-link-molecular-organismal

Research

JoVE Journal

Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

21.5K Görüntüleme.  Syracuse University. Tüm montaj In situ Hibridizasyon (DİLERİZ) diseksiyonları omurgalı ek olarak bir üst düzey lisans Karşılaştırmalı Omurgalı Biyoloji dersinin kullanılmıştır. Bu öğrencilerin yanı sıra brüt anatomi gibi bir ders çalışma içinde organizma ve moleküler biyoloji bağlayan gen ekspresyonu çalışma fırsatı verdi.

Video: Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biyoloji

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Chick Tüm Dağı Antikor Boyama Yöntemi

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Tüm Dağı<em&gt; In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve&gt; Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

Otomatik kullanarak Kromozomlar Yüksek throughput Fiziksel Haritalama<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Floresan ile birlikte Kromozom çoğaltılıyor Zamanlama<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; Yerinde</emTüm Dağı Embriyolar ve Hücre histolojisi&gt; Hibridizasyon Deniz Elasmobranchs İçin Uyarlanmış

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Yüksek Çözünürlüklü Tüm Dağı<em&gt; Yerinde</emGen İfade ve Fonksiyon Eğitim için Zebra balığı Embriyolar içinde&gt; Hibridizasyon

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...