このプロトコルは、ゲノム全体の方法でRNA結合タンパク質PKRのRNAインターアクターを同定する方法を提供する。RNA結合タンパク質による遺伝子発現の転写後の調節をよりよく理解するのに役立ちます。この技術の主な利点は、ホルムアルデヒドの効率的な架橋を利用してRNA結合タンパク質に結合したRNaseを固定し、免疫沈降によってそれらを豊かにすることです。
活性化されたPKRは、パーキンソン病およびアルツハイマー病などの神経変性疾患患者において観察される。PKR相互作用二本鎖RNaseを同定することは、これらの変性疾患の病因をよりよく理解するのに役立ちます。この方法は、RNA結合タンパク質のRNAインターアクターを研究するために使用することができる。
特に、この方法は、二本鎖RNaseのような構造化されたRNaseを認識するタンパク質を研究するのに役立つと考えています。細胞を収穫する前に、サイクル逮捕サンプルの均質性を確認してください。さらに、利用可能な最良の抗体を使用して免疫沈降効率を最適化することが重要です。
まず、SまたはM相逮捕サンプルの種子750、000または100万個のHeLa細胞。24時間、摂氏37度、炭酸ガス5%で細胞を成長させます。2ミリモルチミジンで細胞を治療し、摂氏37度で18時間インキュベートします。
PBSで細胞を2回洗います。その後、新鮮なメディアを追加し、9時間摂氏37度でインキュベートします。S相逮捕細胞の場合、2ミリモルチミジンで細胞を治療する。
M相逮捕細胞の場合、ノコダゾールの1ミリリットル当たり100ナノグラムの細胞を治療する。摂氏37度で15時間インキュベートします。S相サンプルの場合、細胞スクレーパーで細胞を採取し、15ミリリットルの円錐管に移します。
M相サンプルの場合、細胞培養皿の側面をタップしてM相逮捕細胞を取り外し、15ミリリットルの円錐管に移します。次に、室温で380gの細胞を3分間遠心する。上清を取り除き、冷たいPBSの1ミリリットルで細胞を再懸濁する。
細胞を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移す。セルを摂氏4度で10,000gで30秒間遠心し、上清を完全に取り除きます。ホルムアルデヒド架橋を行う場合は、まず0.1%パラホルムアルデヒドの750マイクロリットルを細胞に加え、室温で10分間インキュベートして細胞を固定します。
次いで、250マイクロリットルの1モルグリシンを加え、室温で10分間インキュベートし、反応を急がせます。細胞を摂氏4度で10,000gで30秒間遠心分離する。上清を完全に取り除く。
次に、PBSを1ミリリットルで再中断する。セルを摂氏4度で10,000gで30秒間遠心し、上清を取り除きます。0.2体積%プロテアーゼ阻害剤および2体積%RNase阻害剤を補ったfCLIPのリシスバッファーの400マイクロリットルで再懸濁。
氷の上で10分間インキュベートし、超音波処理器を使用して超音波処理を行います。次に、5モルの塩化ナトリウムを11マイクロリットル加え、塩化ナトリウム濃度を150ミリモルに調整し、渦を短時間調整します。次いで、21で遠心分離機、摂氏4度で130g、15分間。
上清を冷蔵1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。免疫沈降を行うために、まず20マイクロリットルのプロテインAビーズを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに加えます。次いで、400マイクロリットルのfCLIPライシスバッファーでビーズを洗浄します。
ビーズを摂氏4度で1,000gで1分間遠心します。次に上澄み液を取り除き、400マイクロリットルのfCLIPライシスバッファーを慎重に加え、3~4回反転してビーズを静かに再懸濁します。洗浄を3回繰り返します。
最後の洗浄後、上清を完全に取り除きます。ビーズをfCLIPライシスバッファーの300マイクロリットルに再懸濁します。塩化ナトリウム濃度を150ミリモルに調整するために、8.3マイクロリットルの塩化ナトリウムを加えます。
10マイクロリットルのプロテインキナーゼRNA活性化抗体を加え、摂氏4度で3時間回転器でインキュベートします。次に、ビーズを摂氏4度で1,000gで1分間遠心する。上清を取り除き、400マイクロリットルのfCLIP洗浄バッファーを加え、3~4回反転してビーズを静かに再懸濁します。
洗浄を2回繰り返します。最後の洗浄後、上清を完全に取り除きます。次に、300マイクロリットルのライセートを加え、3時間回転器で摂氏4度でインキュベートします。
その後、ビーズを摂氏4度で1,000gで1分間遠心する。上清を取り除き、400マイクロリットルのfCLIP洗浄バッファーを加え、3~4回反転してビーズを静かに再懸濁します。洗浄を3回繰り返します。
最後の洗浄後、上清を完全に取り除きます。次に、fCLIP溶出バッファーの300マイクロリットルを加えます。熱ミキサーで25°Cで3時間インキュベートし、ビーズからRNA活性化タンパク質キナーゼを溶出させます。
室温で1,000gで遠心分離機、清浄なシリコンチューブに上清を移す。最後に、300マイクロリットルのプロテイナーゼKを加え、摂氏65度で一晩インキュベートします。SまたはM相におけるHeLa細胞の細胞周期停止の効率をFACSを用いて検討した。
D7F7抗体は、RNA活性化タンパク質キナーゼを免疫沈殿させる優れた能力を示した。PKR免疫沈殿または全ヘラリセートのウェスタンブロット分析は、PKRの大きさに対応する1つの強いバンドのみを示し、D7F7抗体がPKRを認識する際に高度に特異的であることを示した。異なる免疫沈殿効率を有する異なるPKR抗体を用い、読み取りマップの異なるクラス分布をもたらした。
PKR共免疫沈降RNaseに対する放射性同位元素シグナルの減少は、rRNA除去に成功した際に観察された。PKR共同免疫沈降RNA試料は、陰性対照と比較してミトコンドリアRNaseの強い濃縮を示した。ストランド特異的な逆転写を用いて、SまたはM相逮捕細胞に対してPKRと共免疫沈降した重鎖ミトコンドリアRNaseを区別した。
細胞周期停止サンプルを調製する上で最も重要なステップは、PBSで細胞を2回洗浄する必要があり、均質性のために細胞パステルのみを収集しなければならないか、サンプルが損なわれる場所です。倫理的なプロセスのために、最も重要なステップはホルムアルデヒド架橋および量である。この手順の後に溶出したRNAはノーザンブロット法、qRT PCRまたはハイスループットシーケンシングを使用して分析することができる。
これらの実験は、PKRに結合したRNaseの種類および相対量を同定することができる。この技術は、RNA結合タンパク質のRNAインターアクターを研究し同定するために適用することができ、RNA結合タンパク質によって媒介される遺伝子発現の転写後調節の理解を深める。ホルムアルデヒドは危険であるため、固定、溶液、および初期洗浄バッファーは慎重に取り扱う必要があります。
