我々は機器のセットアップの彼の援助のためのtrifurcating DEPアクチュエーションのためのチャネルとミッチェルCollensへの提供のためのウジンチャンに感謝の意を表したい。作業は、グラントOISE - 0951647を通じて、グラント99-2911-1-002-007を通じて台湾NSCによる米国NSFによってサポートされています。

機器のセットアップの一般的な図を図1Aに示されています。 PCB -サンプルのアセンブリはさらに、図1Bにおける断面模式で詳述されます。 1。 PCBの電極の準備： <ol><li>不均一な電界を生成するために、目的の形状に設計PCB電極。カスタマイズされたPCBの電極チップは、商業の製造設備（図1C）を介して注文することができます。 </li><li>印刷された各金属電極（図1D）の最後に半田付け、16ゲージのワイヤでのプレハブPCB電極を準備します。 <ol><li>電極の端の上に線を置きます。ワイヤを加熱するホットはんだごてによるPCBの金属部分の所定の位置にワイヤーを保持する。 </li><li>半田で線を埋めるために電熱線にはんだ少量の餌。 </li><li>線が半田で充填した後、はんだの温度が下がる一方な場所にワイヤーを保持している、はんだごてを削除します。 </li></ol></li><li> PCB上の各電気的な接続（図1D）のためのはんだ付けプロセスを繰り返します。 </li></ol> 2。マイクロ流体チャネルを準備します。 <ol><li>ポリジメチルシロキサン（PDMS）ベースのマイクロ流体チャネルをPDMSエラストマー、ダウコーニングからSylgard 184を用いて調製される。チャネルを定義するマスター金型は、通常シリコンウェハとSU - 8フォトレジストを使用して標準的な微細加工プロセスを経て作成されます。 </li><li> 5分間10:1の比で硬化剤に主剤を混ぜる。 </li><li>プレハブSU - 8マスター鋳型に液状PDMSを注ぎ、数分間真空に液体PDMSを公開することにより、気泡を取り除く。完全にすべての気泡を除去するために必要に応じて真空プロセスを繰り返します。 </li><li> 70 PDMS℃で2時間を治す。 </li><li>ウェハを壊さないように注意して、カミソリの刃を持つウェハからマイクロ流体チャネルをPDMSのスラブを削除します。 </li><li>マイクロ流体デバイスに体液と細胞を導入するためのパンチ穴。 （注：シリンジポンプ、重力や表面張力ベースのフローがすべてのDEPを使用することができます。） </li><li>それは、ほこりやごみの自由であることを保証するためにマイクロ流体デバイスを検査する。 PDMSのクリーニングは簡単に3Mスコッチマジックテープを使用して達成することができます。 </li><li>クリーンNo.0の厚さ（80〜130μm）のカバースリップの血漿結合はPDMSマイクロ流体チャネル。 15分の最小値は100℃でカバースリップ - マイクロアセンブリを加熱する。 </li></ol> 3。低導電性のメディアを準備します。 <ol><li>低導電性媒体は、8.5％ショ糖を混合して調製された脱イオン（DI）水で+ ​​0.3％グルコース（w / v）の1。 注：我々は以前に細胞が短い期間（約30分）のために低い伝導性にさらされた後、従来の細胞培養培地で日間培養することができることが示されている11。 </li></ol> 4。 PCBの電極上にマイクロ流体チャネルを組み立てます。 <ol><li> PCBとカバーガラスの間に緊密な接触を確保するため、PCB上にミネラルオイルを少量（約10μL）に置きます。 注：電極の可視化を減少させるためのオプションの手順では、黒の油性マジックや塗料の非常に薄い層で被覆するには、PCBの表面です。 </li><li>カバースリップは、石油（カバースリップダウン）との接触を形成するとともに、油を塗ったPCB上にカバースリップ-マイクロ流体チャネルのアセンブリを置きます。ゆっくりと良好な接触を確保し、細胞とビーズの可視化を損なうことができる空気の気泡を最小限に抑えるためにカバースリップ - マイクロアセンブリを押し込みます。完成したデバイスの例は、図1Dに示されています。 </li></ol> 5。ソートするとDEPを使用してビーズとセルを集中。 <ol><li> DI水または低伝導率のメディアとマイクロ流体チャネルを充填します。プラズマボンディングプロセスが一時的に通常は疎水性のPDMS表面を親水性にすることで、マイクロ流体チャネル内に水溶液を簡単にロードを容易にします。 </li><li>チャンネルリザーバー（図1C）に細胞および/またはポリスチレンビーズをご紹介。ここでは、ヒト大腸腺癌（HT - 29）細胞を使用してください。 </li><li> AC電源のアンプの入力にファンクションジェネレータの出力を接続し、電極の配線にアンプの出力を接続する。衝撃への潜在的な暴露からユーザーを保護するために電気テープを使用してセットアップのすべての電気配線と表面を覆う。機器のセットアップの概略図を図1Aに示されています。 </li><li> 1.0から1.5 MHzの正弦波出力を生成するためにファンクションジェネレータを設定します。出力の振幅は、PCBを80 - 100Vの出力を生成するRFパワーアンプ用に調整する必要があります。この作業でRFパワーアンプは、220から330 mVの周りの入力電圧を必要とします。別々のセルとビーズに、層流の速度は、ターゲットチャネルにメインチャネル（幅w =100μmの、高さh = 27μmの）内のセルとビーズを移動させる（幅w =100μmのDEPの力に準拠している必要があります、高さh = 27μM）。 注意：mを決定するためにPCBの製造業者に相談このようなPCBの過熱や溶融などの問題を回避するためにaximum動作電圧。安全な動作設定を決定するファンクションジェネレータとパワーアンプのメーカーの機器の製造元の仕様を確認してください。 </li><li>ソートの細胞とビーズにDEPを開始する。ポリスチレンビーズは、指定された周波数内で不均一な電場で負のDEPを体験し、一方のセルは、正DEPを経験する。これは、DEP力活性化のbioactuationと細胞と電極として手頃な価格で再利用可能なプリント基板を使用してマイクロ流体デバイス内の他の粒子の分離が可能になります。 </li></ol> 6。代表的な結果： DEPが作動細胞または粒子で効果的であるときは、不均一な電場内で堅牢なアラインメントは、静的なバスまたは低速流体の速度のために観察される。高い流体速度の条件下では、細胞または粒子挙動は電場の軸流と流速の相対的な向きに依存する。さらに、細胞と粒子の挙動も、電界強度および電場内の非均一性の程度に依存しています。細胞または粒子の典型的な行動は、&quot;真珠のチェーン、&quot;サイクリング、失速、または回転などがあります。 妥協または廃止DEPは、流体、弱電界の強さ、過度の流速、厚すぎるカバーガラス、またはカバースリップとPCBの電極間の導電性溶液中の塩または他のイオン性分子の存在を含めることを条件（例えばクラックカバースリップが誘発することができます）水と鉱物油の混合。 ここで、0番厚みのカバースリップ（80〜130μm）との電極間隔（231μm）を使用しているとき、電界強度の二乗の勾配は、HT - 29細胞とビーズに適用さが2の間と推定される-8〜6-8 V 2 /μmの3 1 DEPの力は、静的な流体（図2A - B）にDEPによって操作される粒子の速度を、測定することによって推定することができる。粒子の小さな慣性とマイクロ流体チャネルの粘性の高い環境のために、流体抵抗力が等しくなるが、DEPの力と反対の方向です。低導電性媒体における平均的なビーズ速度は、DEPの93 Vppの電圧と1.5 MHzの34.5μm/ sのです。流体抗力は次式で計算することができます。1 F ドラッグ =6πηRv 20℃の低導電性の媒体の平均粘度η° Cは1.27 mPa ・•sでビーズ半径Rは7.5μmである。ポリスチレンビーズのための流体抵抗力が6.19 pNのと推定される。 （図2C - F）マイクロ流体チャネル内にビーズを作動させる能力を示すために、我々は、表面張力の媒介の流れを用いることによって、低導電性の媒体の流れを開始した。個々のチャネル内の平均速度が565μmの/秒（図2C）に減少したのに対し、単一の入力チャネルの平均ビーズ速度は、1540ミクロ​​ン/秒であった。 DEPを開始することによって、ビーズはむしろサイドチャネルに放出されているよりも中央のチャネル内に保持された。従って、これらの条件下で、DEP軍は2つのサイドチャンネルに流体の抗力に打ち勝つのに十分であった。 同じ原理は、単にDEPの電極（図2E - F）のようにチャンネルとビーズの流れの向きを変更することにより、中央の運河からのシングルサイドチャネルにビーズをそらすために使用されていました。ビーズは三つの部分に分かれることのポイントに近づくとDEPが開始された単一の入口チャネル、の側に金属電極を釣りことにより、ビーズをチャネルの側面に導かれた。そこに、DEP軍は層流がチャネル（図2F）がそれらを推進するために続け側のチャンネルの一つにビーズを引っ張るために十分であった。 細胞とポリスチレンビーズが不均一な電界で分極し、作動させる能力に明らかな違いを持っ​​ているので、我々は同時に、細胞とビーズのオンチップ分離を実行する能力を実証するためにDEP使用。我々は、図2E - Fで設定した同じ流体チャネルの構造と基板電極を使用するが、単一の入口チャネル（図3）に、低導電性の媒体でHT - 29細胞とビーズの懸濁液を導入しました。ビーズは右上の個々の出力チャネルに保持されたのに対し、DEPが導入されている場合、およびこれらの条件下で、HT - 29細胞は、2つの左出力チャンネルに保持された。それらは左出力チャネルで収集されるここで細胞が特徴的な&quot;真珠チェーン&quot;の動作を示す。時折ビーズと細胞は、それらはしばしば細胞の出力チャンネルで、一緒に回収された一緒に添付さになる。この実験かららのデータは、我々は713分あたりの粒子（細胞とビーズ）、または20分に14260細胞とビーズの同等のようにソート率を決定する。取得された細胞とビーズの数は、分子生物学、イメージング、生化学およびラボオンチップアプリケーションに関連すると便利です。 <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。マイクロ流体チャネルの細胞および粒子のPCBベースのDEP。（A）DEPベースの作動のための機器のセットアップは、の信号強度を高めるためにして、パワーアンプを電気信号の周波数と振幅を定義するためにファンクションジェネレータで始まるPCB上で生成される電界。 （B）サンプルの作動のためのマイクロ流体デバイスアセンブリは、不可逆的に無にバインドされたPDMSマイクロ流体チャネルから構成されます。細胞および/またはビーズを入浴するには、0の厚さの酸素プラズマを介してカバースリップ（80〜130ミクロン）、非導電性の媒体。 （C）PCBの電極は、電極が強力な不均一な電界を生成するために櫛歯されている2つの領域から構成されてここで使用。 （D）完成した装置：シングルカバースリップ上でtrifurcatedマイクロ流体デバイスとPCBは、挿入図は、電極ワイヤで全デバイスを示しています。 （CD）のスケールでは、PCBの測定値は8.4センチ（L）、2.1 CM（w）は、5ミリ幅の電極としています。 <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 DEPアクチュエーション前および実行中にチャネルの細胞とビーズの代表的な画像。（）層流のないPDMSマイクロ流体チャネル、（時間経過、1.23秒）内の低伝導率のメディアソリューションで15μmの蛍光ポリスチレンビーズ。 （B）DEP開始されると、ビーズは、電極（時間経過、8.18秒）の間にPCBの電極パターン（ブラックストライプ）ではなく、向かって移動。 （C）層流の下で同じチャンネル内のビーズが3つのチャンネル（経過時間、5.3秒）の間で分割され、DEPが（D）開始されるとき、ビーズは中央のチャネルにのみ流れるように作動している（時間経過、4.3秒）。 （E）PCBの電極へのチャネルの向きを変更することにより、ビーズを差動ではなく、（D）に示すような中央のチャンネルよりもDEPを使用する側のチャネル（F）に向けることができる。 （EF）の経過時間はそれぞれ、8.23秒と5.16秒です。すべてのスケールバー= 100μmの。 <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。前にDEP、ヒト大腸腺癌の混合溶液（HT - 29）3つの個別出力チャネルに1つのチャネルからの細胞とビーズの流れを開始する前とDEP作動中。チャンネル （AB） の細胞とビーズの代表画像 。オープン矢印は層流とチャネルの方向は方位と明確化のための破線で囲まれている識別します。特定されるように（CD）誘導DEPにより、ビーズと細胞が選択的に別々のチャンネルに作動している。ビーズは右チャンネルを終了するのに対し、HT - 29細胞は、中央と左チャンネルを終了します。ビーズと細胞の特徴的な真珠のチェーンは、DEP作動中に観察される。マイクロチャネル中の細胞とビーズの（A、C）微分干渉コントラストイメージングは​​、ビーズが簡単に見えるレンダリングします。同じDIC画像（、C）のグロースケールの強度画像（B、D）は、チャネル中の細胞の可視化を向上させる。反射金属電極（（A、C）の光のストライプと（B、D）黄色と緑色）効果的なDEPベースの作動のために電極にマイクロチャネルを揃えるための著名なランドマークを提供する。スケールバー= 100μmの。

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利害の衝突は宣言されません。

マイクロ流体デバイスの細胞操作では、ソートまたは単一細胞の選択的配置、または人口調査のための望ましい2層流をマイクロ流体デバイス内のセルを操作するためのバルブとポンプと組み合わせて使用されている。しかし、単独でこれらのメソッドは、チャレンジングなものであり、詳細な製造プロセスやスキルを必要とする3遠心分離は、セルの配置のための要求を簡素化することができますが、同時イメージングが課題となって、希望する操作と考えると効果を設計する際に、さらに、遠心分離用チャネルのアーキテクチャは、慎重に検討する必要があります。求心力の4レーザーピンセットは、セルの配置に使用することができますが、方式はコストとハイスループット細胞選別のための従順ではない。しかし、5、DEPが有効なセル配置のための&quot;電気ピンセット&quot;の効果的なシステムとして実証されている、特性評価と操作。6,7 特に、DEPは、細胞塊の測定のために共鳴センサーの細胞を収集するための7-10と、選択的に生活と死細胞のオンチップ処理のために細胞を捕捉し、ソートするために使用されています。11我々は以前にDEPを増やすことによっていることを実証した流体抗力上記細菌またはビーズ上での力、ポリスチレンビーズ及びリステリアモノサイトゲネスV7のオンチップ濃度とトラッピングを達成することができる。E. 12混合集団は、 大腸菌とL.リステリア菌の細菌はまた、DEPのパルスによって誘導し、リリースすることができます。小さ ​​な粒子が捕捉されていませんが、流体の流れで削除されるのに対し、さらに、より大きな粒子は、差動、大きな粒径に基づいて、電極上に捕捉、濃縮することができます。13 DEPの力が粒子上に流体ドラッグする力を克服していないときは、ビーズや細胞がキャプチャではなく、流体ストリーム内で移動されていません。図2Cに示すように、ビーズは中央のチャネルでビーズを保持するのに十分な流体の流れの中央部に集中することができます。これは、DEPが強制的に、これらの組み合わせ、または他のいくつかの未定義の効果をドラッグするよりも大きい流体速度の電界内の粒子間の粒子の影響の相乗効果が原因である可能性があります。 非接触DEPの新しい進歩は、このようにDEP操作中に、最大限に、細胞の種類を保護する、必要最小限のフィールドで、セルのキャプチャと操作を最大化を可能にする。1,9接触DEPは、ソートのためのマイクロ流体のコミュニティへの約束、収集とポジショニングの細胞を提供していますマイクロ流体デバイス内で。我々は、増加の需要、およびマイクロ流体デバイス内で操作するためのDEPの実装で、更なる発見と技術革新がDEP力の理解と影響力を拡大すると予想している。 PCBは、その実用化のための良いプラットフォームを作り、迅速な製造の所要時間と手頃な価格で大量生産工程を経て製造することができる。さらに、PCB類は使いやすく、オンチップ細胞操作やソートのための分野の範囲での科学者のためにアクセス可能です。 PCBの電極のレイアウトを設計する際に、考慮が必要な粒子/細胞軌道に与えられるべきである。検討のための主要な要因は、粒子サイズと種類（ビーズおよび/または細胞）、細胞型、マイクロサイズ、流速、電極間隔（電界強度を決定する）、カバーの厚さ、および流体の導電性が含まれています。これらの要因は、粒子または細胞、および最終的には分離効率を操作するために必要な、利用可能な力に影響を与える。ここで紹介する我々のプロトコルは、ミクロスフェアおよび細胞分離のためにDEPを開始するための効果的なセットアップを示しています。潜在的なアプリケーションの場合、ユーザーは各アプリケーションの効率を最適化するために、細胞とビーズの所望の流路だけでなく、電極パターンとマイクロ流体チャネルの設計のアーキテクチャと一致している必要があります。電極間隔とカバーガラスの厚みは、マイクロ流体チャネルのレイアウトを設計する以前に報告されたガイドラインに従って使用することができます1。 細胞はそのまま維持しながら細胞/粒子と周囲の媒体の導電率と誘電率は、正または負のDEPを容易にするために十分異なっている必要があります。球状​​粒子のDEPの極性は、DEPの電圧の周波数ωで、次のクラウジウス - Mosotti因子の複雑な値の実数部から決定することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2545/2545eq1.jpg" alt="式（1）" /> 式（1） この式のεに、誘電率、σは導電性であり、そしてε*は複素誘電率である。添え字のpとmそれぞれ、粒子やメディアを表す。セルがメディアよりも高い誘電率を持っている、またはクラウジウス - Mosotti係数の実部が正になるときは、粒子は周囲の媒体よりも偏光になります。不均一な電界により、粒子の偏光が不均一になり、これは、より高い電界強度を持つ地域に向けてセルを描画するポジティブDEP（+ DEP）力を作成します。細胞が周囲の媒体よりも低い誘電率、またはクラウジウス - Mosotti因子負になるの実部を持つ場合、それは負のDEPを（- DEP）受けることになる、とセルは最小限のフィールド領域に向かって強制される。セルとメディアがほぼ同じ複素誘電率を持っている場合、力はセルを操作するために生成することはできません。このような理由から、純粋な水は、DEP粒子操作用の優先メディアです。しかし、純水からの細胞に浸透圧ストレスを回避するために、低導電率のメディアは、導電率を据え置くことを定式化したが、細胞に浸透圧ストレスを減少させるために浸透圧を増加させる。従来の細胞培養培地やDMEMまたはPBSのような生理的緩衝液は、DEPの操作には適していない高導電率を、持っている。 我々はまた、以前に細胞が低導電性の媒体を使用してDEPを持つセンサーで捕捉することができることを実証した。細胞接着のための短い期間の後、低導電率のメディアは、日間、細胞の成長をサポートするために必要な細胞培養培地に置き換えることができます。11 我々の経験から、蛍光ビーズは生細胞の蛍光に関して非常に明るい、従ってそれは生きていると蛍光セルの強さにビードの強度に合わせて、挑戦することができます。細胞とビーズの両方の可視化を改善するために、我々は、イメージング用正立顕微鏡の両方でDIC顕微鏡を使用していました。細胞とビーズを表示するには、我々は、見やすくするための幅広い色スペクトルのデータを保持する強度グロースケール画像、内のデータを発表した。従って、関心の研究を設計する際に、画像パラメータおよびリソースを考慮する必要があります。 要約すると、我々は選択的にDEPを使用して別々のチャンネルにビーズと細胞を作動させる能力を示す。細胞生物学、生化学および生物工学のアプリケーションのためのマイクロ流体チャネルの増加ユーティリティを使用すると、DEPは、セルのコレクション、配置、および並べ替えのための望ましいオプションです。 PCBの電極の製造が安価で便利ですが、電極は使いやすく、そして迅速な製作時間は、DEPの実装に最適です。

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sylgard 184 kit (PDMS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Elsworth Adhesives</td>
<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
<td>Dow Corning Sylgard</td>
</tr>
<tr>
<td>16 awg hook-up wire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Belden</td>
<td>8521</td>
<td>(Type MW) Mil-W-76C-PVC</td>
</tr>
<tr>
<td>Gold seal Cover Glass </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella</td>
<td>260320</td>
<td>No. 0 thick, 24 x 60 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Miltex Biopsy Punch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR Scientific</td>
<td>95039-104</td>
<td>Miltex, assorted sizes</td>
</tr>
<tr>
<td>Custom PCB electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bay Area Circuits </td>
<td>Custom parts</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mineral oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>O121-1 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Deionized water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>House DI water supply</td>
<td>None</td>
<td>Use filtered DI water</td>
</tr>
<tr>
<td>D-Glucose Anhydrous Granular AR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mallinckrodt Chemicals </td>
<td>4912-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose, Crystal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Mallinckrodt Chemicals</td>
<td>8360-06 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent polymer microspheres </td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Bangs Laboratories</td>
<td> FS07F/9277</td>
<td>15&mu;m Dragon green microspheres</td>
</tr>
<tr>
<td>HT-29 cell line</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>HTB-38D</td>
<td>Human colon adenocarcinoma</td>
</tr>
<tr>
<td>Typsin 0.05% EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen </td>
<td>25300054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eclipse E600FN upright microscope </td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Nikon</td>
<td>Eclipse E600FN </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phantom V310 High-speed imaging camera </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Phantom</td>
<td> V310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BX51 upright research microscope </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus </td>
<td>BX51</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SpotFlex high resolution color camera </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diagnostic Instruments </td>
<td>FX1520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Function generator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent </td>
<td>3325A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RF Power amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EIN</td>
<td>2100L</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

separating beads and cells in multi-channel microfluidic devices using dielectrophoresis and laminar flow

マイクロ流体デバイスは、細胞を選別し、計数、操作、勉強のためにセルの規模で動的な流体環境を提供することにより、細胞の研究を進めてきた。しかし、流体領域内のセルを操作することが課題のままとバルブと電極を形成するための複雑な製造プロトコルを必要とする、または光ピンセットのような特殊機器を必要とします。ここで、我々は（PCB）は、従来のプリント回路基板を示すbioactuationするため、およびマルチチャネルマイクロ流体の細胞とビーズの分離のための層流の分野でのビーズと細胞操作のための採用誘電泳動（DEP）による細胞の非接触操作に使用することができますデバイス。最初に、我々は、DEPの電極とマイクロ流体デバイスの組み立て、およびDEPのために細胞を調製するためのプロトコルを提示する。その後、我々は、ポリスチレンビーズでDEPの動作を特徴付ける。最後に、我々は、マルチチャンネルマイクロ流体デバイスのビーズと細胞分離の代表的な結果を示す。要約すると、DEPは、マイクロ流体デバイス内での粒子（ビーズまたはセル）を操作するための効果的な方法です。

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Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

誘電泳動（DEP）は、細胞を操作するために有効な方法である。プリント回路基板（PCB）は、マイクロ流体デバイス内に非接触で細胞操作のために、安価な再利用可能で効果的な電極を提供することができます。プリント基板上にカバーグラスを持つPDMSベースのマイクロ流体チャネルを組み合わせることで、我々は、マルチチャンネルマイクロ流体デバイス内でビーズと細胞操作と分離を示しています。

誘電泳動と層流を用いたマルチチャネルマイクロ流体デバイスの分離ビーズと細胞

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

27.3K ビュー.  University of Illinois at Urbana-Champaign. 誘電泳動（DEP）は、細胞を操作するために有効な方法である。プリント回路基板（PCB）は、マイクロ流体デバイス内に非接触で細胞操作のために、安価な再利用可能で効果的な電極を提供することができます。プリント基板上にカバーグラスを持つPDMSベースのマイクロ流体チャネルを組み合わせることで、我々は、マルチチャンネルマイクロ流体デバイ?...

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Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

層流のせん断応力下の内皮前駆細胞を評価するために、平行平板フローチャンバーと定常流回路

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

生物工学

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

のためのシンプルなマイクロ流体デバイス<em生体内で&gt;</emの&gt;イメージング<em&gt; Cエレガンス</em&gt;<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;とゼブラフィッシュ

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Microtissue安定化のためのマイクロ流体デバイスの層ごとのコラーゲン沈着

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

マルチチャンネルデュアル電界マイクロ流体チップを用いて、肺癌細胞の走電性の研究

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

3Dペーパーマイクロ流体デバイスを構築するために接着剤パターニングを使用して、

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました<em&gt;インビトロ</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

バルブ付き多層マイクロ流体デバイスのための多段階可変高さのフォトリソグラフィ

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and directed within a layer of paper. Moreover, stacking multiple layers of patterned paper creates sophisticated three-dimensional microfluidic networks that can support the development of analytical and bioanalytical assays. Paper-based microfluidic devices are inexpensive, portable, easy to use, and require no external equipment to operate. As a result, they hold great promise as a platform for point-of-care diagnostics. In order to properly evaluate the utility and analytical performance of paper-based devices, suitable methods must be developed to ensure their manufacture is reproducible and at a scale that is appropriate for laboratory settings. In this manuscript, a method to fabricate a general device architecture that can be used for paper-based immunoassays is described. We use a form of additive manufacturing (multi-layer lamination) to prepare devices that comprise multiple layers of patterned paper and patterned adhesive. In addition to demonstrating the proper use of these three-dimensional paper-based microfluidic devices with an immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG), errors in the manufacturing process that may result in device failures are discussed. We expect this approach to manufacturing paper-based devices will find broad utility in the development of analytical applications designed specifically for limited-resource settings.

We detail a method to fabricate three-dimensional paper-based microfluidic devices for use in the development of immunoassays. Our approach to device assembly is a type of multilayer, additive manufacturing. We demonstrate a sandwich immunoassay to provide representative results for these types of paper-based devices.

イムノアッセイのための3次元紙ベースのマイクロ流体デバイスの作製

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

垂直化学的酸素勾配の下で細胞移動研究のためのポリジメチルシロキサン - ポリカーボネートマイクロ流体デバイス

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

非常に小さいスペースで先端成長植物細胞の伸長機能を勉強するマイクロ流体デバイスの開発

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...