私は私の研究室で働いており、これらのプロトコルの進化に貢献してきた多くの学部学生に感謝したいと思います。 NATはスキッドモア·ユニオン·ネットワーク、助成金を支払ったNSFの進歩により確立されたプロジェクトからの支持を受けています。

海洋軟骨魚類におけるin situハイブリダイゼーション I. RNAのホールマウント 1。胚の固定と準備<ol><li>スケート胚はバラード7に従ってステージングできます。遺伝子発現の検出のための最適な段階は、関心のある組織に依存します。スケートの消化管における遺伝子発現を追跡するには、ステージが27から30まで7最適です。 </li><li>卵黄嚢から胚を分離し、PBSに胚を解剖する。 </li><li> 4℃で50 mlコニカルチューブ℃の穏やか揺らしながらで作りたて4％パラホルムアルデヒド（PFA）30mlに修正しました。 24時間を修正しました。 </li><li>室温で回転し、15分間ずつ2回、PBTで胚を洗浄します。 現場の中の RNA全体のマウント用のすべてのソリューションレシピは（ 表1）が含まれています。 </li><li>室温でのPBTロッキング：25％、50％および75％メタノールメタノールシリーズで洗浄することにより、胚を脱水する。洗浄の持続時間は、胚の段階に依存します。プリnのeurulationは、胚を上演し、メタノールシリーズの各洗浄の5分で十分です。ステージ30歳以上の胚については、洗浄は30分まで持続できる。胚が十分に浸透し、各洗浄に順応しているかどうかを判断するには、あなたの手で直立管を保持します。胚はチューブの底に沈む場合は、次の洗浄のための準備が整いました。胚は、ソリューションの最上部に浮遊する場合は、ソリューションを変更し、その特定の脱水工程を繰り返します。 </li><li>優しく揺れて10分間、100％メタノールで2回洗浄する。 </li><li> 100％メタノールに一度脱水し、胚はプロトコルに進む前に、少なくとも24時間、-20℃で保存してください。胚は正常に-20℃で保存し、最長1年間、RNA全体のマウントに使用されている。 </li></ol> 2。 RNAプローブの合成<ol><li>発現検出したい遺伝子の線形フラグメントを生成します。これは、PCR増幅したり、遺伝子とプラスミドを線形化することによって行うことができます興味のある。 PCRにより増幅するために、その結​​合部位は脇腹遺伝子が増幅された領域でRNAポリメラーゼ結合部位を挿入して保持するプライマーを選択します。例えば、PBSまたはたpGEM、M15フォワードおよびリバースプライマーとして一般的に使用されるプラスミドに理想的です。あるいは、遺伝子の5 &#39;末端で切断する酵素でキアゲンミニプレップDNAの15μlを消化することにより、プラスミドを線形化します。ゲル抽出し、適切なをQIAquickキットを使用して精製する。 </li><li>適切なRNAポリメラーゼ（転写反応については、 表2を参照） を使用して、テンプレートとしてPCR産物の線状プラスミドまたは100 ngの8μlを用いてRNAプローブを逆転写。 </li><li> 37℃で2時間逆転写反応℃でインキュベート</li><li>反応を確認するために、1％アガロース/ TAEゲル上の転写反応液1μlを実行します。色素がちょうどゲルに実行されるまで100 mVoltsでゲルを実行します。シングル著名なバンドが見えるはずです。直鎖状DNAテンプレートのフラグメントは、より高いmolecuでかすかに見えるかもしれませんLAR重量。 </li><li> 15分間37℃で転写反応とインキュベートするRNaseフリーDNアーゼIの1μlを添加する。 </li><li>沈殿物に、少なくとも60分または一晩-20℃で100μlのTE pHを8、10μlの4 M LiClを、300μlの100％EtOHを、インキュベートを追加します。 </li><li> 14,000 rpmで4℃フュージで10分間スピン。 </li><li> 70パーセントEtOHと乾燥した空気でペレットを洗浄します。 </li><li>のdH 2 O20μlに再懸濁し、RNAプローブハイブリダイゼーション緩衝液80μlの（ハイブリダイゼーション緩衝液を70℃に予め温めなければならない）を追加します。プローブは-80℃-20℃以上℃で数ヶ月間、80％のハイブリダイゼーションバッファーに格納することができます</li></ol> 3。胚前処理およびハイブリダイゼーション<ol><li> -20℃から100％メタノールに格納されている胚を取り除く若い胚の段階（3.2）に進みます。後で胚（ステージ30分の29 &lt;）を上演するためには、胚の体から &#39;持ち上げ&#39;した表皮層が表示される場合があります。顕微鏡下で、慎重にディスプローブの浸透を最大にするために表皮層をオフにECT。 </li><li>きれいなガラスシンチレーションバイアル中に胚を置きます。上記の記述逆メタノールシリーズの胚を再水和：（75％、50％、25％メタノール：PBT）を室温で5〜30分ごとに穏やかに、各溶液を揺動することによって。 10分ごとに、PBTの2回の洗浄、優しく揺れとの完全な水分補給。 </li><li>ロッキング、室温で1時間、PBTで6％の過酸化水素と任意の顔料、漂白剤の胚を削除します。 </li><li> PBT樹脂、（室温で揺らし、10分ずつ）で3回洗浄することにより、過酸化水素を除去。 </li><li>ハイブリダイゼーション中のプローブの浸透を可能にするためにプロテイナーゼKで胚を扱う。プロテイナーゼKの量と治療期間は、調べたい組織および胚の年齢により異なります。深部組織と年上の胚は、より高濃度と長期の治療を必要としながらティムより表面組織と若い胚は、短く、少なくプロテイナーゼKを必要とする完全にプローブハイブリダイゼーションのために胚を透過する電子。例えば、ステージ29のスケート胚の腸内胚葉にShhのを検出するために、プロテイナーゼK / PBTの30μg/ mlのを室温で20分間インキュベートする。 </li><li>迅速プロテイナーゼKを洗い流すPBTで胚をすすぐ</li><li>優しく揺らし、20分間PBTで4％PFA、0.2％グルタルアルデヒドでプロテイナーゼK、postfixの胚を失活させた。 </li><li> PBTで10分間2回洗浄する。 </li><li><ol class="lalpha"><li>プレハイブリダイゼーションのために、それらをカバーするだけの十分な胚に予熱したハイブリダイゼーション溶液を2-3 mlを加える。 1時間70℃で加熱した水浴中で穏やかに揺らし。 </li><li> ℃で10分間、氷上でクール用の70にハイブリダイゼーション溶液、予熱RNAプローブを調製した。 0.5から1.0μg/ mlの最終濃度を得るために、新鮮な予熱したハイブリダイゼーション溶液2mlにRNAプローブの15〜20μlを希釈します。プリhybe取り外し、胚に希釈したRNAプローブを追加します。胚はちょうどソリューションによってカバーされるべきであり、DDよりハイブリダイゼーション溶液、必要に応じて。シンチレーションバイアルの蓋をしっかりと安全。 70℃で一晩加熱水浴中で優しく揺れによってハイブリダイズする。 </li></ol></li></ol> 4。ハイブリダイゼーション洗浄および抗体ハイブリダイゼーションを投稿<ol><li>新鮮なシンチレーションバイアルまたはエッペンドルフチュー​​ブ内胚および場所からのプローブとのハイブリダイゼーション溶液を除去します。プローブは-20℃で保存し、将来的に再利用することができます。ハイブリダイゼーション後の洗浄については、Netwe​​llで開催胚は6ウェル組織培養プレートに固定してください。 </li><li> 70℃ロッキングあらかじめ温めておいた解決策＃1、℃で30分間ずつ3回洗浄する</li><li> 70℃ロッキングあらかじめ温めておいたソリューション＃2、℃で30分間ずつ3回洗浄する</li><li>室温でロッキングTBSTで5分間それぞれに対して、3回洗浄する。 </li><li>室温でロッキング1時間TBSTで10％の熱不活性化ヒツジ血清との事前ブロック。 </li><li> Netwe​​llから新鮮なガラスシンチレーションバイアルに胚を移します。抗DIG追加胚から1％熱不活性化ヒツジ血清/ TBST中のFab断片（1:5,000）。 4℃で一晩揺する</li></ol> 5。ポスト抗体のハイブリダイゼーションの洗浄<ol><li>抗体を取り外して廃棄します。洗浄のために戻ってNetwe​​llに胚を置きます。 </li><li>室温で揺らし、TBSTで5分間ずつ3回洗浄する</li><li>室温で揺れ、1時間ごとに少なくとも6回洗浄する。 </li><li> 4℃で揺らし、TBSTで一晩洗うポスト抗体の洗浄は、バックグラウンド染色を削減する手助けとして、洗浄の回数と期間を最大にすることが望ましい。胚は、日常的に、週末に、4℃TBSTで洗浄する。 </li></ol> 6。プローブの検出<ol><li>新鮮NTMTソリューションを構成すると殺菌フィルタ。 </li><li>きれいなガラスシンチレーションバイアル中TBSTで洗浄溶液と場所の胚を破棄します。室温、ロッキングで10分間ずつ新鮮NTMTで胚を3回洗浄します。 </li><li> NTMTが反応混合物を洗い、追加、削除の1つのx NTMTでNBT / BCIP×1。これらの反応は、光に敏感であるため、室温で箔と岩のシンチレーションバイアルをカバーしています。 </li><li>所望の遺伝子発現がはっきりと見えるようになるまで色反応を15分ごとに監視します。強力なプローブが開発し、わずか10分かかる場合があります。弱いプローブは、1〜2時間かかる場合があります。 （全胚が鈍い紫や茶色の色を回すために開始されます）表示され始めます反応が長すぎるか、またはバックグラウンド染色のために行かせていない。 </li><li>室温、ロッキングでPBTで10分間ずつ2回洗浄する。 </li><li> 4％パラホルムアルデヒドでPostfixの胚を、室温で1時間0.1％グルタルアルデヒド。胚は4℃で固定で無期限店することができます</li><li>解剖顕微鏡で胚を視覚化します。プリハードン1％アガロース/ PBSでシャーレ内の写真、場所胚の水色の背景を生成します。 </li></ol> 7。海洋軟骨魚類におけるin situハイブリダイゼーション I. RNAのホールマウントするための代表的な結果スケート胚におけるソニックヘッジホッグ（Shh）とHoxa13の in situの描いた表現における RNA全体のマウントは、 図1に示されている。高等脊椎動物におけるShhの発現は脊索と腸内胚葉で発見されており、この発現パターンは、スケート（ 図1a）8,9に保存されている。海洋軟骨魚類は塩を分泌するように直腸腺を使用浸透圧調節のユニークな方法を持っています。Hoxa13式が開発直腸腺（ 図1b）10で高い。パターニングにおけるHoxa13遺伝子産物の役割直腸腺は不明のままです。 Ⅱ。軟骨魚類の組織を埋め込むとパラフィン切片 1。ティッシュの収穫と準備<ol><li>所望の組織を解剖し、室温で揺らし、24から48時間、10％ホルマリンで固定してください。 4％パラホルムアルデヒド（PFA）も固定剤として使用することができます（説明を参照）。 </li><li> 30分ごとに、PBSで3回洗浄することにより、固定液を洗い流す。組織の規模に応じて、洗浄時間は10分に減少させることができるか、または1時間に増加した。 </li><li>室温でPBSロッキング：25％、50％および75％エタノールのエタノールシリーズで洗浄することにより、胚を脱水する。繰り返しになりますが、各洗浄のための時間は、組織の大きさに依存します。 0.5センチメートル3組織については、15分間各洗浄インキュベートする。大きな部分の時間を増やす。組織の長期保存が必要な場合は、最長1年までは、-20°Cで75％エタノールとストアに追加の2回洗浄する。そうでなければ次のステップに進みます。 </li><li>さらに揺らし、15分ごとに100％エタノールで3回洗浄することにより脱水する。 </li></ol> 2。埋め込みとパラフィン切片<ol><li>スクリューキャップの蓋付きガラスシンチレーションバイアルに5分間ずつキシレンで2回洗浄することによって組織を明確にする。キシレンは、組織がもろくレンダリングされ、そのようになったため、10分の合計を超えていないHESの。あなたが光にそれを保持するときに組織が半透明になっているはずです。組織が2回洗浄した後も非常に不透明である場合、プロトコルに進み、5分間キシレンに追加の洗浄を行うと。手袋をヒュームフード内キシレンのみを扱う。 </li><li>キシレンを除去し、溶融パラフィンで2月3日フルシンチレーションバイアルを埋める。 30分間、60℃のオーブン中でインキュベートする。バイアルにパラフィンを入れたら、パラフィン、バイアルの側面に沿って固めることがわかります。オーブン内にバイアルを置き、パラフィンが数分間再溶解することができます。オーブンからバイアルを取り出し、その溶液をインキュベーションの残りのためのオーブンで混ぜると交換するクイック渦を与える。 </li><li>パラフィンのインキュベーションを30分間2回繰り返します。 </li><li>時間ごとに倍パラフィンでインキュベートする。パラフィンの最終時間を変更して、60℃のオーブンで一晩インキュベートする。 </li><li>次の日、2〜3時間真空下で加熱されたパラフィン浴室及び場所に組織を置く。これは、組織の中にパラフィンの浸透を容易にし、気泡を除去します。薄い組織のタイプによっては、真空工程が必要とされないかもしれないが、それは全体の胚または消化管および管腔の区画を持つ他の臓器のために必要である。 </li><li>後、氷板の上に溶けたパラフィンで金型の組織、場所の組織の浸潤、およびクール真空促進。金型から組織を除去しようとする前に氷上または4℃で一晩にしておきます。組織のパラフィンブロックは、4℃で無期限に保存することができます</li><li>場所はパラフィンミクロトーム上にブロックと8μmの切片を切った。セクションは、48℃に加熱した水浴に浮かべ、ガラスSuperfrost * Plusのスライドにマウントする必要があります。 </li><li> 37℃のオーブンで一晩乾燥したスライド。 </li><li>必要に応じ°Cまで4で保存セクション。 </li></ol> Ⅲ。アルシアンブルー/核ファーストレッドは軟骨魚類の組織の染色 1。アルシアンブルーは、ムチンのために染色<ol><li>場所は暖かいスライド上に上向きにセクションと摺動する。 45分間溶融。 </li><li>スライドホルダーにス​​ライドを配置します。すべての後件ソリューションはヒュームフード内桶に含まれています。スライドは別の解決策と1浴槽からそれらを転送することにより洗浄する。浴槽内の溶液濃度はスライドをカバーしていることを確認し、スライド上の組織が完全に水没しています。 5分ごとにキシレン中でスライドを2回洗浄することによりパラフィンを溶かす。 </li><li> 1分ごとに100％エタノールでスライドを2回洗浄します。 </li><li> 1分間、各溶液中で洗浄エタノール系列（75％、50％、25％エタノール）でスライドを再水和する。 1分間のdH 2 Oで洗浄します。 </li><li> 15分間シアンブルー溶液、pH 2.5で染色。 </li><li> 3分間流水で洗浄することにより染色を開発する。のdH 2 Oに一度浸し</li><li> 10分間核ファーストレッド対比染色液に対比。 </li><li> dH 2 Oで1時間に3分間浸漬し、水道水の流水で洗ってください。 </li><li> Dehy20ディップそれぞれ、または1分ごとにエタノール系列（25％、50％、75％、100％、100％）でdrate。 5分間ずつキシレンで2回洗浄する。 DPX封入剤とカバーグラスでマウントします。スライドを操作する前に、ドラフト内で48時間乾燥して硬化するためにメディアをマウントすることができます。 </li></ol>

<ol>
	<li>Forester, R., Goldstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+osmoregulatory+role+of+amino+acids+and+urea+in+marine+elasmobranchs.">Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranchs.</a> Am. J. Physiol. 230, 925-931 (1976).</li><li>Shuttleworth, T., Shuttleworth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physiology of elasmobranch fishes. , 171-194 (1988).</li><li>Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand, S. C., Bowlus, R. D., Somero, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+with+water+stress:+evolution+of+osmolyte+systems.">Living with water stress: evolution of osmolyte systems.</a> Science. 217, 1214-1222 (1982).</li><li>Ballatori, N., Villalobos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+molecular+and+cellular+basis+of+toxicity+using+comparative+models.">Defining the molecular and cellular basis of toxicity using comparative models.</a> Toxicl. Appl. Pharmacol. 183, 207-220 (2002).</li><li>Nieto, M. A., Patel, K., Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+analysis+of+chick+embryos+in+whole+mount+and+tissue+sections.">In situ hybridization analysis of chick embryos in whole mount and tissue sections.</a> Methods Cell Biol. 51, 219-235 (1996).</li><li>Jass, J. R., Walsh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mucin+expression+in+the+gastrointestinal+tract:+a+review.">Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a review.</a> J Cell Mol Med. 5, 327-351 (2001).</li><li>Ballard, W. W., Mellinger, J., Lechenault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+for+development+of+Scyliorhinus+canicula,+the+lesser+spotted+dogfish+(Chondrichthyes;+Scyliorhinidae).">A series of normal stages for development of Scyliorhinus canicula, the lesser spotted dogfish (Chondrichthyes; Scyliorhinidae).</a> J. Exp. Zool. 267, 318-336 (1993).</li><li>Echelard, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog,+a+member+of+a+family+of+putative+signaling+molecules,+is+implicated+in+the+regulation+of+CNS+polarity.">Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity.</a> Cell. 75, 1417-1430 (1993).</li><li>Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA.">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75, 1401-1416 (1993).</li><li>Theodosiou, N. A., Hall, D. A., Jowdry, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+acid+mucin+goblet+cell+distribution+and+Hox13+expression+patterns+in+the+developing+vertebrate+digestive+tract.">Comparison of acid mucin goblet cell distribution and Hox13 expression patterns in the developing vertebrate digestive tract.</a> J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 442-453 (2007).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+7.">Ch. 7.</a> Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 1, 7.82 (2001).</li><li>Zhang, G., Miyamoto, M. M., Cohn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamprey+type+II+collagen+and+Sox9+reveal+an+ancient+origin+of+the+vertebrate+collagenous+skeleton.">Lamprey type II collagen and Sox9 reveal an ancient origin of the vertebrate collagenous skeleton.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3180-3185 (2006).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li><li>Theodosiou, N. A., Simeone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+rudimentary+colon+in+the+elasmobranch,+Leucoraja+erinacea.">Evidence of a rudimentary colon in the elasmobranch, Leucoraja erinacea.</a> Dev. Genes Evol. 222, 237-243 (2012).</li><li>Filipe, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucins+in+the+human+gastrointestinal+epithelium:+a+review.">Mucins in the human gastrointestinal epithelium: a review.</a> Invest. Cell Pathol. 2, 195-216 (1979).</li><li>Corfield, A. P., Wagner, S. A., Clamp, J. R., Kriaris, M. S., Hoskins, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin+degradation+in+the+human+colon:+production+of+sialidase,+sialate+O-acetylesterase,+N-acetylneuraminate+lyase,+arylesterase,+and+glycosulfatase+activities+by+strains+of+fecal+bacteria.">Mucin degradation in the human colon: production of sialidase, sialate O-acetylesterase, N-acetylneuraminate lyase, arylesterase, and glycosulfatase activities by strains of fecal bacteria.</a> Infect. Immun. 60, 3971-3978 (1992).</li><li>Reid, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+and+histological+progression+to+malignancy+in+Barrett's+esophagus:+prospective+endoscopic+surveillance+of+a+cohort.">Flow-cytometric and histological progression to malignancy in Barrett's esophagus: prospective endoscopic surveillance of a cohort.</a> Gastroenterology. 102, 1212-1219 (1992).</li><li>Mowry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+staining+of+pancreatic+beta-cell+granules.+Evolution+and+present+status.">Selective staining of pancreatic beta-cell granules. Evolution and present status.</a> Arch. Pathol. Lab Med. 107, 464-468 (1983).</li><li>Roberts, D. J., Smith, D. M., Goff, D. J., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+signaling+during+the+regionalization+of+the+chick+gut.">Epithelial-mesenchymal signaling during the regionalization of the chick gut.</a> Development. 125, 2791-2801 (1998).</li></ol>

私は、開示することは何もありません。

提示されたプロトコルは、遺伝子発現をモニターし、分化した細胞型を同定するための古典的な方法である、海洋軟骨魚類での使用に適合されています。これらのプロトコルのさらなる修正が異なる軟骨魚類の種に適応するために必要であるかもしれません。 現場の中の RNA全体のマウントに関する最も一般的な懸念は、RNaseのコンタミネーションのリスク?...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 x transcription buffer</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11-465-384-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DIG-RNA labeling mix</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11-277-073-910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAse inhibitor</td>
 <td>Roche</td>
 <td>03-335-399-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNA polymerase - SP6</td>
 <td>Roche</td>
 <td>10-810-274-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNAseI, RNAse-free </td>
 <td>Roche</td>
 <td>10-776-785-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Yeast RNA</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15401-029</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>EMD-Millipore</td>
 <td>220201</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>heparin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H4784</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEPC (diethyl pyrocarbonate)</td>
 <td>Research Organics</td>
 <td>2106D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Moria Perforated Spoon</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>10370-17</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Netwell inserts</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>64713-00</td>
 <td>Netwells for use in 6-well tissue culture dishes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well tissue culture plate</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass scintillation vials with screw-cap lids</td>
 <td>Weaton Science Products</td>
 <td>986540</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>formamide</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP227500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Proteinase K</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>59895 (AM2542)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NBT</td>
 <td></td>
 <td>11585029001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BCIP</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11585002001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrogen peroxide, 30%</td>
 <td>EMD</td>
 <td>HX0635-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sheep serum</td>
 <td>VWR</td>
 <td>101301-478</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>glutaraldehyde</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G5882</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tRNA</td>
 <td>Roche</td>
 <td>10-109-541-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-DIG Fab Fragments</td>
 <td>Roche</td>
 <td>1137-6623</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>26323-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclear Fast Red</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>26078-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPX Mountant</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>13510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraffin (Paraplast X-tra)</td>
 <td>McCormick Scientific</td>
 <td>39503002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10% Formalin, NBF</td>
 <td>VWR</td>
 <td>95042-908</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass scintillation vials with screw-cap lids</td>
 <td>Weaton Science Products</td>
 <td>986540</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steal base molds</td>
 <td>Tissue-Tek</td>
 <td>4161-4165</td>
 <td>Multiple sizes available.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cassettes </td>
 <td>Tissue-Tek</td>
 <td>4170</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Slide warmer</td>
 <td>Fisher-Scientific</td>
 <td>12-594Q</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue Embedder</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>EG1160</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microtome, rotary</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>RM2235</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue-Tek Slide Staining Set</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>62540-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue-Tek 24-Slide Holder</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>62543-06</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Superfrost*Plus slides</td>
 <td>Fisherbrand</td>
 <td>12-550-17</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

rna in situ hybridization in whole mount embryos and cell histology adapted for marine elasmobranchs

彼らは適応免疫を持っていると浸透圧調節1-3ユニークなメカニズムを持っている最も原始的な脊椎動物であるため海洋軟骨魚類は、生物医学やゲノム研究のための動物モデルを高く評価しています。ペアリング付属で最も原始的な有顎脊椎動物 - として、軟骨魚類は特に進化と発展の研究のために、進化的に重要なモデルです。海洋軟骨魚類はまた、気候変動4との関係における、水生毒性とストレス生理学を研究するために使用されてきた。このように、方法論の開発と適応は、複数の生物学的分野にこれらの原始脊椎動物の使用を容易にし、拡大するために必要とされる。ここで私は、in situハイブリダイゼーションおよび軟骨魚類における遺伝子発現と細胞組織学を研究する組織学的技術で RNA全体のマウントの良好な適応を示す。 遺伝子発現を監視することは発達BIOLの顕著なツールですogists、広く発達過程5を調査するために使用されています。 in situハイブリダイゼーション 、RNA全体のマウントは、発生中の胚の組織における特定の遺伝子の転写産物の可視化およびローカライズすることができます。遺伝子のメッセージの発現パターンは、遺伝子が制御してもよいものを発達過程と細胞の運命決定への洞察を提供することができます。異なる発達段階での遺伝子の発現パターンを比較することで、洞察力は開発中の遺伝子の変化をどのように役割に得ることができる。 現場の中で全体のマウントは、組織に遺伝子発現をローカライズするための手段を提供していますが、組織学的技術は、分化した細胞の種類や組織の識別を可能にする。組織学的染色は、様々な機能を持っています。一般的な汚れはそれぞれ、核と細胞質の染色のための一般的な例では、ヘマトキシリン​​とエオシンのために、細胞の形態を強調するために使用されています。その他の汚れは、特定のセルを強調表示することができますタイプ。たとえば、この論文で報告されているアルシアンブルー染色はmucosaccharidesを識別するために広く使われている染色カチオン性である。アルシアンブルーで、消化管の染色はmucosaccharidesを生成杯細胞の分布を識別することができます。短いペプチドでmucosaccharide成分の変動は、消化管6内に関数では杯細胞を区別する。 その場 &#39;sと同時に組織化学的方法で RNA全体のマウントを使用することにより、細胞の運命決定は、遺伝子特異的発現にリンクすることができます。 RNAはその場 &#39;sと組織化学で広く研究者によって使用されているが、海洋軟骨魚類での適応と使用が限られており、様々な成功を達成しました。ここで私は軟骨魚類のために開発され、私の研究室で定期的に使用されるプロトコルを提示します。 その場でのハイブリダイゼーション法における RNAのさらなる改変が異なる種に適応するために必要であるかもしれませんが、プロトコルはここでpを説明その科学的な問い合わせに海洋軟骨魚類の使用を適応したい研究者のための強力な出発点をrovide。

L.のさまざまな地域でのアルシアンブルー染色の例erinaceaの消化管を図2に示します。 globlet細胞を含有する酸性ムチンは消化管全体に染色アルシアンブルーではっきりと見える。酸性ムチンの分布は、このように機能の違いを反映して、消化管の異なる領域で異なる。酸性ムチンの高濃度は、遠位腸（2bと図2aおよび 2c を比較）?...

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RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNAのホールマウントするための方法を組み合わせることにより、<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーションおよび組織学は、遺伝子発現は、発生中の胚での細胞運命決定とリンクすることができます。これらの方法は、軟骨魚類、海洋に適応し、生物医学、毒物学と比較研究のモデル生物として、これらの動物の使用を容易にされてきた。

RNAを<em&gt;その場</emホールマウント胚および細胞組織学で&gt;ハイブリダイゼーションは、海洋軟骨魚類に適合した

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

rna-situ-hybridization-whole-mount-embryos-cell-histology-adapted-for

Research

JoVE Journal

Biology

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

12.6K ビュー.  Union College. RNAのホールマウントするための方法を組み合わせることにより、その場でハイブリダイゼーションおよび組織学は、遺伝子発現は、発生中の胚での細胞運命決定とリンクすることができます。これらの方法は、軟骨魚類、海洋に適応し、生物医学、毒物学と比較研究のモデル生物として、これらの動物の使用を容易にされてきた。

ビデオ: RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

初期のニワトリ胚のin situハイブリダイゼーションダブルホールマウント

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

生物学

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

チックの全マウントの抗体染色のための方法

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

全マウントを使用するその場で</em分子とOrganismal生物学をリンクする>ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

全体のマウント<em&gt;上皮内</emE11.5マウス胚へのE8.5&gt;ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

蛍光によるウイルスRNAの検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNAの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析<em&gt; in situで</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

高解像度全マウント<em&gt;その場で</em遺伝子発現と機能を研究するためにゼブラフィッシュ胚内&gt;ハイブリダイゼーション

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...