初期の眼科研究は、主に死亡した個人の眼組織に依存していました。しかし、何年にもわたって、多くの眼科げっ歯類モデルが開発され、ヒト眼組織の必要性は減少しています。サイズが小さく、げっ歯類の眼の操作領域が限られているため、眼のサブパートへの効果的なアクセスは厳しく制限されています。
典型的には、げっ歯類の眼を手術するために、眼は視神経を介して固定され、解剖が行われる。この方法は骨の折れるものであり、解剖中に球形の目が動き続けるため、壊れやすい組織に損傷を与える可能性があります。網膜層の様々なセクションを単離するのに有益であるにもかかわらず、この技術は、組織の解剖時に組織の空間的配向を画定することができない。
さらに、標的介入は、後眼カップおよび前眼カップの均質な細胞集合のために、解剖後の位置を特定することが困難である。このビデオでは、マイクロダイセクションの修正された外科的方法が示されています。付着した窒化膜、または第3のまぶたの存在は、独特で重要な利点を提示する。
この方法では、最初に眼球が第3のまぶたで除核され、次に第3のまぶたを使用して眼を固定します。続いて角膜辺縁に眼球を突き刺し、切開部を入口として使用する。次に、円周に沿って切断することにより、前眼カップと後眼カップが分離されます。
後眼カップをさらに解剖することで、神経網膜の半透明層を特定し、やさしく剥がします。したがって、神経層とRPE層は、さらなる処理のために取得されます。3番目のまぶたは、眼球摘出後の空間的方向を画定することを可能にします。
詳細なステップバイステップの手順に従いましょう。0.8%トロピカミドと5%フェニレフリン点眼液の滴を使用してげっ歯類の目を拡張し、手順の前に30分間動物を暗い場所に置きます。腹腔内に5回投与される麻酔を投与することにより、動物を安楽死させる。
典型的な用量は、10mgのケタミンと1mgのキシラジンを含む200マイクロリットルのPBSです。ペダル反射を調べることにより、刺激に対する反応の完全な欠如を確認します。マウスを横臥にして、目への完全なアクセスを可能にします。
コリブリ縫合鉗子、湾曲した鉗子、15度3ミリメートルサイズのマイクロブレード、スプリングマイクロはさみ、および角度付きスプリングマイクロはさみを手順の準備をしてください。眼球の周りに湾曲した鉗子を置き、つまんで無関係な付着から目を解放します。第三まぶたは、硝化膜とも呼ばれ、鼻接線の上隅に向かって位置しており、色素性境界を有する小さな半透明の隆起として識別することができる。
次に、スプリングマイクロハサミを使用して眼球の周りを切ります。小さくて連続的なカットは、眼球を強膜アタッチメントから解放します。眼球の下に湾曲したスプリングマイクロシザーを置き、視神経を切断して目を解放します。
眼球がPBSに沈むように、摘出した眼をPBSバッファーを含むペトリ皿に入れます。一部の外眼の筋肉または組織は眼球から浮き始めます。スプリングマイクロハサミを使用して眼球からそれらを切り取ってそれらを削除します。
次に、眼球の基部から視神経を取り除き、ホールマウントの準備のために網膜をよりよく分離できるようにします。組織切片作成のために視神経を除去する必要はありません。眼球を1mlの4%パラホルムアルデヒドまたはPFAを含む1.5mlのチューブに移します。
組織固定のために摂氏4度で2時間保管してください。このステップでは、組織をPFAに摂氏4度で最大12時間放置することで一時停止することができます。ただし、生細胞の単離のためには、固定ステップを実行すべきではなく、手順全体を連続して実行する必要があります。
PFA固定後、眼球をPBSを含むペトリ皿に移し、解剖顕微鏡下に置いてその後の手順を実行します。Colibri縫合鉗子で3番目のまぶたをしっかりと押さえて眼球を固定します。辺縁は角膜強膜接合部です。
マイクロブレードを使用して穿刺することにより、縁部を小さく切開します。切開は、好ましくは第3眼瞼の反対側に行われる。次に、この切開を出発点として、マイクロシザーを使用して、この角膜強膜辺縁周に沿って小さく連続的に切り込みを入れます。
まず、切開点から3番目のまぶたまでの半円のカットを完了します。次に、反対側の残りの半円のカットを完了します。最後に、3番目のまぶたの周りに切り込みを入れて、後部カップと前まぶたを分離します。
鉗子を用いて後カップから水晶体を取り外し、神経網膜とRPE層からなる後カップと角膜前カップを得た。未固定組織で作業する場合、前部および後部カップを酵素的に消化して、角膜または網膜の単一細胞懸濁液を得ることができます。組織を固定するために、これらのカップを1mlの4%PFAを含む1.5mlのチューブに摂氏4度で12時間移します。
固定後、組織を適切な培地に包埋することができ、凍結切片またはパラフィン切片化を行って角膜切片または網膜切片を得ることができる。後部カップをPBSバッファーを含むペトリ皿に再導入します。色素性RPE層の不透明な層は神経網膜です。
2番目の鉗子を使用して神経網膜をはがします。組織を傷つけないように、非常に穏やかでわずかな手の動きを強くお勧めします。視神経出口では、湾曲したスプリングハサミを神経網膜の下に挿入することができ、神経網膜が付着したままの場合は、層を完全に解放するためにカットを行うことができます。
網膜は、柔らかいブラシで優しくなでることで解放または剥離することもできます。前部および後部カップをPBSバッファーを含むペトリ皿に再導入します。斜めのスプリングマイクロシザーを使用して、3番目のまぶたの横を周辺から光学中心に向かって垂直に切り込みを入れます。
3番目のまぶたのグリップを維持し、最初のカットの隣にカットを入れます。2番目のカットと3番目のまぶたの間に同様のカットを入れます。このような等距離のカットが3つまたは4つあり、半球形のカップが花の形に開き、平らになり、簡単に取り付けることができます。
カップの中央まで非常に深い切り込みを入れないでください、これにより葉の部分がバラバラになったり、簡単に分離したりする可能性があるためです。液体媒体は、前眼カップが湾曲した構造を達成することを可能にする。後部カップに切り込みを入れる場合と同じ手順に従って、前部カップに3つまたは4つの等距離の切り込みを入れます。
これで、組織はさらに染色する準備が整いました。この図では、前カップの全体マウントが示されています。角膜組織を記載したように微小解剖し、角膜弁尖の付着結膜組織におけるリンパ管を明らかにした。
この図では、神経網膜の全体マウントが示されています。神経網膜の網膜血管系はイソレクチンで染色され、緑色の血管として見えます。この方法では、マウスの核出眼球は、効果的で簡単な取り扱いのために第3のまぶたを取り付けて得られます。
3番目のまぶたは眼球を完全に固定し、解剖を簡単かつ最小限のエラーで進めることができます。この方法は、眼組織特異的切片、シングルセル解析、およびホールマウントに有利です。しかしながら、反復的な組織固定の必要性は、細胞培養またはそのような生細胞の必需品のために組織を生存不能にする。
したがって、この手順は、生細胞単離のために連続して実行する必要があります。
