幹細胞およびその子孫を誘導性トランスジェニック系統追跡マウス系統でマーキングすることにより、in vivoにおける脳内の成体幹細胞の活性化、増殖、遊走、および/または分化の空間的および時間的分析が可能になる。系統追跡は、系統のコミットメント、介入に対する応答、および多効力に関する新しい情報を明らかにすることができる。トランスジェニック系統追跡アプローチの利点には、特定の細胞系譜をトレースする特異性、細胞の代謝回転または分化に関係なく蛍光タンパク質の消去不能な発現、ドキシシリンの低毒性、条件付き活性化、および免疫染色および免疫蛍光を含む系統痕跡組織上の一般的な下流アッセイでの使いやすさが含まれる。
成体脳における可塑性と細胞の広範な意味合いのために、成体幹細胞の特性評価と分析は、神経変性疾患の研究、脳の可塑性に対する代謝的影響、老化、およびその他の関連状態の情報を提供するのに役立ちます。開始するには、室温まで温め、氷冷アセトンで15分間固定後処理します。スライドを1Xすすぎ緩衝液中で5分間洗浄し、各工程の間に室温で毎分60回転で振とうする。
核抗原を0.3%Triton X-100で室温で10分間静置するために透過処理する。0.3%Tween-20で細胞質抗原を室温で10分間静置するために透過させる。50~100ミリリットルの1x DAKO抗原検索液中のスライドを10分間、2回、低温で電子レンジで電子レンジで包み込み、抗原検索を行います。
次に、緩衝液で室温で5分間リンスする。スライドを0.3%Typogen Black中の70%エタノール中で室温で20分間インキュベートし、その後すすぎ緩衝液で洗浄する。組織の周りに疎水性バリアを描きます。
ブロッキング試薬で摂氏37度で20分間ブロックします。抗体希釈液で希釈した一次抗体と共に摂氏4度で一晩インキュベートした。スライドを室温で10分間洗浄する。
翌日、切片をAlexa Fluor二次抗体中で室温で10分間インキュベートする。次いで、すすぎ緩衝液中でスライドを10分間2回洗浄する。AlexaFluor 488にコンジュゲートした1~500個の抗GFP抗体を100マイクロリットルで脳切片を覆い、摂氏4度で一晩インキュベートして内因性Fluor4を増強し、トレースされた細胞をマークします。
翌日、すすぎ緩衝液で2回洗浄する。そして、流したDI水で5分間洗い流します。1ミリリットルあたり100ナノグラムの4'6-ジアミジノ-2-フェニルインドールを5分間カウンターシミで染色する。
その後、流したDI水で5分間洗浄する。各組織セクションの上に蛍光安全マウント媒体を1滴加え、22ミリメートル×22ミリメートルのカバースリップでシールします。最適な信号を確保するために、取り付け当日にイメージングをお勧めします。
心経灌流後の固定および切片化を開始するには、摂氏4度で一晩4%PFAで脳を固定する。そして再び室温で1時間。1x PBSで脳を室温で1時間2回洗浄する。
矢状脳ブロックを使用して脳を厚さ1ミリメートルのセクションに切断し、1x PBSを含む5ミリリットルのマイクロ遠心管に入れます。メタノール前処理の場合は、室温で1時間2回、1x PBSで洗浄することから始めます。50%メタノール中で室温で1時間洗浄する。
80%メタノールで室温で1時間洗浄する。100%メタノール中で室温で1時間、2回洗浄する。5%過酸化水素、20%ジメチルスルホキシド、メタノールを摂氏4度で一晩漂白します。
漂白後、試料をメタノール中で1時間、室温で2回洗浄する。20%ジメチルスルホキシドとメタノール中で室温で1時間2回洗浄する。80%メタノールで室温で1時間洗浄する。
50%メタノール中で室温で1時間洗浄する。PBSで1時間、室温で2回洗浄する。PBS 0.2%Triton X-100で室温で1時間2回洗浄します。
クリアリング脳の免疫染色のために、オービタルシェーカー上で一晩摂氏37度で、1x PBS、0.2%Triton X-100、20%DMSO、0.3モルグリシン中でサンプルをインキュベートすることから始めます。1x PBS、0.2%Triton X-100、10%DMSO、6%ヤギ血清を摂氏37度で3日間、オービタルシェーカーでブロックします。ブタ粘膜からの1x PBS、0.2%Tween-20、1ミリリットルあたり10マイクログラムのヘパリンナトリウム塩でサンプルを摂氏37度で1時間2回洗浄する。
次に、1x PBS、0.2%Tween-20、1ミリリットルあたり10マイクログラムのヘパリン、5%DMSO、3%ヤギ血清中で、1〜500濃度のウサギ抗GFP AlexaFluor 488を摂氏37度でオービタルシェーカー上で2日間インキュベートする。1x PBS、0.2%Tween-20、1ミリリットルあたり10マイクログラムのヘパリンでサンプルをオービタルシェーカーで摂氏37度で1時間、その後1日1回、2日間洗浄します。サンプルを1ミリリットルの50%テトラヒドロフランと水で一晩インキュベートします。
1ミリリットルの80%THFテトラヒドロフランと水でサンプルを1時間インキュベートします。サンプルを100%テトラヒドロフラン中で1時間2回インキュベートします。滅菌ワイプでサンプルを乾燥させ、バイアルの底に沈むまでジクロロメタン中でインキュベートします。
60分以上インキュベートしないでください。透明になるまで1ミリリットルのジベンジルエーテル中でサンプルをインキュベートする。サンプルを画像化する準備ができるまで室温でジベンジルエーテルに保存します。
免疫染色された脳切片を画像化するには、複数の抗体の共発現が確認できる共焦点顕微鏡でスライドを分析します。私たちは、HyD Sハイブリッド検出器を備えたライカステラリス5顕微鏡を使用しています。クリアされた脳を画像化するには、自動ステージと自動タイリング機能を備えた倒立共焦点顕微鏡を使用します。
まず、透明な脳のセクションをガラス底の皿に平らに置き、ジベンジルエーテルに浸します。異なる脳領域および様々な細胞型にわたる蛍光強度の顕著な差は、系統トレースされた脳におけるパルス追跡期間の後に観察された。脈絡叢内の脈絡膜上皮細胞は、厚い細胞膜と、周囲の細胞と容易に区別できるテルト陽性細胞に由来することを示す強い緑色蛍光シグナルを有していた。
脈絡叢間質の他のより小さな細胞型は、より弱いGFPシグナルを有していた。小脳では、バーグマングリア細胞はバスケット細胞よりも高いレベルのGFPを発現し、GFP発現の変動も個々のバスケット細胞間で存在した。工場感覚ニューロンについては、嗅球の糸球体層内の軸索も高レベルのGFPを発現し、嗅球の糸球体層を満たす嗅覚ニューロン軸索は高レベルの膜トマトを発現し、または赤色蛍光は、同じニューロンがGFP陽性である場合でも他のほとんどの脳領域と比較すると、系統追跡中にいくつかの細胞がmTomatoシグナルをよりゆっくりと失うように見えたことを示す。
対照的に、脈絡叢ではGFP陽性細胞は発現量が少なくmTomatoであった。他のほとんどの脳領域では、トマトシグナルはほとんどの細胞型で低レベルで発現し、内皮細胞は、蛍光シグナルが脳組織の赤色蛍光の背景からはっきりと目立つほど明るい唯一の細胞の一部です。覚えておくべき最も重要なことは、クリアされた脳内の蛍光シグナルは、他のほとんどの免疫アッセイよりも速く退色することです。
サンプルは、できるだけ早く7日以内にイメージしてください。以下、脳スライスまたはクリアブレインのイメージング、GFPシグナルによるマーカーの色付け、およびFluorenceの定量化は、ソフトウェアプログラムを使用して行うことができます。
