この作品は、DFGプロジェクト＃1 JA2108 / 2-1を通じてDJJに資金調達によってサポートされていました。

注：以下の手順は、Lの胚および幼生期にその場での実験で行うための我々の方法を概説しますステップはこれが単語&#39;注意&#39;で示され、すべての適切な安全手順が採用されるべき有害化学物質の使用を伴うstagnalis。有害化学物質のための代表的なMSDSシートへのリンクは、 補足ファイル1で提供されている。全ての試薬 ​​のためのレシピは、 補足ファイル2で提供されています。 脱カプセル化装置の1組立<ol><li>これを行うために、 図2Aに示すように、適切な長さにP1,000先端カットを使用して（1mmの内径3mmの外径を有する）シリコンチューブ20 mlの使い捨て注射器を接続します。 </li><li>反転大きなペトリ皿に、標準的な顕微鏡スライドをテープで固定します。 図に示すように、顕微鏡スライドに直接隣接したシリコンチューブをテープ60;図2Cおよび2D。 </li><li>顕微鏡スライド上に引っ張らガラス針を休ま、ゆっくりと針の先端がチューブの内径を横断道の約20％を突出するまで、シリコンチューブに挿入します（ 図2Cおよび2Dを参照）。針は、ペトリ皿に位置テープそれを下にしたら。 </li><li>シリコンチューブの自由端は、カプセル化を解除した材料を収集する別のペトリ皿に休息できるようにします。 </li></ol> 2.検体採取、固定化と脱カプセル化注：特に断りのない限り、すべてのステップは室温で実施されます。 <ol><li>慎重に水槽の壁から卵の文字列を集めます。これを行うには、基板から卵の文字列をこすり、水の外に浮遊卵の文字列を魚にプラスチック製の茶こしを使用するようにへらのように柔軟なプラスチックの平らな部分を使用します。 図に設けられたガイドを使用して、顕微鏡下で材料を舞台と並べ替え1。 </li><li>ペーパータオルの上に卵の文字列を配置し、フェザー級の鉗子を使用して卵塊に沿って縦切開を行います。卵の文字列のうち、卵カプセルをロールとフェザー級の鉗子を使用して、紙タオルの周りにそれらを押すことによって、各カプセルから可能なゼリーの材料の多くを削除します。 </li><li>フェザー級の鉗子を使用して、水道水5mlを含むペトリ皿に卵のカプセルを転送します。この皿に希望の発達段階の脱ゼリー状の卵カプセルを収集し続けます。そして、次のステップに進み、計画WMISH実験のためのすべての発達段階から十分なカプセルを収集します。 </li><li>より発展した幼虫を操作する場合は、固定する前に、それらをanaesthetize（5日は最初の切断（DPFC）と古いポスト）。 注：これは、 その場での染色パターンでの解釈が非常に困難にする契約から筋肉を防ぐことができます。 <ol><li>彼らはcapsuにまだある間（幼虫をリラックス固定前に30分間•6H 2 OのMgCl 2の2％w / vの溶液中でのレ）。 </li><li>まだ固定液中で彼らの卵カプセル内ながら、いくつかの幼虫を沈め、顕微鏡下での応答を監視することにより、30分後に緩和の程度を評価します。完全にリラックスした幼虫が応答しませんしながら、不完全にリラックスした幼虫は、自分の殻の中に収納されます。これらの幼虫が緩和されたら次のステップに進んでください。 </li></ol></li><li>卵カプセルの10倍の体積を提供する密封可能なチューブに広い口径のプラスチックピペットを用いて卵カプセルを転送する（ 例えば 、沈降カプセル1mlを10+ mlのチューブを必要とします）。 </li><li>チューブからできるだけ多くの液体として吸引し、定住卵カプセルの10倍の量である固定液の量と交換します。静かに各発達段階（ 図1を参照）のための適切な時間RTで固定剤で卵のカプセルを回転させます。 </li><li> DiscontinUE回転およびカプセルは、適切な廃棄容器に固定溶液をシンクし、吸引することができます。 </li><li>室温で5分間、0.1％のTween-20（PBTw）とリン酸緩衝生理食塩水で固定液を交換し、回転させることにより、卵カプセルを洗ってください。 PBTwを吸引し、二回繰り返します。 </li><li> 図2に示されている（詳細はセクション1を参照）装置を用いて、それらのカプセルから胚および幼生を削除します。最大20 mlシリンジにカプセルを描き、チューブを取り付け、その後に出て、チューブを通って、ガラス針を過ぎてカプセルを払拭コレクションの一品。 注：通常、すべてのカプセルの大部分（&gt; 90％）がデバイスを介して1つのパスのみを必要とする必要があります。多くの場合、カプセル膜が損傷しているが、胚および幼虫が破裂したカプセルの内部に残っています。単にシリンジにそれを描画し、再びそれを払拭することにより、この材料を再処理。 </li><li>マイクを使用して、1.5mlチューブにデカプセル化胚および幼生を収集ropipette（0 P20 - 3日齢幼虫、およびカットオフチップの先端を持つ古い幼虫のためのP200）。 注：この段階で行うことができるプロトコルで（数ヶ月までのための）ポーズ。これが必要な場合は、decapsuled材料は、（次のステップに進みます）保存のために1.5mlチューブに収集する必要があります。それ以外の場合は議定書3に、すぐに続けています。 </li><li>胚および幼虫がチューブの底に沈み、上清を吸引することを可能にします。 PBTwで33％エタノール（エタノール）と交換し、5放置 - 10分。 PBTw 66％エタノールおよび100％EtOHで繰り返します。室温で100％エタノールで二回幼虫を洗ってください。 100％EtOH中、-20℃で材料を保管してください。 </li><li> 10分 - 準備が継続する場合には、再水和物100％エタノールを除去し、PBTwで66％EtOHで置き換えることによって、サンプルは、5放置します。 10分 - 5放置、PBTwに33％EtOHで繰り返します。最後に、すべてのエタノールが除去されていることを確認するためにPBTwの3倍、5分間の洗浄で洗浄します。 </li></ol> 3.プロテイナーゼK、TEAとポストFiのxation 注：我々はすぐにタイムクリティカルなソリューションを交換するための最も効率的かつ穏やかな方法は、メッシュの床と小さなバスケットに次の手順を実行して見つけます。これらは自宅行うことができますが、我々はIntavis InSituPro -Vsi液体ハンドリングロボット（www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc）と互換性のあるバスケット（ミディアムサイズ）を使用します。このようなバスケットは、迅速かつ容易に交換溶液に順に12ウェル組織培養皿（TCD）のウェルの間で移動させることができ、または溶液を十分にピペットを使用してから吸引することができます。代わりに、すべてのソリューション交換は、単に幼虫からの上清を吸引することにより、これらのバスケットなく行うことができます。この場合、穏やかな旋回運動は、上清をウエルの縁部から除去されることを可能にする皿の中央にすべての胚および幼虫を集中します。以下は、ユーザーがソリューション交換のバスケットを採用されている前提としています。 <ol><li>ピペットを使用して、PBTwの2ミリリットルで12ウェルTCDに座ってバスケットに胚および幼虫を移します。 注：追加された発達段階に依存することができ胚および/ ​​または幼虫の数は、しかし、一般的な経験則は、胚/幼虫（ すなわちの空き床面積の少なくとも25％を維持することで、研究されている、しないでください）バスケットを混雑。 </li><li>適切なプロテイナーゼK溶液2ml（ 図1を参照）、および0.2％グリシンの2ミリリットルそれぞれに別の2つのウェルとよく隣接を準備します。よくプロテイナーゼKの適切な濃度を含む、すぐに開始タイミングに各バスケットを移動します。 </li><li> 10分後も含む0.2％グリシンに各バスケットを移動し、5分間インキュベートします。その後、0.2％グリシンを有する第2のウェルに各バスケットを移動し、5分間インキュベートします。 3ミリリットルPBTwの3×5分間の交流とグリシンを洗浄します。 </li><li> PBTw溶液を除去し、新たに調製したトリエタノールアミン（TEA）で1回のサンプルを扱うゾル5分間の注意のためのution！撹拌しないでください。 5分間の新たに調製したTEA溶液3mlと交換してください。攪拌しないでください。サンプルからのTEA溶液の大部分を吸引します。新たに調製された無水酢酸とトリエタノールアミン（TEAAA）ソリューションを追加し、5分間インキュベートする。 注意！撹拌しないでください。 </li><li> OPTIONAL - 上記の手順をインキュベートしている間、TEAAA液の別の新鮮なバッチを準備し、上記の手順を繰り返します。 注：TEAAAでのこの第二の処理はオプションですが、完全にバックグラウンドを生成する傾向がプローブとすべてのバックグラウンドを除去するために役立つことがあります。 </li><li>井戸からそれを吸引することによってTEAAA溶液を除去し、PBTwの3ミリリットルと交換してください。攪拌しないでください。 PBTwを削除し、PBTw 3.7％ホルムアルデヒドの3ミリリットルを適用します。ゆっくり30分のインキュベーションの間、時折渦巻きます。 </li><li>井戸からそれを吸引することにより固定液を取り出して、PBTwの3ミリリットルと交換してください。 1.5mlチューブに材料を移します。 Rハイブリダイゼーション緩衝液でPBTwをeplaceし、室温で5分間インキュベートする - 注意。 </li><li> RTでホットブロックにチューブを配置し、所望のハイブリダイゼーション温度に温度を設定。 注：ハイブリダイゼーション温度は、特定のプローブ、経験的に最適化する必要がある、しかし、我々は55°Cが最初に裁判に良好な温度であることがわかりました。ブロックは、ハイブリダイゼーション温度に来て、サンプルを約15分間プレハイブリダイズすることを可能にすることを可能にする（ すなわち、それがより長い、リボプローブを作製するのにかかる時間は必要ありません）。希釈されたリボプローブの十分な容量（通常100μl）を準備します。我々は最初の範囲として100および500 ng / mlでの、典型的には裁判プローブ濃度。私たちは12に従ってリボプローブを準備します。 </li><li>サンプルからのハイブリダイゼーション緩衝液を除去し、サンプルにハイブリダイゼーションバッファーにプローブを追加します。 100μlの（またはハイブリダイゼーションブフェ上記相を形成するのに十分な容量を持つオーバーレイR）鉱油。 注：鉱油は長いハイブリダイゼーション工程の間に形成する大規模な凝縮を防ぎます。豊富な結露を大幅にハイブリダイゼーション溶液の化学的性質およびプローブの濃度の両方が変更されます。 </li><li>所望のハイブリダイゼーション温度に熱を減らすその後、10分間75℃にサンプルを加熱することにより、プローブと標的RNAを変性させます。 （ - 48〜24時間）ハイブリダイゼーションは12時間（O / N）以上の最小のために進行させます。 </li><li>ハイブリダイゼーションの間に、ヒートブロックから単一の管を除去する油相を乱すことなく幼虫を中断し、親指と人差し指の間で急速にそれを回転させて、ヒートブロックでそれを交換してください。 12時間かそこら - この回6を繰り返します。 </li></ol> 4.ホットウォッシュと免疫注：私たちは、次の手順のために液体処理ロボットを使用していますが、これらも簡単に手動で行うことができます。この場合には、胚および幼生の笙それらがでハイブリダイズした1.5​​ミリリットルチューブ内に保持することULD。後続のすべてのソリューションの交換がP1,000ピペットで吸引し、追加されます。手動で行う場合は、次のステップの各々は、各溶液1mlを採用すべきです。 <ol><li> 4倍、2倍とハイブリダイゼーション温度に1×洗浄溶液の熱十分なボリューム（3ミリリットル各サンプルについて、それぞれ）。 </li><li>ハイブリダイゼーション温度で15分間ずつ、すべてのサンプルを4倍洗浄バッファーで3回洗浄します。ハイブリダイゼーション温度で15分間ずつ、すべてのサンプルを2回洗浄緩衝液で3回洗浄します。ハイブリダイゼーション温度で15分間ずつ、すべてのサンプルを1×洗浄バッファーで3回洗浄します。 </li><li>ハイブリダイゼーション温度で1×塩化ナトリウムクエン酸ナトリウム緩衝液+ 0.1％のTween（SSC + 0.1％のTween）で1回、すべてのサンプルを洗います。サンプルは室温まで冷却します。 </li><li> wはMABを繰り返しマレイン酸バッファー（MAB）この1×SSC溶液を交換して15分間、1×SSC + 0.1％Tween中で二度全てのサンプルを洗浄し、10分間放置灰。ブロック溶液でMABを交換し、1.5時間インキュベートします。 </li><li>抗体溶液（1：ブロック溶液中の抗体の10,000希釈）のブロックソリューションを交換し、穏やかに攪拌しながら室温で12時間（O / N）インキュベートします。 </li></ol> 5.色の開発と取り付け<ol><li>抗体溶液を吸引し、10分ごとにPBTwで15回洗浄します。 1xのアルカリホスファターゼバッファー（AP）とPBTwを交換し、10分間インキュベートします。 </li><li>注意-上記のインキュベーション工程が進行は、AP染色溶液を調製しながら（ 補助ファイル2を参照）。よくTCDに材料を移し、AP染色液で1×APソリューションを交換してください。時間の長さは、呈色反応を記録することができるために起こるようになりました時間に注意してください。シグナル対バックグラウンド比が最適になるまで染色パターンの開発を監視します。 </li><li>発色を停止するには、適切なワストに処分（1×AP染色溶液を除去電子コンテナ）、およびPBTwの2ミリリットルを適用し、現在の時間に注意してください。 5分間ずつ二回以上PBTwですすいでください。 1.5mlチューブに材料を転送するために、これらのリンスのいずれかを使用します。 </li><li> （これはまた、O / Nを行うことができます）PBTwを外し、PBTwで3.7％ホルムアルデヒドの1ミリリットルを適用し、攪拌または室温で少なくとも30分間回転させます。 </li><li> （適切な廃棄容器に廃棄物の固定剤を廃棄）PBTの3回の洗浄で固定液を洗浄します。脱イオン水に50℃でサンプルを3回洗浄します。 注：これらの洗浄は、清算および可視化工程の間に見えるようになるかもしれ塩の沈殿をなくします。 </li><li>ベンジルアルコール（BB：またマレーの明確なとして知られているBA）またはグリセロールサンプルは安息香酸ベンジルでマウントする必要があるかどうかを決定します。 注：私たちは、より強力な浄化剤BBを好む：L.としてBA stagnalis胚はやや不透明です。 BBに搭載されるサンプルは：BAは最初のエタノール系列で脱水する必要があります。試料は、60％に搭載されますグリセロールは、直ちに実装することができます。 </li><li>ピペットを用いて：マウントソリューション（BAまたは60％グリセロールBB）にサンプルを移します。 注：BBにマウントする場合：BAこれはよくガラスに（BBを：BAはポリカーボネートプラスチックを溶融する）行わなければなりません。 </li><li> 10分、その後、スペーサーとして積み重ねられたカバースリップの適切な数（サンプル&lt;1 DPFC、サンプル用の2カバースリップ&gt; 1 DPFC 1カバーガラス）を使用して、スライド上にそれらをマウントする - サンプルは5のためにクリアすることができます。 注記：全マウントは現在DIC光学系を有する化合物の顕微鏡を使用して画像化することができます。 </li></ol>

<ol>
	<li>Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+evolutionary+relationships+of+molluscs+with+phylogenomic+tools.">Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools.</a> Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).</li><li>Brusca, R. C., Brusca, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Invertebrates. , (2002).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis:+number+of+people+treated+in+2011.">Schistosomiasis: number of people treated in 2011.</a> Week. Epi. Rec. 88, 81-88 (2013).</li><li>Henry, J. Q., Collin, R., Perry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slipper+snail,+Crepidula.:+an+emerging+lophotrochozoan+model+system.">The slipper snail, Crepidula.: an emerging lophotrochozoan model system.</a> Biol. Bull. 218 (3), 211-229 (2010).</li><li>Perry, K. J., Henry, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+genome+modification+in+the+mollusc,+Crepidula+fornicata.">CRISPR/Cas9-mediated genome modification in the mollusc, Crepidula fornicata.</a> Genesis. 53 (2), 237-244 (2015).</li><li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+memory+storage:+a+dialog+between+genes+and+synapses.">The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses.</a> Bio. Rep. 24, 475-522 (2004).</li><li>Jackson, D. J., Ellemor, N., Degnan, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+gene+expression+with+larval+competence,+and+the+effect+of+age+and+parentage+on+metamorphosis+in+the+tropical+abalone+Haliotis+asinina.">Correlating gene expression with larval competence, and the effect of age and parentage on metamorphosis in the tropical abalone Haliotis asinina.</a> Mar. Biol. 147, 681-697 (2005).</li><li>Carter, C. J., Farrar, N., Carlone, R. L., Spencer, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+a+molluscan+RXR+and+evidence+for+its+novel,+nongenomic+role+in+growth+cone+guidance.">Developmental expression of a molluscan RXR and evidence for its novel, nongenomic role in growth cone guidance.</a> Dev. Biol. 343 (1-2), 124-137 (2010).</li><li>Rittschof, D., McClellan-Green, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molluscs+as+multidisciplinary+models+in+environment+toxicology.">Molluscs as multidisciplinary models in environment toxicology.</a> Mar. Pollut. Bull. 50 (4), 369-373 (2005).</li><li>Liu, M. M., Davey, J. W., Jackson, D. J., Blaxter, M. L., Davison, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+set+of+maternal+genes?+Insights+from+a+molluscan+transcriptome.">A conserved set of maternal genes? Insights from a molluscan transcriptome.</a> Int. J. Dev. Biol. 58 (6-8), 501-511 (2014).</li><li>Hohagen, J., Herlitze, I., Jackson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+whole+mount+in+situ.+hybridisation+protocol+for+the+mollusc+Lymnaea+stagnalis.">An optimised whole mount in situ. hybridisation protocol for the mollusc Lymnaea stagnalis.</a> BMC Dev. Biol. 15 (1), 19 (2015).</li><li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+egg+of+Limnaea+stagnalis.+L.+from+oviposition+till+first+cleavage.">The development of the egg of Limnaea stagnalis. L. from oviposition till first cleavage.</a> Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 91-121 (1946).</li><li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+egg+of+Limnaea+Stagnalis.+L.+from+the+first+cleavage+till+the+troghophore+stage,+with+special+reference+to+its'+chemical+embryology.">The development of the egg of Limnaea Stagnalis. L. from the first cleavage till the troghophore stage, with special reference to its' chemical embryology.</a> Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 353-434 (1946).</li><li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+in+Limnaea+stagnalis.+and+its+disturbance+by+lithium.">Morphogenesis in Limnaea stagnalis. and its disturbance by lithium.</a> J. Exp. Zool. 121 (1), 1-77 (1952).</li><li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+and+origin+of+the+cortical+morphogenetic+field+in+Limnaea.">The nature and origin of the cortical morphogenetic field in Limnaea.</a> Dev. Biol. 7, 130-143 (1963).</li><li>Morrill, J. B., Blair, C. A., Larsen, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulative+development+in+the+pulmonate+gastropod,+Lymnaea+palustris.,+as+determined+by+blastomere+deletion+experiments.">Regulative development in the pulmonate gastropod, Lymnaea palustris., as determined by blastomere deletion experiments.</a> J Exp Zool. 183 (1), (1973).</li><li>Van Den Biggelaar, J. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+the+phases+of+the+cell+cycle+during+the+period+of+asynchronous+division+up+to+the+49-cell+stage+in+Lymnaea.">Timing of the phases of the cell cycle during the period of asynchronous division up to the 49-cell stage in Lymnaea.</a> J. Emb. Exp. Morph. 26 (3), 367-391 (1971).</li><li>Verdonk, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+early+development+of+Lymnaea+stagnalis.">Gene expression in early development of Lymnaea stagnalis.</a> Dev. Biol. 35 (1), 29 (1973).</li><li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+Detection+of+Rna-Dna+Hybrid+Molecules+in+Cytological+Preparations.">Formation and Detection of Rna-Dna Hybrid Molecules in Cytological Preparations.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 63 (2), 378-383 (1969).</li><li>Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+engrailed+and+dpp+in+the+gastropod+Lymnaea+stagnalis.">Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis.</a> Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).</li><li>Shimizu, K., Sarashina, I., Kagi, H., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+functions+of+Dpp+in+gastropod+shell+formation+and+shell+coiling.">Possible functions of Dpp in gastropod shell formation and shell coiling.</a> Dev Genes Evol. 221 (2), 59-68 (2011).</li><li>Koop, D., Richards, G. S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+MAPK+signaling+in+patterning+and+establishing+axial+symmetry+in+the+gastropod+Haliotis+asinina.">The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina.</a> Dev. Biol. 311 (1), 200-212 (2007).</li><li>Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+Brachyury+in+the+mollusc+Patella+vulgata+suggests+a+conserved+role+in+the+establishment+of+the+AP+axis+in+Bilateria.">Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria.</a> Development. 129 (6), 1411-1421 (2002).</li><li>Jackson, D. J., W&#246;rheide, G., Degnan, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+expression+of+ancient+and+novel+molluscan+shell+genes+during+ecological+transitions.">Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions.</a> BMC Evol. Biol. 7 (1), 160 (2007).</li><li>Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+COE.+across+the+Metazoa+supports+a+conserved+role+in+neuronal+cell-type+specification+and+mesodermal+development.">Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development.</a> Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).</li><li>Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deployment+of+regulatory+genes+during+gastrulation+and+germ+layer+specification+in+a+model+spiralian+mollusc.">Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc.</a> Dev. Dyn. , (2015).</li><li>Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+engrailed+and+dpp+in+the+gastropod+Lymnaea+stagnalis.">Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis.</a> Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).</li><li>Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+asymmetric+expression+of+dpp+in+the+mantle+of+gastropods+correlates+with+asymmetric+shell+coiling.">Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling.</a> EvoDevo. 4 (1), 15 (2013).</li><li>Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancient+animal+microRNAs+and+the+evolution+of+tissue+identity.">Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity.</a> Nature. 463, (2010).</li><li>Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+triple+staining+method+for+double+in+situ+hybridization+in+combination+with+cell+lineage+tracing+in+whole-mount+Xenopus+embryos.">A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos.</a> Dev Growth Differ. 49 (8), 635-645 (2007).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems.">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev. Biol. 11 (1), 43 (2011).</li><li>Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+behaviour+in+Lymnaea+stagnalis.+pond+snails+is+a+maternally+inherited,+lateralized+trait.">Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait.</a> Biol. Lett. 5 (1), 20-22 (2009).</li><li>Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+blastomere+arrangement+dictates+zygotic+left-right+asymmetry+pathway+in+snails.">Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails.</a> Nature. 462 (7274), 790-794 (2009).</li><li>Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body+handedness+is+directed+by+genetically+determined+cytoskeletal+dynamics+in+the+early+embryo.">Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo.</a> Curr. Biol. 14 (16), 1462-1467 (2004).</li><li>Lu, T. Z., Feng, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sodium+leak+current+regulates+pacemaker+activity+of+adult+central+pattern+generator+neurons+in+Lymnaea+stagnalis.">A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis.</a> PLoS One. 6 (4), e18745 (2011).</li><li>Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Splicing+of+an+Invertebrate+Beta+Subunit+(LCav-beta)+in+the+N-Terminal+and+HOOK+Domains+and+Its+Regulation+of+LCav1+and+LCav2+Calcium+Channels.">Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels.</a> PLoS ONE. 9 (4), e92941 (2014).</li><li>Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+evolutionary+relationships+of+molluscs+with+phylogenomic+tools.">Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools.</a> Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).</li><li>Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+genome+size+databases.">Eukaryotic genome size databases.</a> Nuc. Acids. Res. 35 (Database issue), D332-D338 (2007).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここで説明する方法はモノアラガイstagnalisのすべての発達段階内で、おそらく様々な発現レベルを有するRNA転写物の効率的な可視化を可能にする。そのカプセルから胚および幼生を削除するには、我々は他のencapsulated-に対して報告化学物質、浸透圧ショックおよび物理的処理の様々な試用しましたモデル生物を開発。しかし、私たちの手の中に私たちがここで説明する方法は、...

軟体​​動物は、科学分野の幅広い多様性の持分を保有動物の群です。その形態的多様性1、（種数2の点で第のみ節足動物への）種の豊かさや商業3、医学4及び科学的問題5-8の広い範囲との関連性にもかかわらず、に主張することができ、比較的少数の軟体動物の種があります設備の整った科学的なモデルと実験室環境で維持しやすいの両方です。多くのそのような神経生物学9、生態毒性10、より最近では進化生物学11,12などの分野で使用されている一つの軟体動物は、主に、その広範な分布およびメンテナンスの極度の容易さのため、モノアラガイのstagnalisです。 「モデル」生物としての人気とLに利用できる発達生物学者13-19、分子ツールの範囲とパワーによる使用の長い歴史にもかかわらず、 stagnALIS科学コミュニティは、はるかに多くの伝統的な動物モデル（ ショウジョウバエ 、マウス、ウニ、線虫）の背後にあります。 分子モデルとしてモノアラガイを開発することが私たちの願いは、シェル形成を誘導する分子機構への関心から生じます。これはモノアラガイの発達中の遺伝子発現の、効率的で一貫性のある敏感な可視化を可能にする技術のセットを絞り込むために私たちの動機。 in situハイブリダイゼーションホールマウント（WMISH）が広くモデル生物のさまざまな使用され、40年以上20のために使用されてきました。その異なる装いで、ISHは空間的に染色体、リボソームRNA、mRNAおよびマイクロRNAは上の特定の遺伝子座をローカライズするために使用することができます。 私たちは前L.ためWMISH方法を精緻化に対処するために必要な課題の一つstagnalisは静かにかつ効率的に抽出する胚およびトンから様々な段階の幼虫の問題でした彼それらが積層された卵のカプセル。この抽出、または「脱カプセル化」は、同時に形態学的および細胞の完全性を維持しながら、 その場での実験で与えられるために十分な材料を収集するために効率的に達成する必要があります。他のモデル生物はまた、カプセル化された開発を受けている間、我々の手でこれらの種について報告された方法のいずれもが正常L.において使用することができませんでしたstagnalis。 この方法の全体的な目標は、したがって、次のとおりです。L.を抽出するために、イメージングのための十分なWMISHsignalsで胚および幼虫を準備するために、WMISH信号を最適化するプレハイブリダイゼーション処理を適用するために、ハイスループット様式でそのカプセルから胚および幼生をstagnalis。

<table><tbody><tr><td>Featherweight forceps</td><td>Ehlert &amp;amp; Partner</td><td>#4181119</td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing</td><td>Glasger&amp;auml;tebau OCHS GmbH</td><td>760070</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>Hilgenberg</td><td>1403547</td><td></td></tr><tr><td>12 well tissue culture dishes</td><td>Carl Roth</td><td>CE55.1</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>P733.1</td><td>CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed.</td></tr><tr><td>Ethylenediamine tetraacetic acid</td><td>Carl Roth</td><td>CN06.3</td><td>CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.1</td><td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll type 400</td><td>Carl Roth</td><td>CN90.1</td><td></td></tr><tr><td>polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40)</td><td>Carl Roth</td><td>4607.1</td><td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td></tr><tr><td>Nuclease freeBovine Serum Albumin</td><td>Carl Roth</td><td>8895.1</td><td></td></tr><tr><td>Salmon sperm</td><td>Carl Roth</td><td>5434.2</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Carl Roth</td><td>7692.1</td><td>CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH</td></tr><tr><td>Proteinase-K</td><td>Carl Roth</td><td>7528.1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth</td><td>3790.2</td><td></td></tr><tr><td>Deionised formamide</td><td>Carl Roth</td><td>P040.1</td><td>CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.</td></tr><tr><td>Standard formamide</td><td>Carl Roth</td><td>6749.3</td><td>CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.</td></tr><tr><td>Triethanolamine</td><td>Carl Roth</td><td>6300.1</td><td>CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling.</td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Carl Roth</td><td>4483.1</td><td>CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT</td></tr><tr><td>Maleic acid</td><td>Carl Roth</td><td>K304.2</td><td>CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin.</td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Sigma</td><td>B6630-250ML</td><td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed.</td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>10,800-6</td><td>CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Carl Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Blocking powder</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti DIG Fab fragments AP conjugated</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Carl Roth</td><td>9090.3</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>4421.3</td><td>CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes.</td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate</td><td>Carl Roth</td><td>A155.3</td><td>CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>N-acetyl cysteine</td><td>Carl Roth</td><td>4126.1</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Carl Roth</td><td>6908.1</td><td>CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.</td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S</td><td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.3</td><td>CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation.</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Carl Roth</td><td>4984.1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Tri sodium citrate dihydrate (C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Carl Roth</td><td>3580.1</td><td>CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.</td></tr><tr><td>Mineral oil&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>HP50.2</td><td></td></tr><tr><td>InSituPro-Vsi&amp;nbsp;</td><td>Intavis</td><td></td><td>www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc</td></tr></tbody></table>

a whole mount in situ hybridization method for the gastropod mollusc lymnaea stagnalis

in situハイブリダイゼーション（WMISH） で全体のマウント興味のある（例えば、胚または幼虫など）「ホールマウント」組織標本、または発達段階内の核酸分子（多くの場合のmRNA）の空間分解能を可能にする技術です。それはかなり複雑な後生動物ゲノムの機能解析、次世代シーケンスデータの大洪水でボトルネックをより多くなってきている課題に貢献することができるので、WMISHは非常に強力です。技術に多くの時間の概​​念シンプルさにもかかわらず、多くの場合、新たなモデル系のためのWMISH実験に固有の様々なパラメータを最適化するために必要とされます。組織型と発達段階の間の細胞および生化学的特性の微妙な違いは、単一WMISH方法がすべての状況に適切ではないかもしれないことを意味します。我々は一貫生成し、再新興腹足類モデルモノアラガイのstagnalisためWMISHメソッドのセットを開発しています遺伝子の、およびすべての発達段階全体の範囲について明確なWMISH信号。これらの方法は、個体発生のウィンドウに未知の暦年齢の幼虫の割り当て、それらの卵のカプセルからの胚および幼生の効率的な除去、各個体発生のウィンドウのための適切なプロテイナーゼK処理の適用、およびハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション後および免疫検出、ステップ。これらのメソッドは、指定されたRNA転写物について得られた信号は、プローブ固有の調整（主にプローブ濃度及びハイブリダイゼーション温度）でさらに洗練することができ、そこから基盤を提供します。

図3に示される代表的なWMISH染色パターンは、上述の技術を用いて生成され、分子のシェルの形成に至るまでの処理（ 新規遺伝子1、2、3、4）の範囲に関与する遺伝子のための空間的な発現パターンの多様性を反映し、細胞間シグナル伝達（DPP）への発達段階の範囲にわたって転写調節（ ブラキュリ ）へ。一方で我々は、我々の...

Watch this Scientific Journal Video about A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis at JoVE.com

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

全体のマウント<em&gt;その場で</em腹足類軟体動物のための&gt;ハイブリダイゼーション法<em&gt;モノアラガイstagnalis</em

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

a-whole-mount-situ-hybridization-method-for-gastropod-mollusc-lymnaea

Research

JoVE Journal

Biology

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

8.7K ビュー.  Georg-August University of Göttingen. The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

ビデオ: A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American lobsters. Recent work in exploited crustacean populations (crabs and lobsters) suggests that there are circumstances where mature females are unable to achieve their full reproductive potential due to sperm limitation. To examine this possibility in different regions of the American lobster fishery, a reliable and noninvasive method was developed for sampling large numbers of female lobsters at sea. This method involves inserting a blunt-tipped needle into the female&#39;s seminal receptacle to determine the presence or absence of a sperm plug and to withdraw a sample that can be examined for the presence of sperm. A series of control studies were conducted at the dock and in the laboratory to test the reliability of this technique. These efforts entailed sampling 294 female lobsters to confirm that the presence of a sperm plug was a reliable indicator of sperm within the receptacle and thus, mating. This paper details the methodology and the results obtained from a subset of the total females sampled. Of the 230 female lobsters sampled from George&#39;s Bank and Cape Ann, MA (size range = 71-145 mm in carapace length), 90.3% were positive for sperm. Potential explanations for the absence of sperm in some females include: immaturity (lack of physiological maturity), breakdown of the sperm plug after being used to fertilize a clutch of eggs, and lack of mating activity. The surveys indicate that this technique for examining the mating success of female lobsters is a reliable proxy that can be used in the field to document reproductive activity in natural populations.

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters Homarus americanus

Fishery-induced changes to exploited crustacean fisheries, such as the American lobster fishery, could potentially influence their reproductive dynamics, leading to a reduction in mating success. This study&#39;s goal was to develop a noninvasive method for ascertaining the mating success of female lobsters that may be physiologically or functionally mature.

非侵襲的方法<em&gt;その場で</em&gt;女性アメリカンロブスターにおける交配の成功（の決定<em&gt;ロブスターのamericanus</em&gt;）

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American ...

環境学

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination1,2, cellular identification and gene expression3,4, monitoring viral multiplication in infected cells5, and bacterial community analysis and enumeration6.
Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (Tm) of these analogs for natural nucleic acids7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA12 and viral RNA in mammalian cells5.
Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes13. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

A novel high-throughput method is described that enables the detection and relative quantitation of small RNA and mRNA expression from single bacterial cells using locked nucleic acid probes and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization.

ロックされた核酸のフローサイトメトリー、蛍光その場でハイブリダイゼーション（LNAフロー- FISH）：細菌のsmall RNAの検出のための方法

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

免疫・感染学

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of genes. Prior research into this emerging model system capitalized on comprehensive genome-wide investigations that have identified numerous quantitative trait loci (QTL) associated with various cave-associated phenotypes. However, the ability to connect genes of interest to the heritable basis for phenotypic change remains a significant challenge. One technique that can facilitate deeper understanding of the role of development in troglomorphic evolution is whole-mount in situ hybridization. This technique can be implemented to directly compare gene expression between cave- and surface-dwelling forms, nominate candidate genes underlying established QTL, identify genes of interest from next-generation sequencing studies, or develop other discovery-based approaches. In this report, we present a simple protocol, supported by a flexible checklist, that can be widely adapted for use well beyond the presented study system. It is hoped that this protocol can serve as a broad resource for the Astyanax community and beyond.

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

This protocol enables visualization of gene expression in embryonic Astyanax cavefish. This approach has been developed with the goal of maximizing gene expression signal, while minimizing non-specific background staining.

In Situ ハイブリダイゼーションアステュアナクス胚の Wholemount

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

発生生物学

Spatial High-resolution Analysis of Gene Expression Levels in Tendons

In recent years, many protocols have been developed for high-resolution transcriptomics in many different medical and biology fields. However, matrix-rich tissues, and specifically, tendons were left behind due to their low cell number, low RNA amount per cell, and high matrix content, which made them complicated to analyze. One of the recent and most important single-cell tools is the spatial analysis of gene expression levels in tendons. These RNA spatial tools have specifically high importance in tendons to locate specific cells of new and unknown populations, validate single-cell RNA-seq results, and add histological context to the single-cell RNA-seq data. These new methods will enable the analysis of RNA in cells with exceptional sensitivity and the detection of single-molecule RNA targets at the single-cell level, which will help to molecularly characterize tendons and promote tendon research. 
In this method paper, we will focus on the available methods to analyze spatial gene expression levels on histological sections by using novel in situ hybridization assays to detect target RNA within intact cells at single-cell levels. First, we will focus on how to prepare the tendon tissue for the different available assays and how to amplify target-specific signals without background noise but with high sensitivity and high specificity. Then, the paper will describe specific permeabilization methods, the different probe designs, and the signal amplification strategies currently available. These unique methods of analyzing transcription levels of different genes in single-cell resolution will enable the identification and characterization of the tendon tissue cells in young and aged populations of various animal models and human tendon tissues. This method will also help analyze gene expression levels in other matrix-rich tissues such as bones, cartilage, and ligaments.

This article describes how to perform an optimized in situ protocol for tendons. This method discusses tissue preparation, section permeabilization, probe design, and signal amplification methods.

In recent years, many protocols have been developed for high-resolution transcriptomics in many different medical and biology fields. However, matrix-rich ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

全体のマウント<em&gt;上皮内</emE11.5マウス胚へのE8.5&gt;ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

生物学

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male urethra, which relies on androgenic signals and epithelial-mesenchymal interactions1,2. Understanding the molecular mechanisms responsible for prostate development may reveal growth mechanisms that are inappropriately reawakened later in life to give rise to prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer.
The developing LUT is anatomically complex. By the time prostatic budding begins on 16.5 days post conception (dpc), numerous cell types are present. Vasculature, nerves and smooth muscle reside within the mesenchymal stroma3. This stroma surrounds a multilayered epithelium and gives rise to the fetal prostate through androgen receptor-dependent paracrine signals4. The identity of the stromal androgen receptor-responsive genes required for prostate development and the mechanism by which prostate ductal epithelium forms in response to these genes is not fully understood. The ability to precisely identify cell types and localize expression of specific factors within them is imperative to further understand prostate development. In situ hybridization (ISH) allows for localization of mRNAs within a tissue. Thus, this method can be used to identify pattern and timing of expression of signaling molecules and their receptors, thereby elucidating potential prostate developmental regulators.
Here, we describe a high throughput ISH technique to identify mRNA expression patterns in the fetal mouse LUT using vibrating microtome-cut sections. This method offers several advantages over other ISH protocols. Performing ISH on thin sections adhered to a slide is technically difficult; cryosections frequently have poor structural quality while both cryosections and paraffin sections often result in weak signal resolution. Performing ISH on whole mount tissues can result in probe trapping. In contrast, our high throughput technique utilizes thick-cut sections that reveal detailed tissue architecture. Modified microfuge tubes allow easy handling of sections during the ISH procedure. A maximum of 4 mRNA transcripts can be screened from a single 17.5dpc LUT with up to 24 mRNA transcripts detected in a single run, thereby reducing cost and maximizing efficiency. This method allows multiple treatment groups to be processed identically and as a single unit, thereby removing any bias for interpreting data. Most pertinently for prostate researchers, this method provides a spatial and temporal location of low and high abundance mRNA transcripts in the fetal mouse urethra that gives rise to the prostate ductal network.

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Here, we describe an efficient high throughput in situ hybridization (ISH) method for visualizing patterns of mRNA expression in developing fetal mouse prostate tissue sections. The method can be easily adapted to visualize mRNA expression patterns in other mouse tissues or in tissues from other species.

ハイスループットその場で</em胎児マウス下部尿生殖路のmRNAの発現パターンを特徴づける>ハイブリダイゼーション法

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNAを<em&gt;その場</emホールマウント胚および細胞組織学で&gt;ハイブリダイゼーションは、海洋軟骨魚類に適合した

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and activating sperm, the components in the seminal fluid can also influence female physiology to augment fertilization success of the sperm donor. While many studies have reported such effects in species with separate sexes, few studies have addressed this in simultaneously hermaphroditic animals. This video protocol presents a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using a simultaneously hermaphroditic freshwater snail, the great pond snail Lymnaea stagnalis, as model organism. While the procedure is shown using complete prostate gland extracts, individual components (i.e., proteins, peptides, and other compounds) of the seminal fluid can be tested in the same way. Effects of the receipt of ejaculate components on egg laying can be quantified in terms of frequency of egg laying and more subtle estimates of female reproductive performance such as egg numbers within each egg masses. Results show that seminal fluid proteins affect female reproductive output in this simultaneous hermaphrodite, highlighting their importance for sexual selection.

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

腹足類軟体動物に産卵に男性付属腺製品の効果

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. The sipunculid worm Sipunculus nudus is a crucial fishery resource as it has high nutritional and medicinal values. Currently, the research on the molecular biology of Sipunculus nudus is still in its infancy. The purpose of this article is to develop a sensitive method for localizing specific mRNA in Sipunculus nudus coelomic fluid. The protocol includes detailed steps of ISH, including digoxigenin-labeled antisense and sense riboprobe preparation, coelomic fluid collection and section preparation, specific riboprobe hybridization, antibody incubation, coloration and post-coloration treatments. The representative results obtained from a successful experiment using this method are demonstrated. The protocol should be applicable to other Sipuncula species as well.

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

This protocol describes an effective in situ hybridization approach to detect the mRNA expression levels and spatial patterns of target genes in Sipunculus nudus coelomic fluid.

シチュヌチュ・ニュードゥス・コロミック流体のハイブリダイゼーションで

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective transmission among host rice. Laodelphax striatellus (small brown planthopper, SBPH) is the primary insect vector that horizontally transmits RSV while sucking sap from the phloem. Saliva plays a significant role in insects' feeding behavior. A convenient method that will be useful for research on insects' saliva with piercing-sucking feeding behavior is described here. In this method, insects were allowed to feed on an artificial diet sandwiched between two stretched paraffin film layers. The diet containing the saliva was collected each day, filtered, and concentrated for further analysis. Finally, the quality of collected saliva was examined by protein staining and immunoblotting. This method was exemplified by detecting the presence of RSV and a mucin-like protein in the saliva of SBPH. These artificial feeding and saliva collection method will lay a foundation for further research on factors in insect saliva related to feeding behavior and virus transmission.

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

The present protocol describes a method to collect sufficient saliva from piercing-sucking insects using an artificial medium. This is a convenient method for collecting insect saliva and studying salivary function on insect feeding behavior and vector-borne virus transmission.

全体のマウント

要約

さらに動画を探す

この動画の章

非侵襲的方法

ロックされた核酸のフローサイトメトリー、蛍光その場でハイブリダイゼーション（LNAフロー- FISH）：細菌のsmall RNAの検出のための方法

In Situ ハイブリダイゼーションアステュアナクス胚の Wholemount

Spatial High-resolution Analysis of Gene Expression Levels in Tendons

全体のマウント

ハイスループットその場でハイブリダイゼーション法

RNAを

腹足類軟体動物に産卵に男性付属腺製品の効果

シチュヌチュ・ニュードゥス・コロミック流体のハイブリダイゼーションで

ラオデルファクス・ストリアテルス・サリヴァコレクション用2層膜サンドイッチ法