この作品は、環境健康科学研究所によってサポートされていました[K22ES012264へAJRB]と米国癌協会InstitutionalResearchグラント[ACS - IRG - 00 - 173 - 04]パイロットprojectaward [AJRBへ]。我々はまたしてはいけないことの例については、原稿と特に映像とアダムブラウンのコメントの重要な読書のためにビショップの研究室のメンバーに感謝。私たちは、私たちに解剖のビデオの撮影用カメラのセットアップ彼の解剖スコープ/ビデオの使用を可能にするためGreehey小児がん研究所の博士ドナルドウェンに感謝。私たちは、シャープと私たちの顕微解剖ツールの修理のためコルテインスツルメンツでDaronブラウンに感謝する。

1。眼球の外から余分な組織を取り除く<ol><li> 35mmディッシュの蓋に1X PBSを注ぐ。レベルは、単に蓋の唇未満である必要があります。 </li><li>ストレートピンセットを使用して、35mmディッシュに蓄積管からの眼（s）を転送する。 1：目は2つの理由のためにPBSに浸漬されています。無関係な組織は、あなたが見ることができるので、目から離れて&quot;フロート&quot;と簡単にそれらを削除し、2になります。懸濁液中のまま解剖時には、目が自然にこの形状ではなく、それに対して作業できるように、その球状の形状を維持します。 </li><li>直角鉗子（45 °と15 °）の両方のペアを使用して、静かに（角膜に向かってすなわち）穀物に対して組織を引っ張って、できるだけ多くの筋肉と結合組織として削除します。いくつかの結合組織が維持されます。努力は、できるだけ少ないとして眼球を圧迫するためになされるべきである。 </li><li>春のはさみについては、15 °の鉗子を交換。 45 °の鉗子との着実な目を保持しながら、残りの筋肉や結合組織だけでなく、視神経を切り取るために春のはさみを使用してください。 *ヒント：トリムして木目に逆らって組織をプッシュするはさみの外側のエッジを使用してください（corneo -強膜の分周に向かって）と。すべての余分な組織を目から除去されるまで操作を続行します。 </li></ol> 2。角膜と水晶体を取り除く<ol><li>角膜を上に向けて、角膜の中心部にある小さな倍を挟まないように45 °の鉗子を使用してください。 </li><li>春のはさみを使用して、フラップの基部に小さな切開を行います。フラップを手放す。 </li><li>目を押し続けると、まだピンセットで、に低い鋏ブレードを挿入し、垂直に切開するとcorneo -強膜除算に向かってカットを行います。角膜と虹彩の両方が切断されるようにアイリスの下に下刃を維持しようとします。 corneo -強膜デバイドのすべての方法を切断しないでください。目に挿入されたはさみをしてください。 </li><li>あなたの45 °の鉗子を使用して、慎重にはさみがcorneo -強膜デバイドと平行になるように、目を回転させ、小さなカットを行います。徐々にすべての道の周りに小さな切開を行う、眼360 °回転させる。再び、虹彩と角膜の両方が切断されるようにアイリスの下で春のはさみの下刃を維持しようとします。離れて目の残りの部分から虹彩と角膜を持ち上げて、それらを捨てる。 </li><li>その側に目を傾け、レンズを強制的に、目の後半に軽く押し下げます。レンズを捨てる。残りのアイカップの内側は滑らかで、不透明になるはずの神経網膜、が並んでいます。 </li></ol> 3。第4四半期に、その結​​果生じるアイカップ、 - &quot;花弁のある&quot;、花のような構造を<ol><li>目は、アイカップの開口部があなたの体に垂直になるように配置する必要があります。安定して位置アイカップにお使い45 °の鉗子を使用してください。 </li><li>あなたの前のあなたの春のはさみを保持しているので、彼らはあなたの体に垂直な、オープンアイカップの上端にあなたの春のはさみの下刃を挿入します。あなたの45 °の鉗子を使用して、慎重に、単一の、ストレートカットが視神経乳頭に向かってcorneo -強膜の除算から作ることができるように、アイカップを合わせます。すべてのカットはcorneo -強膜デバイドに垂直でなければならず、指定されない限り、それに切断することなく、できるだけ視神経乳頭に近いもの行く必要があります。 </li><li>あなたの体との直角度を維持し、アイカップを180 °回転させる。第二垂直カットを作るステップ3.2での技術を使用してください。 </li><li>アイカップを回転させ、さらに2つのカットをするために3.2で説明した技法を繰り返す。すべての4つのカットが可能な限り離れて90 °に近くする必要があります。いくつかのばらつきがあるだろうので、目が完全に球形ではないことに留意してください。 </li></ol> 4。八花弁の花のような構造になる、半分に四つの&quot;花びら&quot;のそれぞれをカット<ol><li> 35mmディッシュからきれいなスライドに等分アイカップを転送する。上向きにアイカップで、45 °の鉗子で、その下にスクープ。慎重に液体から持ち上げますときれいなスライド上に置きます。 </li><li>直角鉗子の両方のペアを使用して、軽く上向きに神経網膜と、目を開く。外さないでください神経網膜 - それはあなたがそれに対して動作していないので、目がその球面形状の一部を維持するのに役立ちます。また、誤って以下の手順で破損しているからRPEを保護します。 </li><li>花びらの一つがあなたの体に垂直になるまで、スライドを回転させます。 </li><li>そっと花びらの角をつかむ、あなたの15 °の鉗子を使用してください。花びらのコーナーは、ない神経網膜や網膜色素上皮角膜にする必要があります。それはその曲率を維持できるように、静かにコーナーを持ち上げます。 </li><li>花びらとスライドの間に春のはさみの底刃を挿入します。 、ストレート、シングル垂直カットが視神経乳頭に向かってcorneo -強膜の除算から作ることができるようラインアップしてはさみを。できるだけwithouとして視神経乳頭の近くにカットtはそれに切断。それがスライド上にあるできるように、花びらを手放し。 </li><li>次の花びらはあなたの体に垂直になるように、スライドに90 °回転させます。ステップ4.5を繰り返します。 </li><li>さらに2回のステップ4.5と4.6を繰​​り返します。結果として得られる構造は、8花弁の花のようになります。 </li></ol> 5。神経網膜を削除します。 <ol><li>ピペット試料上に1 × PBS 100〜200μL。これは、RPEからそれはがしするとオフ付着から神経網膜を防ぐことができます。 </li><li>通常は神経網膜が緩くRPEに添付されます。しかし、それだけで神経網膜としないRPEを削除するには、練習やスキルを取る行います。直角鉗子の他のペアで（押したまま）目の残りの部分を安定化しながらゆっくりと斜め鉗子一対の神経網膜の花びらを把握する。離れて目の残りの部分から神経網膜を引っ張る。全体の神経網膜が削除されるまでこの手順を続行します。 *ヒント：目を固定するために視神経乳頭にあなたの15 °の鉗子の先端を貼る。その後、神経網膜の下になる方向に掃引する45 °の鉗子を使用し、それを持ち上げ、。それはcorneo -強膜デバイドに向かって視神経乳頭から神経網膜を持ち上げることが最善です。アイリスの緩んでいる残骸を引き離すようにしてください。アイリスは、非常に粘着性であり、そうでなければRPEに陥ることができる。 </li><li> 1X PBSで試料を洗浄します。ピペットは100〜200検体への1X PBSμLとそれをバックアップ吸う。 PBSを捨てます。ほこりやごみを除去するために、必要に応じて手順を繰り返します。 </li></ol> 6。あなたのスライド上の試料（s）をマウントします。 <ol><li>ピペット長方形の形状で、新しいスライド上に90％グリセロールの80〜90μL。グリセロールのであって、長方形のスミアを作るために、ピペットチップの側面を使用してください。 （これは、1つのスライドに2つのRPEを取り付けるための手順です。） </li><li>試験片の下15 °の鉗子の下アームを挿入します。ゆっくりと解剖のスライドから試料を持ち上げます。 </li><li>ゆっくりとグリセロールに試料を下ろします。優しくて、試料の下からそれを引き出すように鉗子が小刻みに動く。 </li><li>他の試料のためのステップ6.1から6.3を繰り返します。 </li><li>長辺があなたの体に垂直になるようにスライドを回転させます。それがスライドに触れているように、スライドに45 °の角度であなたのカバーガラスを保持する。彼らが触れるまでグリセロールの塗抹標本に向かって移動する。カバーガラスとスライドの間の接触を維持し、ゆっくりとスライドの端に向かって、離れて汚れからカバーガラスを移動する。スライドとカバーガラスの長辺までのラインが平行になるように。親指と人​​差し指の間にカバーガラスの角を保持する。 </li><li>もう一方の手で15 °の鉗子を拾う。腕のクルックのカバーガラスの上部（無料）エッジクレードル。非常にゆっくりと、カバーガラスを下げます。連絡先はカバーガラスとグリセロールとの間で行われると、停止し、移行するグリセロールを待ちます。この下げ、RPE全体マウントが完全に覆われるまで待ってを繰り返します。これは、気泡を捕捉から高粘度のグリセロールを防ぐためです。カバーガラスを押し下げてはいけません - グリセロールは、密着性が非常に悪くなり、その下から絞り出すなります。 </li><li>透明なマニキュアと、カバーガラスとスライドが出会う周囲塗料。 </li><li>乾燥するために空のラックの上にスライドを配置。 </li></ol> 7。代表的な結果： この手順の結果は、花のように見えるとはかなり対称的でなければならない構造でなければなりません。 <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。黒やアグーチの動物から野生C67Bl/6Jマウス。RPEから全体のマウントRPEは、色でダークブラウンでなければならず、滑らかな表面を持つ必要があります。それは、花びらの地形の起伏に気づくのは正常です。どんなGIVE試料の色素は、RPEおよび基礎となる脈絡膜の両方の色素沈着の可変密度に起因する多少の変数があります。白い矢印は、脱色性の&quot;チャンネル&quot;を指している - これは正常であり、眼の基礎となる血管系によるものです。 RPEおよび基礎となる脈絡膜の両方の物理的な損傷に青い矢印を指しています。 <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。希薄マウスからの全マウントRPE。希薄な動物から採取した検体は、ほとんど透明からカフェオレに色の範囲で指定できますし、いずれかの標本は、ここで黒丸で示された、その中でばらつきを持っているようです。一般的には、若い動物から採取したRPEはもっと明るいし、以前の動物から採取したものは暗いです。黒い矢印は、脱色表示される、基礎となる血管系、のいくつかを示します。 <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。ファロイジン染色は、RPEへの物理的な損傷を検出するために使用することができます。。ファロイジン染色では明らかに上皮の六角形の形状を示す、細胞膜の概要を説明します。黒いマウスから（）の例。希薄マウスから（B）の例。 <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。希薄マウスからの悪い解剖RPE。（A）ブラケットには、および/ ​​または折り畳みを座屈引き起こす可能性が広すぎる角膜のマージンを、示している。黒い円の中には目の後ろから削除されていない余分な組織の過剰な量を見ることができます。サンプルが希薄な動物からのものであるので、彼らは特に明白です。左下の花びらは、部分的に折り返しています。 （B）これは全体のマウントは、風車の外観を持っています。黒い矢印は、作成されたカットのいくつかを示します。視神経乳頭に向かってcorneo -強膜デバイドからのカットの多くは、直径に合っていません。 （C）黒矢印はカットが接線に直径と垂直に沿って、行われている方法を示している。

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	<li>Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzo(a)pyrene+andX-rays+induce+reversions+of+the+pink-eyed+unstable+mutation+in+the+retinal+pigmentepithelium+of+mice.">Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice.</a> Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).</li><li>Reliene, R. H. l. a. v. a. c. o. v. e., Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diesel+exhaust+particles+cause+increased+levels+of+DNA+deletions+after+transplacental+exposure+in+mice.">Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice.</a> Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).</li><li>Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atm+deficiency+causes+increased+frequency+of+intrachromosomal+homologous+recombination+in+mice.">Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice.</a> Cancer Res. 60, 395-399 (2000).</li><li>Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+WRN+helicase+domain+is+not+required+for+spontaneous+homologous+recombination-mediated+DNA+deletion.">Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion.</a> J. Nucleic Acids. , (2010).</li><li>Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1+suppresses+homologous+recombination+events+in+mice+in+vivo.">PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , (2010).</li><li>Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-,+and+Gadd45a-deficient+mice+show+an+increased+frequency+ofhomologous+recombination+at+different+stages+during+development.">p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development.</a> Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).</li><li>Bodenstein, L., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+development+of+the+mouse+retinalpigment+epithelium.+Part+I.+Cell+and+tissue+morphometrics+and+topography+of+mitoticactivity.">Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity.</a> Dev Biol. 121, 192-204 (1987).</li><li>Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+phenotype+and+the+RPE:+is+the+answer+blowing+in+the+Wnt?.">Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt?.</a> Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

RPEは、相同性指向修理のin vivoアッセイでは、p 国連検定のサイトです。 P 国連アッセイは、相同性指向修理の周波数の異なるDNA損傷の1,2およびDNA損傷のシグナル伝達と修復遺伝子3,4,5の効果を研究するために使用されています。このアッセイでは、RPE 1の単一セルのイベントを検出する、高感度です。また、開発6時の相同?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>straight forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-4903</td>
<td>tip: .08 x .04 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>45&deg; forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5005</td>
<td>tip: .05 x.01 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>15&deg; "up" forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5045A</td>
<td>tip: .1 x.06 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>spring scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5604</td>
<td>comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel</td>
</tr>
<tr>
<td>binocular dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ziess</td>
<td>Discovery V.8</td>
<td>use reflected light source</td>
</tr>
<tr>
<td>phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A22283</td>
<td>Alexa Fluor 546</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium

網膜色素上皮（RPE）はちょうど（ロッドとコーン）光受容体を含む神経網膜の下に、哺乳類の目の後ろに位置しています。 RPEは、密接にちょうどその上の神経網膜と色素立方細胞と関連付けますの単分子層である。この協会は、網膜疾患を研究する研究者に関心のRPEになります。 RPEはまた、相同性に向けられたDNA修復、P 国連アッセイの in vivoアッセイのサイトです。マウスの眼には、その小型サイズ（直径3.5ミリメートル程度）とその球形のために解剖することは特に困難です。この記事では詳細にRPEの全マウントをもたらす眼の解剖のための手順を示しています。この手順では、我々は目の球状構造、反対ではなく、操作する方法を示しています。簡単に言うと、結合組織、筋肉、および視神経は、眼球の後ろから削除されます。その後、角膜と水晶体が削除されます。次に、戦略的なカットが残っている組織の重要な平坦でその結果を作られています。最後に、神経網膜が優しくも、根底にある脈絡膜と強膜に接続されているそのままRPEを、明らかに、リフトオフさ。この全体のマウントは 、p 国連アッセイを実行したり、RPE組織の免疫組織化学または免疫評価のために使用することができます。

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Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

マウスの眼の解剖の正式なデモンストレーションは、網膜色素上皮の全マウントをもたらす。

網膜色素上皮の全マウントするためのマウスの眼の解剖

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

dissection-mouse-eye-for-whole-mount-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

49.0K ビュー.  Greehey Children's Cancer Research Institute and Department of Cellular and Structural Biology. マウスの眼の解剖の正式なデモンストレーションは、網膜色素上皮の全マウントをもたらす。

ビデオ: Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

網膜色素上皮生理学と病態の研究のための実験的モデル

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

神経科学

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

成人の全体のマウントの準備ショウジョウバエ</emジャイアント繊維染料注入のための>腹神経索

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

ホールマウントマッスル分析による再現性のあるマウスの坐骨神経クラッシュと再生のその後の評価

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

全マウント神経筋接合解析のための トランス対アブドミン筋 の解剖

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

マウス網膜色素上皮における遺伝子治療用ウイルスベクターの縁アプローチ、網膜下注射

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

成体マウス蝸牛のホールマウント解剖および免疫蛍光

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

大人のホールマウントの準備のためのシンプルなワンステップ解剖プロトコル<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ブレインズ

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

無条件網膜色素上皮を用いた、オルガマウス網膜の長期無血清栽培

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

CLARITY組織クリアリング法による全マウントレティナの免疫染色

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

網膜神経節細胞を研究するためのマウス網膜単離とメタノール処理

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

著者スポットライト:網膜神経節細胞の研究のためのメタノールベースのホールマウント調製  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

網膜神経節細胞の研究のためのメタノールベースのホールマウント調製

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...