この研究は、（国立科学JODに授与財団（OCE - 0623475）、SPC（OCE - 0623534および0727544）、およびJHC（OCE - 0727587とOCE - 0623508）でサポートされており、米海軍研究局によってJHCに授与されるN000140810654）。 KKは、デヴォンシャー財団が提供する資金で、ウッズホール海洋研究所でポスドク学者のプログラムによってサポートされています。

<ol><li>この手順を開始するには、我々はすべてのSCUVAのコンポーネントが適切に十分なバッテリーの電力、録音テープ（高精細またはHDのビデオカメラ用）、および機能を持っていることを確認してください。測定するフローに応じて、デジタル粒子画像流速測定法（DPIV）のために最良の結果が得られるビデオカメラの解像度とフレームレートを選択します。1,2 </li><li>清潔なタオルでO -リング溝とOリングをクリーニングして使用するためのレーザーとカメラハウジングを準備したり拭いてください。スプレッドの製造業者は、O -リングに均等にO -リングのグリースを提供し、ハウジングの溝にそれらを交換してください。さらに、カメラハウジングのレンズにレーザーシートの変形とマークを防止するためのレーザーとカメラのハウジングの開口部を清掃してください。 </li><li>水の完全な浴槽に空の筐体の両方を配置することにより、O -リングのシールを確認してください。加重オブジェクトは、ときに空の筐体が浮くので、水没、それらのハウジングの上部に配置する必要があります。 5〜10分後、浴槽やタオルドライしたtからハウジングを取り外します外に彼。ハウジング内部に湿気があるかどうかを確認してください。また、試験後のハウジングの水分があるかどうかを示すために、圧力のテスト中に使い捨て、紙の水分ストリップを使用することを検討してください。 </li><li>ハウジングは耐圧テストに合格した後、ハ​​ウジング内部のSCUVAのコンポーネントを配置します。 </li><li>カメラハウジングに高輝度放電（HID）ライトポッドを取り付けます。ライトは、彼らが直接前方カメラと演算子の面積を照らすように配向している、とカメラのコントロールのハンドルと操作上のグリップを維持するために干渉しないことを確認してください。 </li><li>低照度の環境では、レーザービームが適切にレーザーのハウジングに取り付けられた光学レンズと相対的に配置されていることを確認します。適切に配置する場合は、レーザー/レンズの組み合わせは、カメラハウジングに垂直に配向している光の垂直方向のシートを作成します。安全のために、レーザーシートの向きを決定するために、紙の温度感受性シートを使用してください。 </LI&gt; <li> SCUVAの添付ファイルと剛性、伸縮アームを使用して、お互いにレーザーのハウジングとカメラ筐体を接続する。ハウジングがしっかりと取り付けられていることとハウジングが互いに回転できないことを確認してください。それは、レーザーシートを測定を通してカメラの視野に垂直に配向ようにすることが重要です。 </li><li> SCUVAの電流機能により、測定のダイブは、レーザーシートと自然光の干渉を防ぐために、低照度の場所でまたは夜間で行うことができる。したがって、我々は、水に入る前に、夕暮れまで、または後で待っていることをお勧めします。 </li><li>水に入る前にカメラハウジングをオンにします。カメラハウジングは、カメラハウジング内の水分の場合には視覚的な警告を（LEDライトの点滅）を提供する、組み込みの電子水分センサーを持っています。センサーは、カメラハウジングがオンのときに動作します。 </li><li>浸し水でSCUVAと使用して自分自身に装置を取り付けライン。一度装置に接続されている、デバイスの浮力特性を決定するためにSCUVAを離します。浮力の特性に応じて、中立的な浮力を確保し、水で装置の回転を防ぐために、一方または両方のハウジングに浮力の発泡体又は鉛の重みを添付する。 </li><li>次に、レーザーのスイッチを入れ、装置が静止して保持する。ダイバーによって誘発されるフローの測定を最小限に抑えるためにダイバーから十分に遠く伸縮アームを使用してレーザーを置きます。ターゲットの近くにダイバーによって誘発されるフローの任意の測定値は、エラーを紹介し、その後の分析には使用されません。ビューのフレームのフィールドターゲットと周囲の流体まで、カメラのズームを調整します。 </li><li>装置が静止して維持しながら、粒子がシャープに表示され、焦点になるまで、レーザーシートにビデオカメラを置いています。レーザーシート面が焦点になると、マニュアルフォーカスモードにカメラを切り替える。これは、フィールドに表示される任意のオブジェクトにリフォーカスからカメラを防止しますレーザーシートでぼやけ粒子で、その結果、測定中に表示。 </li><li> SCUVAのキャリブレーションを行うには、ビューのビデオカメラの視野内でレーザシート内の既知の寸法を持つオブジェクトを置きます。数秒のための記録。ダイブした後、画像はピクセルの単位からcmにビューのサイズのフィールドを変換する校正定数を決定するためにこのビデオシーケンスから抽出されます。いつでも、オペレータは、ビューの大きさのフィールドは、ダイブ中に再位置伸縮アームやカメラのズームを変更するよう調整する場合、手順12および13が繰り返される必要があります。 </li><li>作業深さに降順でダイビングを始める。ターゲットを見つけると、環境バルク流動特性を決定する必要があります。存在する場合、現在の方向は装置と測定時のターゲットへの相対的なダイバーの位置が決まります。ターゲットを取り巻く大きな流れの方向は、気泡がダイバーから呼気観察し、その横方向の動きに注目することによって推測することができます。の泡に加えて、蛍光色素の少量（すなわち、フルオレセインは）現在の方向を決定するために解放することができます。ダイバーによって生成されたフローは、DPIVの測定誤差の原因となることができるので、ダイバーは、ターゲットの上流に配置されるべきではない。さらに、レーザーシートは、それによってDPIV誤差を最小にする、レーザーシート内の粒子の滞留時間を最大にするように電流の方向に平行に配置する必要があります。しかし、現在またはバルクフローが存在しない場合は、ターゲットへのダイバーとSCUVAの位置決め相対的に制限はありません。 </li><li>位置SCUVAが点灯し、ターゲットを周囲の流体の動きを記録する。動く標的を取り巻く流れを記録しようとする場合、最初のターゲットの位置を予測し、静止したまま、予測場所にSCUVAを置きます。ターゲットがカメラの視野内を移動する、録音を開始します。ターゲットが動かないの場合は、ビデオカメラ＆でターゲットと周囲の流体をフレーム＃x2019;静止したまま、記録を表示し、開始の秒フィールド。オペレータが誤ったDPIVの結果、これらの運動の結果以来、ビデオの録画中に回転し、面外運動は控えるべきである。したがって、測定は回転中に収集し、面外のダイバーの動きは、さらにデータ解析に使用されることはありません。 </li><li>ビデオのコレクションが完了すると、SCUVAのすべてのコンポーネントをオフにし、その後退位置にレーザーアームを復元します。水からSCUVAを外し、腕からカメラとレーザーハウジングを切り離します。すすぎや装置の錆を防止するため、乾燥する前に新鮮な水で装置を浸す。ハウジングが乾燥したら、ハウジングからコンポーネントを削除し、別のダイビングに必要な場合は、電池を再充電して交換してください。 </li><li>コンピュータにビデオカメラを接続し、HDビデオのソフトウェアパッケージ（すなわち、Adobe Premiere ProやiMovieを）使用してHDのテープからビデオを抽出する。ビデオを抽出した後、の範囲を決定するDPIV解析のための一連の画像に変換するビデオ。ピクセルのアスペクト比と抽出画像のサイズはHDビデオの設定と一致していることを確認してください。 </li><li>これらのイメージは、DPIV処理プログラム（すなわち、デイビスまたはMatPIV）にインポートされます。 DPIVのソフトウェアパッケージからプロンプトが表示されているキャリブレーション定数と画像のキャプチャパラメータを、適切に選択した後、速度場は、連続した粒子画像から生成することができます。測定の品質と種類に応じて追加の後処理の手順は、適用することもできます3。 </li></ol>代表的な結果： プロトコルが正しく行われている場合、ターゲットの周囲の粒子画像は、シャープと区別しやすくなります。 SCUVAのビデオカメラ（図1A）とDPIV処理ソフトウェアパッケージによりその場でキャプチャされた粒子のフィールドを使用して、ターゲットの周囲流れ（図1B）の速度場は明らかにされる。 velociのベクトルtyのフィールドは、ローカルの流速の大きさと方向を示します。十分なビデオは画像の時系列を提供するために収集されている場合は、速度場の時系列も調べることができる。 <img src="/files/ftp_upload/2615/2615fig1.jpg" alt="図1"/> 図1は、 アウレリアlabiataを取り巻くその場粒子のフィールド（A） で測定。流れの方向と大きさを示す黄色のベクトルと対応する速度場（B）。 <img src="/files/ftp_upload/2615/2615fig2.jpg" alt="図2"/> Mastigias SPを取り巻くその場粒子の分野では 図2。とSolmissus属 （AとB、それぞれ）。の赤の矢印は、それが困難な粒子とターゲットを区別すること、画像の彩度、その結果、高反射率、の領域を示している。 Bの赤の矢印は、その流量が結果ストリーキングの領域を示しています十分に高い周波数でサンプリングされません。

<ol>
	<li>Adrian, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-imaging+techniques+for+experimental+fluid+mechanics.">Particle-imaging techniques for experimental fluid mechanics.</a> Ann. Rev. Fluid Mech. 23, 261-304 (1991).</li><li>Willert, C. E., Gharib, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+particle+image+velocimetry.">Digital particle image velocimetry.</a> Exp. Fluids. 10, 181-193 (1991).</li><li>Raffel, M., Willert, C., Wereley, S., Kompenhans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Particle Image Velocimetry: A Practical Guide. , (2007).</li><li>Agrawal, Y. C., Pottsmith, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+diffraction+particle+sizing+in+STRESS.">Laser diffraction particle sizing in STRESS.</a> Cont. Shelf Res. 14, 1101-1121 (1994).</li><li>Katz, J., Donaghay, P. L., Zhang, J., King, S., Russell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submersible+holocamera+for+detection+of+particle+characteristics+and+motions+in+the+ocean.">Submersible holocamera for detection of particle characteristics and motions in the ocean.</a> Deep Sea Res. 46, 1455-1481 (1999).</li><li>Katija, K., Dabiri, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+field+measurements+of+aquatic+animal-fluid+interactions+using+a+self-contained+underwater+velocimetry+apparatus+(SCUVA).">In situ field measurements of aquatic animal-fluid interactions using a self-contained underwater velocimetry apparatus (SCUVA).</a> Limnol. Oceanogr.-Meth. 6, 162-171 (2008).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

フィールド内の潜在的な制約は、デジタル粒子画像流速測定法（DPIV）を実装するために必要な流れ中の粒子、が必要です。沿岸水で、浮遊粒子状物質が0.002とmm 3の 10の直径と濃度では10μm程度の大きさを示す。海洋深層水でDPIVを実行するために粒子をシードの十分なプレゼンスを確認する粒子検出のために潜水艇のholocameraを使用して、4その他の研究では、。外洋と沿岸の海のダイビング中、5、我々は粒子の密度とサイズがその場 DPIV に実施するための制約ではないことを発見した。 さておき粒子密度とサイズから、DPIVの測定に関連するもう一つの懸念は、粒子濃度の均一性です。 定性的には、尋問のウィンドウ内の領域は別のより大きな粒子の濃度、Dによって生成される速度の大きさを持っている場合PIV解析は、より高い粒子濃度で地域に偏っされます。粒子濃度の変動が最小化されている場所従って、SCUVAの測定が行われなければならない。我々はthatcle濃度は、粒子の濃度が比較的一定なダイバーが水の列の途中で中断されているダイビング中に比較的一定であるが見つかりました。しかしながら、底生生物の環境中の粒子のフィールドは、海底付近の環境やダイバーによって誘発されるフローによる粒子の再懸濁による不均一性の可能性を秘めている。ケアは、底生環境での測定の間の粒子の中断を最小限に注意する必要があります。著者らの知る限りでは、不均一な粒子濃度のフィールドによって生成されたエラーのフォーマル解析は、実験室やフィールド条件のいずれかで行われていない、と別のパブリケーションでさらに検討対象とすべきである。 準備とするとき、いくつかの異なる問題を考慮する必要がありますプロトコルを使用してその場実験で行って。録音しながら、演算子は静止したままとすべての面外回転運動を控えるように指示されます。この要求は、実際には理論的にはシンプルですが難しいですが、その測定値が正常に完了するために高度なダイビングスキルが必要です。アウトオブプレーンおよび誤ったDPIVのデータの演算結果の回転運動。しかし、面内の運動は、社内のソフトウェアを使用することで解決できます。6これは、測定効率を最大化するためにSCUVAを使用する前にいくつかのダイブを浮力のコントロールを練習するためにオペレータにお勧めします。 浮力の考慮事項に加えて、オペレータは、ターゲットの流れ方向に注意する必要があります。レーザーシートへの相対的なフローはその旅の面外は、信頼性のDPIVの結果を得られません、そして演算子は向きSCUVAは、最も効果的にこれらのフローをキャプチャする必要があります。さらに、ターゲットへの相対的なダイバーの位置はselecteにする必要がありますdは、その測定値のダイバーによる流動を最小限にするように。ダイバーによる流動は、目標流量に誤差を導入し、ダイバーの効果を含めた測定値は、さらなる分析のために使用しないでください。 ターゲットが非常に反射面を保持している場合に、ターゲットを周囲の流体領域が強く、それが難しい周囲の流体（赤の矢印、図2Aで示される領域）から近くの個々の粒子を区別すること、点灯します。フィルタや偏光板は、ビデオカメラのセンサーが捉えたレーザ光の強度を減らすためにレーザーやカメラハウジングに追加することができます。これが原因で物流の制約や機器へのアクセスを制限することができない場合は、ソフトウェアの社内で使用して画像の後処理は、画像からターゲットの近くに上昇したピクセルの輝度を減算することで十分な補正を提供することができます。 DPIVデータの品質に影響を及ぼす別の考慮事項は、粒子の縞が存在するかどうかです。粒子の場合フィールドは、ビデオカメラは、これらの高い速度を解決するために低すぎるフレームレートで記録され、（赤い矢印、図2Bで示される）縞の領域を持っている。フレームレートを増加させることにより、粒子のストリーキングを低減させることができる。しかし、光がビデオカメラのセンサーに到達するとパーティクルのフィールドの外観の調光器を作るの削減でこの結果。ビデオカメラは、絞り値の設定を設定する機能がある場合は、パーティクルのフィールドの調光を防ぐために絞り値を大きくします。最適なデバイスの設定を決定することに成功したデータの収集前にSCUVAを持つ複数のダイブが必要な場合があります。

quantitatively measuring in situ flows using a self-contained underwater velocimetry apparatus (scuva)

直接液体の環境での速度場を測定する能力は、海洋学、生態学、生物学、および流体力学など様々な分野での研究のための実証的データを提供することが必要である。フィールド測定では、このような環境条件、動物の可用性、およびフィールド互換の測定技術の必要性などの実用的な課題が生じます。これらの課題を回避するために、科学者は通常、動物、流体の相互作用を研究するために管理された実験室環境を使用してください。しかし、それは1つが研究室で測定した（フィールドで発生すること、すなわち、）自然な動作を推定できるかどうかを問うことが妥当である。したがって、 その場定量的なフローの測定で正確に彼らの自然な環境の中で動物の水泳を記述するために必要とされる。 我々は、表面への接続とは独立に動作する自己完結型、ポータブルデバイスを設計し、流れ場surrouの定量的測定を提供することができます動物をnding。この装置、自己完結型の水中速度計測装置（SCUVA）は、最大40メートルまでの深さで、単一のスキューバダイバーによって操作することができます実験室での測定値と比較すると、フィールドの条件、その他の考慮事項と準備の固有の複雑さに起因するが必要です。これらの考慮事項が含まれるが、水泳の目標、利用可能な天然の浮遊粒子、および関心の流れに相対的SCUVAの方向の位置を予測する、演算子の動きが、これらに限定されない。以下のプロトコルは、これらの共通のフィールド上の課題に対処するため、測定の成功を最大化することを目的としています。

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Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus SCUVA

このプロトコルは、その場動物によって生成されたフローでの定量化のために設計されている自己完結型水中速度計測装置（SCUVA）を、使用する方法について説明します。さらに、このプロトコルは、フィールドの条件によってもたらされる課題に対処し、そして動物の位置、およびSCUVAの方向を予測する、演算子の動きが含まれています。

定量的に測定その場で自己完結型水中速度計測装置（SCUVA）を使用してフロー

The ability to directly measure velocity fields in a fluid environment is necessary to provide empirical data for studies in fields as diverse as ...

quantitatively-measuring-situ-flows-using-self-contained-underwater

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus (SCUVA)

12.9K ビュー.  Woods Hole Oceanographic Institution. このプロトコルは、その場動物によって生成されたフローでの定量化のために設計されている自己完結型水中速度計測装置（SCUVA）を、使用する方法について説明します。さらに、このプロトコルは、フィールドの条件によってもたらされる課題に対処し、そして動物の位置、およびSCUVAの方向を予測する、演算子の動きが含まれています。

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Electrospinning Fundamentals: Optimizing Solution and Apparatus Parameters

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. Electrospinning is a process in which a charged polymer jet is collected on a grounded collector; a rapidly rotating collector results in aligned nanofibers while stationary collectors result in randomly oriented fiber mats. The polymer jet is formed when an applied electrostatic charge overcomes the surface tension of the solution. There is a minimum concentration for a given polymer, termed the critical entanglement concentration, below which a stable jet cannot be achieved and no nanofibers will form - although nanoparticles may be achieved (electrospray). A stable jet has two domains, a streaming segment and a whipping segment. While the whipping jet is usually invisible to the naked eye, the streaming segment is often visible under appropriate lighting conditions. Observing the length, thickness, consistency and movement of the stream is useful to predict the alignment and morphology of the nanofibers being formed. A short, non-uniform, inconsistent, and/or oscillating stream is indicative of a variety of problems, including poor fiber alignment, beading, splattering, and curlicue or wavy patterns. The stream can be optimized by adjusting the composition of the solution and the configuration of the electrospinning apparatus, thus optimizing the alignment and morphology of the fibers being produced. In this protocol, we present a procedure for setting up a basic electrospinning apparatus, empirically approximating the critical entanglement concentration of a polymer solution and optimizing the electrospinning process. In addition, we discuss some common problems and troubleshooting techniques.

Electrospinning techniques can create a variety of nanofibrous scaffolds for tissue engineering or other applications. We describe here a procedure to optimize the parameters of the electrospinning solution and apparatus to obtain fibers with the desired morphology and alignment. Common problems and troubleshooting techniques are also presented.

エレクトロスピニングの基礎：最適化ソリューションと装置のパラメータ

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. ...

生物工学

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

タンパク質、細胞閉じ込めのための二次元加工基板を作成する

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

マイクロ血流の速度プロファイル測定用マイクロ粒子画像流速

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an additional application for these instruments- viewing viral assemblies in a liquid environment. This exciting and novel method of visualizing biological structures utilizes a recently developed microfluidic-based specimen holder. Our video article demonstrates how to assemble and use a microfluidic holder to image liquid specimens within a TEM. In particular, we use simian rotavirus double-layered particles (DLPs) as our model system. We also describe steps to coat the surface of the liquid chamber with affinity biofilms that tether DLPs to the viewing window. This permits us to image assemblies in a manner that is suitable for 3D structure determination. Thus, we present a first glimpse of subviral particles in a native liquid environment.

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Here we describe a procedure to image viral complexes in liquid at nanometer resolution using a transmission electron microscope.

その時 液体中の生物学的集合体のTEM

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect resulting in significant reductions in systemic toxicity. Nonetheless, insufficient release of encapsulated drug from liposomes has limited their clinical efficacy. Temperature-sensitive liposomes have been engineered to provide site-specific release of drug in order to overcome the problem of limited tumor drug bioavailability. Our lab has designed and developed a heat-activated thermosensitive liposome formulation of cisplatin (CDDP), known as HTLC, to provide triggered release of CDDP at solid tumors. Heat-activated delivery in vivo was achieved in murine models using a custom-built laser-based heating apparatus that provides a conformal heating pattern at the tumor site as confirmed by MR thermometry (MRT). A fiber optic temperature monitoring device was used to measure the temperature in real-time during the entire heating period with online adjustment of heat delivery by alternating the laser power. Drug delivery was optimized under magnetic resonance (MR) image guidance by co-encapsulation of an MR contrast agent (i.e.,&#160;gadoteridol) along with CDDP into the thermosensitive liposomes as a means to validate the heating protocol and to assess tumor accumulation. The heating protocol consisted of a preheating period of 5 min prior to administration of HTLC and 20 min heating post-injection. This heating protocol resulted in effective release of the encapsulated agents with the highest MR signal change observed in the heated tumor in comparison to the unheated tumor and muscle. This study demonstrated the successful application of the laser-based heating apparatus for preclinical thermosensitive liposome development and the importance of MR-guided validation of the heating protocol for optimization of drug delivery.

AN MRI-compatible&#160;custom-designed laser-based heating apparatus has been developed to provide local heating of subcutaneous tumors in order to activate release of agents from thermosensitive liposomes specifically at the tumor region.

磁気共鳴画像誘導による感熱リポソームからのシスプラチンのトリガリリースのためのカスタム設計されたレーザーベースの加熱装置

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

粒子追跡マイクロレオロジーによりバイオフィルムの機械的特性のその場でのマッピング

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

TCR-のpMHCが結合を測定します<em&gt;その場で</em&gt; FRETベースの顕微鏡アッセイを使用して

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Apparatus for Harvesting Tissue Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns of full-thickness skin tissue. The small size of the microcolumns allows donor sites to heal quickly without causing donor site scarring, while harvesting full-thickness tissue enables the incorporation of all cellular and extracellular components of skin tissue, including those associated with deeper dermal regions and the adnexal skin structures, which have yet to be successfully reproduced using conventional tissue engineering techniques. The microcolumns can be applied directly into skin wounds to augment healing, or they can be used as the autologous cell/tissue source for other tissue engineering approaches. The harvesting needles are made by modifying standard hypodermic needles, and they can be used alone for harvesting small amounts of tissue or coupled with a simple suction-based collection system (also made from commonly available laboratory supplies) for high-volume harvesting to facilitate studies in large animal models.

Here we describe a protocol for producing harvesting needles that can be used to collect full-thickness skin tissue without causing donor site scarring. The needles can be combined with a simple collection system to achieve high-volume harvesting.

配向柱状組織を採取するための装置

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns ...

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows across a large spatiotemporal range. However, its implementation typically requires the use of expensive and specialized instrumentation, which limits its broader utility. Moreover, within the field of bioengineering, in vitro flow visualization studies are also often further limited by the high cost of commercially sourced tissue phantoms that recapitulate desired anatomical structures, particularly for those that span the mesoscale regime (i.e., submillimeter to millimeter length scales). Herein, we present a simplified experimental protocol developed to address these limitations, the key elements of which include 1) a relatively low-cost method for fabricating mesoscale tissue phantoms using 3-D printing and silicone casting, and 2) an open-source image analysis and processing framework that reduces the demand upon the instrumentation for measuring mesoscale flows (i.e., velocities up to tens of millimeters/second). Collectively, this lowers the barrier to entry for nonexperts, by leveraging resources already at the disposal of many bioengineering researchers. We demonstratethe applicability of this protocol within the context of neurovascular flow characterization; however, it is expected to be relevant to a broader range of mesoscale applications in bioengineering and beyond.

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Here we present simplified methods for fabricating transparent neurovascular phantoms and characterizing the flow therein. We highlight several important parameters and demonstrate their relationship to field accuracy.

体外メゾスケール粒子画像流速測定法研究神経血管の流れ

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows ...