この作品は、グランドチャレンジの探検のイニシアティブを通じた、お​​よび補助金GM062958 - 01と2R01EB002046を通じて、NIHで、ビルアンドメリンダゲイツ財団からの助成金（OPP1015402）によって賄われていた。この作業は、契約DE - AC52 - 07NA27344でローレンスリバモア国立研究所で米国エネルギー省の後援の下の部分で行われた。

1。ステージの設定<ol><li>バイオサーチテクノロジーズ（ノヴァ、CA）またはミッドランド認定（ミッドランド、テキサス州）などのカスタムオリゴヌクレオチド合成の会社から、関連する、化学的に修飾されたプローブDNAを購入する。プローブは、その3&#39;末端にC6チオールの添加とその5&#39;末端にレドックス活性メチレンブルーによる合成中に変更されます。 </li><li>リン酸塩にプローブDNAを溶かし、200μMの濃度に生理食塩水pH7.4をバッファリングし、分光光度計を用いて260 nmでの吸光度を測定することにより、その濃度を確認してください。メチレンブルー部分によるDNAプローブのソリューションは、目に見える青色の色合いを持つ必要があります。 </li><li>新たに蒸留、脱イオン水（DI水）中のトリス（2 - カルボキシエチル）ホスフィンTCEPの10mM溶液1 mLを準備する。 4℃で暗所に保存されているときに我々の経験では、これらのTCEPのソリューションは、一週間のために新鮮なまま</li><li>プローブDNAの溶液中に存在する可能性のあるジスルフィド結合を減らすために、TCEP溶液2μLとプローブDNAのストック溶液の1μLを組み合わせて、ピペットで軽く混ぜる。暗い、冷蔵コンテナで1時間混合物をインキュベートする。 TCEPは可逆的にメチレンブルーを減らすように最初は青色溶液は透明になるはず。解決策が明確にならない場合、室温で、おそらく、新鮮なTCEPのソリューションを使用して手順を繰り返すか。 </li><li>一時間後にバッファー1mLで減少したDNAプローブ溶液を希釈し、これは200nmの濃度に希釈されます。後で、この希釈プローブ溶液の200μLの部分にゴールドディスク電極のセットをインキュベートします。 </li><li>新鮮なリン酸塩で2mm mercaptohexanolの少なくとも2 mlを調製緩衝生理食塩水。 </li></ol> 2。センサーの準備<ol><li>細かい研磨布上に水で0.05ミクロンアルミナ粉を組み合わせる。濡れた布にしっかりと金表面を押すと、電極あたり約3分間8の字パターンでそれらを移動することにより、金ディスク電極（CHインスツルメンツ、オースティン、テキサス州）のセットを磨く。 </li><li> DI水で磨かれた電極をすすぎと同じでいっぱいエッペンドルフチュー​​ブにそれらを浸す。任意の残留アルミナ粉末を除去するために5分間超音波洗浄器にかけます。 </li><li> 0.5M硫酸溶液に電極を配置する、プラチナのカウンタと銀/塩化銀基準電極と一緒にポテンシオスタットに添付すること、および、酸化の削減、および電気化学的にその表面をきれいにするのボルタモグラムのシリーズを実行してください。これに続いて0.1 M硫酸中の0.01MのKClの溶液中で第二の電気化学的洗浄を行う。これらの洗浄方法の細部は、私たちの自然のプロトコル紙 1の、そしてこのビデオを補足するもので見つけることができます。 </li><li>ラックに2 mLのエッペンドルフチュー​​ブのセットを配置し、プローブDNA溶液200μLを各を埋める。この溶液中でプローブDNAの濃度は、センサー表面上にプローブDNAをパックなると密度を定義します。センサーの性能は、次の1つのセンサアーキテクチャからさまざまな最適な密度で、プローブの密度に強く依存している。このステップで使用されているプローブの濃度は、このようにセンサ2の各々の新しいタイプに最適化する必要があります。我々はこれまでに調査してプローブのアーキテクチャでは、プローブDNAの濃度は、我々は200nmが標準的な値であると、15 nMから2μmまで、この手順の範囲で採用しています。 </li><li> DI水で金ディスク電極をすすぎ、その後一時間エッペンドルフチュー​​ブ内の関連するプローブDNA溶液でそれらを浸す。この時点では、プローブDNAは、チオールオン金の自己組織化膜の形成を介して金電極表面にアタッチされます。 </li><li> DI水で電極をすすぎ、エッペンドルフチュー​​ブで2mm mercaptohexanolでそれらを浸漬し、自己組織化膜の完全な形成を確実にするために、室温で一晩に3時間暗所に保管してください。このステップでは、安定した単分子膜の形成を確保するための混合単分子膜の一部としてmercaptohexanolを内蔵しています。蒸発を防ぐためには、パラフィルムでエッペンドルフチュー​​ブに電極を封止することができます。センサーは必要に応じて数日間、このソリューションに保存することができます。 </li><li>センサーを使用する準備ができたら、DI水でそれを洗い流してから少なくとも10分間、これをバッファに浸す。抗体の検出を目的としたセンサは、バッファで洗い流し、極めて迅速に続いて、使用する前に、関連する認識の鎖の100 nM溶液に浸漬する必要があります。 </li></ol> 3。センサーのテスト、DNAの検出<ol><li>このプロトコルでは、17ヌクレオチドプローブの鎖は、金電極に固定される。それは、その3&#39;末端にメチレンブルー還元レポーター（図1）があります。プローブ分子が捕獲鎖とハイブリダイズするときは、センサ回路を流れる電流は減少する。 </li><li> DI -水と新鮮なセンサーをすすぎ、ブランクでそれを浸すそれが生成するバックグラウンドシグナルを記録するために、ターゲットを欠いているサンプル。ポテンシオスタットの作用電極のリードにセンサーを取り付けます。プラチナのカウンター電極と溶液中に銀/塩化銀参照電極を配置。 </li><li> 0〜25 mVの振幅と1mVのステップサイズと-0.6 Vに方形波の測定を実行します。最適な矩形波の周波数は、プローブのアーキテクチャ2,3の詳細に依存します。プローブのアーキテクチャのために我々は、600 Hzの範囲60に典型的には最適な値を採用している。あなたは、メチレンブルーの酸化還元電位（ピーク電位は、試験溶液の正確なpH値に応じて若干ずれる場合があります）、約-0.35 Vで丸いピークが表示されるはずです。このピークに、現在のベースラインからの高さはメチレンブルーと金電極（図2）との間の効率の電子移動に比例する。このバックグラウンド測定を保存します。 </li><li>興味のターゲットDNA分子を含む溶液に電極を移動、平衡化（5〜120分がtarget4、5の大きさ、構造および濃度に応じて）と第二方形波のvoltammagramを収集する。 -0.35 Vピークの高さは初期の、バックグラウンドの測定値から変更されます。この変化の大きさは、分析物の濃度に関係している。それは、このセンサーの主な出力データ（図3）です。 </li><li>相対的な信号の変化、減少率や背景のピークの相対シグナルの増加を、測定することは、電極の表面積の変化は、この補正するとして、多くの場合、現在の絶対的な変化を測定するよりも再現可能です。これを行うには、ピーク電流とバックグラウンドのピーク電流との差は、現在のバックグラウンドピークが分かれています。 </li></ol> 4。センサーの再生<ol><li>お使いの測定が完了したら、30秒間のためにDI水の安定した流れでそれを30秒間DI水で満たされた容器内にセンサーを移動したり、噴出新鮮な脱イオン水でこれをさらに2回繰り返します。注：いくつかの検体では、このアプローチに耐性であり、彼らのために6 M塩酸グアニジンまたは70％エタノールで洗浄積極的にしてみてください。 </li><li>測定が行われる溶液中にセンサーを戻す。分以内に、ピークの高さは元の値に戻ってくるはずです。それは、これらのセンサーは頻繁に彼らの最初のテストと再生のサイクルの間にわずかに大きい信号の変化、およびそれ以降のサイクル6で非常に一貫した結果を示すことは注目に値します。 </li></ol> 5。センサーのテスト、抗体の検出<ol><li>このプロトコルでは、これらのセンサに使用されるメチレン青とチオール修飾DNAプローブは、&quot;アンカー&quot;ストランド7のように機能します。それは、金電極に直接接続されています。これは、関連抗原（図4）に共有結合された第2、&quot;認識&quot;DNA鎖とハイブリダイズさせる。我々は、必要に応じてDNA -抗原キメラの合成のため、このようなバイオサーチテクノロジーズとPanageneなどの商用合成の家、と幸運があった。ハイブリダイゼーションのステップは、1時間PBSに関連する認識のDNA鎖の100nmを含むエッペンドルフチュー​​ブにプレハブセンサーを転送することにより行われる。 </li><li>該当するブランク溶液にセンサーを配置。ポテンシオスタットの作用電極のリードに添付し、溶液中の白金対極及び銀/塩化銀参照電極を配置。 </li><li>上記のような方形波ボルタンメトリーを実行します。特定のプローブのアーキテクチャのために我々は最適な方形波の周波数が60Hzであるここに採用されている。あなたは、-0.35の周りに丸いピークを参照してくださいV.このバックグラウンド測定を保存する必要があります。 </li><li>標的分析物を含む溶液に電極を転送する、5〜60分間インキュベート、第二方形波のvoltammagramを収集する。ターゲットの抗体が存在する場合は-0.35 Vピークが減少します。この変化の大きさは、抗体の濃度に関連しています。 </li></ol> 6。センサーのテスト、小分子の検出<ol><li>このケースでは、センサー表面上にプローブ分子は、特定の分子の分析物を結合することがin vitroで選択されているアプタマー、DNAまたはRNA分子であり、それはその標的分析物8,9に結合するとその構造（ひだ）を変更（図5）。ここでは、ストヤノビッチ10,11ラボによって開発されたコカイン結合、DNAアプタマーを採用しています。 </li><li> DI -水と新鮮なセンサーをリンスし、作成されたバックグラウンド信号を記録するために、ターゲットを欠いているブランクサンプルでそれを浸す。ポテンシオスタットの作用電極のリードにセンサーを取り付けます。プラチナのカウンタと溶液中に銀/塩化銀基準を置きます。 </li><li>上記のような方形波ボルタンメトリーを実行します。我々がここで採用されている特定のプローブのアーキテクチャに最適な方形波の周波数は、（200Hzのです。しかし、60 Hzのも動作します）。あなたは、-0.35の周りに丸いピークを参照してくださいV.このバックグラウンド測定を保存する必要があります。 </li><li>標的分析物を含む溶液に電極を転送する、〜5分間インキュベートする、と第二方形波のvoltammagramを収集する。 -0.35 Vピークの高さが変わります。この変化の大きさは、標的分析物の濃度に関係している。あなたがコカインのサンプル、プロカインを取得できない場合は、無秩序になっている使用は、代替として使用することができます。 </li></ol> 7。代表的な結果： ときに200nmのターゲットで平衡化した最初のアーキテクチャを使用してDNAを検出するために使用する場合、信号は少なくとも60％減少するはずである。脱イオン水で3簡単な洗浄した後、信号は元の値に（0.1から5パーセント以内）非常に近い返す必要があります。抗体の検出センサは、40〜80％のシグナルの減少を受けなければならない。コカインを検出するためのアプタマーベースのセンサは、それらの動作周波数と表面被覆率に応じて200％までの信号の増加を示す。コカインのセンサーの場合は、低表面被覆率は、最高の3です。 <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig1.jpg" alt="図1" /> 図1電気化学的DNAバイオセンサによるDNAの検出。 <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig2.jpg" alt="図2" /> 矩形波ボルタンメトリー中にE - DNAのバイオセンサーによって生成される信号を示す図2。スクリーンショット。 <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig3.jpg" alt="図3" /> 分析対象物とのハイブリダイゼーションの前と後、方形波ボルタンメトリー時のE - DNAのバイオセンサーによって生成された信号を示す図3。スクリーンショット。 <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。足場のバイオセンサを有する抗体の検出。 <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。電気化学的ア ​​プタマーのバイオセンサとコカインやプロカインの検出。 <table border="1"><tbody><tr><td> カスタムオリゴ </td><td> シーケンス </td><td> コメント </td></tr><tr><td>リニアプローブDNA（LP17） </td><td> 5&#39; - HS -（CH2）6 - TGGATCGGCGTTTTATT -（CH2）7 - NH - MB - 3&#39; </td><td> HPLC精製は、SSで注文することができます。 </td></tr><tr><td>標的分析物のDNA </td><td> AATAAAACGCCGATCCA </td><td>変更なし</td></tr><tr><td>認識ストランド</td><td> 5&#39; -抗原- TEG - CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG - 3&#39; </td><td></td></tr><tr><td>足場アンカー</td><td> 5&#39; - HS -（CH 2）6 - GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC -（CH 2）7 - MB </td><td> HPLC精製は、SSで注文することができます。 </td></tr><tr><td> A4コカインアプタマー</td><td> 5&#39; - HS - AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG - MethyleneBlue - 3&#39; </td><td> HPLC精製は、SSで注文することができます。 </td></tr></tbody></table>表1。プローブと標的DNA配列。

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	<li>Xiao, Y., Lai, R. Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+electrode-immobilized,+redox-modified+oligonucleotides+for+electrochemical+DNA+and+aptamer-based+sensing.">Preparation of electrode-immobilized, redox-modified oligonucleotides for electrochemical DNA and aptamer-based sensing.</a> Nat. Protocols. 2, 2875-2880 (2007).</li><li>Ricci, F., Lai, R. Y., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Sumner, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Molecular+Crowding+on+the+Response+of+an+Electrochemical+DNA+Sensor.">Effect of Molecular Crowding on the Response of an Electrochemical DNA Sensor.</a> Langmuir. 23, 6827-6834 (2007).</li><li>White, R. J., Phares, N., Lubin, A. A., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensors+via+Optimization+of+Probe+Packing+Density+and+Surface+Chemistry.">Optimization of Electrochemical Aptamer-Based Sensors via Optimization of Probe Packing Density and Surface Chemistry.</a> Langmuir. 24, 10513-10518 (2008).</li><li>Lubin, A. A., Vander Stoep Hunt, B., White, R. J., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Probe+Length,+Probe+Geometry,+and+Redox-Tag+Placement+on+the+Performance+of+the+Electrochemical+E-DNA+Sensor.">Effects of Probe Length, Probe Geometry, and Redox-Tag Placement on the Performance of the Electrochemical E-DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 2150-2158 (2009).</li><li>Lubin, A. A., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding-Based+Electrochemical+Biosensors:+The+Case+for+Responsive+Nucleic+Acid+Architectures.">Folding-Based Electrochemical Biosensors: The Case for Responsive Nucleic Acid Architectures.</a> Accounts of Chemical Research. 43, 496-505 (2010).</li><li>Lubin, A. A., Lai, R. Y., Baker, B. R., Heeger, A. J., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-Specific,+Electronic+Detection+of+Oligonucleotides+in+Blood,+Soil,+and+Foodstuffs+with+the+Reagentless,+Reusable+E-DNA+Sensor.">Sequence-Specific, Electronic Detection of Oligonucleotides in Blood, Soil, and Foodstuffs with the Reagentless, Reusable E-DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 78, 5671-5677 (2006).</li><li>Cash, K. J., Ricci, F., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electrochemical+Sensor+for+the+Detection+of+Protein?Small+Molecule+Interactions+Directly+in+Serum+and+Other+Complex+Matrices.">An Electrochemical Sensor for the Detection of Protein?Small Molecule Interactions Directly in Serum and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6955-6957 (2009).</li><li>Baker, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electronic,+Aptamer-Based+Small-Molecule+Sensor+for+the+Rapid,+Label-Free+Detection+of+Cocaine+in+Adulterated+Samples+and+Biological+Fluids.">An Electronic, Aptamer-Based Small-Molecule Sensor for the Rapid, Label-Free Detection of Cocaine in Adulterated Samples and Biological Fluids.</a> Journal of the American Chemical Society. 128, 3138-3139 (2006).</li><li>Ferapontova, E. E., Olsen, E. M., Gothelf, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA+Aptamer-Based+Electrochemical+Biosensor+for+Detection+of+Theophylline+in+Serum.">An RNA Aptamer-Based Electrochemical Biosensor for Detection of Theophylline in Serum.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 4256-4258 (2008).</li><li>Stojanovic, M. N., Landry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-Based+Colorimetric+Probe+for+Cocaine.">Aptamer-Based Colorimetric Probe for Cocaine.</a> Journal of the American Chemical Society. 124, 9678-9679 (2002).</li><li>Stojanovic, M. N., Prada, P. d. e., Landry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-Based+Folding+Fluorescent+Sensor+for+Cocaine.">Aptamer-Based Folding Fluorescent Sensor for Cocaine.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 4928-4931 (2001).</li><li>Cash, K. J., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+Reusable,+DNA+Pseudoknot-Based+Electrochemical+Sensor+for+Sequence-Specific+DNA+Detection+in+Blood+Serum.">Optimization of a Reusable, DNA Pseudoknot-Based Electrochemical Sensor for Sequence-Specific DNA Detection in Blood Serum.</a> Analytical Chemistry. 81, 656-661 (2009).</li><li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electrochemical+Sensor+for+Single+Nucleotide+Polymorphism+Detection+in+Serum+Based+on+a+Triple-Stem+DNA+Probe.">An Electrochemical Sensor for Single Nucleotide Polymorphism Detection in Serum Based on a Triple-Stem DNA Probe.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 15311-15316 (2009).</li><li>Zuo, X., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Specificity,+Electrochemical+Sandwich+Assays+Based+on+Single+Aptamer+Sequences+and+Suitable+for+the+Direct+Detection+of+Small-Molecule+Targets+in+Blood+and+Other+Complex+Matrices.">High Specificity, Electrochemical Sandwich Assays Based on Single Aptamer Sequences and Suitable for the Direct Detection of Small-Molecule Targets in Blood and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6944-6945 (2009).</li><li>Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electrochemical+Supersandwich+Assay+for+Sensitive+and+Selective+DNA+Detection+in+Complex+Matrices.">An Electrochemical Supersandwich Assay for Sensitive and Selective DNA Detection in Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 14346-14348 (2010).</li><li>Patterson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Triplex-Forming+Oligonucleotide+Probes+for+the+Reagentless,+Electrochemical+Detection+of+Double-Stranded+DNA.">Using Triplex-Forming Oligonucleotide Probes for the Reagentless, Electrochemical Detection of Double-Stranded DNA.</a> Analytical Chemistry. 82, 9109-9115 (2010).</li><li>Ferguson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Microfluidic+Electrochemical+DNA+Sensor.">Integrated Microfluidic Electrochemical DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 6503-6508 (2009).</li><li>Swensen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous,+Real-Time+Monitoring+of+Cocaine+in+Undiluted+Blood+Serum+via+a+Microfluidic,+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensor.">Continuous, Real-Time Monitoring of Cocaine in Undiluted Blood Serum via a Microfluidic, Electrochemical Aptamer-Based Sensor.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 4262-4266 (2009).</li></ol>

開示することは何もありません。

重要なノートでは、その電極が適切にクリーンアップされている場合を除き、上記の実験のいずれもが正しく動作しませんです。ここに私たちの電気化学的洗浄手順のガイドです。 CH Instrumentsのポテンショスタットで作業する場合、我々は3つのマクロプログラムのセットを使用してこれらの洗浄の手順を実行します。 フェーズゼロ（E -クリーンO） 0.5MH 2 SO 4に電極を浸漬し、ポテンシオスタットの作用電極に接続します。また、Ag / AgCl参照と白金カウンター電極を接続して、浸す。その後、酸化工程（5秒2 V）と還元工程（10秒0.35 V）で始まります。 フェーズワン（E -クリーン1） 0.35〜1.5 V（スキャンレートの4つのスキャンに続いて20 V / S 4のスキャン速度でスキャンし、0.01 Vのサンプル間隔から、同じ酸性条件下（0.5MH 2 SO 4）の下に酸化および還元のスキャンを開始する0.1 V / sと0.01 Vのサンプル間隔の）。 第二段階（E -クリーン2） すべて0.1 V S 1のスキャン速度と0.01 Vのサンプリング間隔で10セグメントに対して実行つの異なる可能性の範囲を（カバー酸性条件（0.01 M KCl/0.1 MH 2 SO 4）の下で電気化学的酸化と還元のスキャンの別のセットを行う）：0.2〜0.75 Vの（i）の潜在的な範囲、0.2〜1.0 Vまで（II）電位範囲、0.2〜1.25 Vまで（iii）の電位範囲、0.2〜1.5〜（IV）の潜在的な範囲V. 金電極の多くの種類はこれらの実験を行うために使用することができます。このようなここで用いられるような金ディスク電極に加えて、我々は微細加工、金表面、金ワイヤ、およびプリント回路基板上に金と成功を収めている。 このホワイトペーパーで説明されているセンサーと一緒に、他の多くの電気化学的DNAバイオセンサアーキテクチャが報告されている。これは、シュードノット12とセンサー、トリプルストランド13、サンドイッチ14、スーパーサンドイッチ15、または三重16アーキテクチャが含まれています。 今後は、これらのセンサをケア医療診断のポイントで使用されることを期待しています。彼らは正常にいくつかのマイクロ流体デバイス17,18に統合、および光学的分析物の検出システムに比べて多くの利点を提供している。特に、これらのセンサーは光学的に高密度で高度に自動蛍光サンプル、濁ったに機能することができます。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>ゴールドディスク電極</td><td> CHインスツルメンツ</td><td> CHI101 </td><td>再使用することができます。 </td></tr><tr><td>合成プローブDNA </td><td>バイオサーチテクノロジーズ</td><td>カスタム</td><td></td></tr><tr><td>合成ターゲットDNA </td><td>シグマジェノシス</td><td>カスタム</td><td></td></tr><tr><td> Mercaptohexanol </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 725226 - 1G </td><td>冷暗所に保管</td></tr><tr><td>白金電極</td><td>抜糸</td><td> MW - 1032 </td><td>再使用することができます。 </td></tr><tr><td> Ag / AgCl参照</td><td>抜糸</td><td> MF - 2052 </td><td>再使用することができます。 </td></tr><tr><td>研磨布</td><td>ブエラー</td><td> 40から7212 </td><td></td></tr><tr><td>アルミナポーランド語</td><td>ブエラー</td><td> 40-6325-016 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、pH7.4の緩衝化</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P7059 - 1L </td><td></td></tr><tr><td> CHインスツルメンツ605A </td><td> CHインスツルメンツ</td><td> 605A </td><td>任意のポテンシオスタットを使用してください</td></tr><tr><td>新生児ウシ血清</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> N4637 - 500ML </td><td>凍結保存</td></tr><tr><td>光度計</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> ND - 2000 </td><td>あらゆるUV - VIを使用してください</td></tr><tr><td> PCRミックス</td><td> Bio - Rad社</td><td> 170-8862 </td><td>凍結保存</td></tr><tr><td>コカイン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C5776 </td><td> DEAライセンス必須</td></tr><tr><td>プロカイン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P9879 </td><td>コカインの代用</td></tr><tr><td>抗Flag抗体</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> F1804 - 1mgの</td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication of electrochemical-dna biosensors for the reagentless detection of nucleic acids, proteins and small molecules

医学が現在実施されているとして、医師がテストのために、中央検査室に検体を送るため、結果を受け取るために数時間または数日を待つ必要があります。多くの患者がより良い迅速、ベッドサイドのテストによって提供される。この目的のために我々の研究室や他の人は核酸（DNA、RNA）、タンパク質（抗体を含む）と直接に未処理の臨床および環境試料中の低分子化合物の分析物の定量、reagentless、電気化学的検出をサポートする汎用性の高い、reagentlessバイオセンサープラットフォームを開発しました。このビデオでは、我々はこの&quot;E - DNA&quot;クラスのいくつかのバイオセンサーの作成と使用方法を示しています。特に、我々は、ポリメラーゼ連鎖反応混合物、HIV -特異的抗体と薬物のコカインの標的DNA配列の検出のためのセンサーを作製し、実証する。準備手順は、ハンズオン一晩インキュベートした努力のわずか3時間を必要とし、それらの使用はわずか数分が必要です。

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Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

&quot;E - DNA&quot;センサーは、reagentless、血液やその他の複雑なマトリックスに直接挑戦するときにもうまく機能電気化学バイオセンサーは、核酸、タンパク質と低分子化合物の分析対象物の広い範囲の検出に適応されている。ここではそのようなセンサーの製造と使用のための一般的な手順を示します。

核酸、タンパク質と低分子のReagentless検出用電気化学DNAバイオセンサーの作製

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

fabrication-electrochemical-dna-biosensors-for-reagentless-detection

Research

JoVE Journal

Bioengineering

33.1K ビュー.  University Of California Santa Barbara. "E - DNA"センサーは、reagentless、血液やその他の複雑なマトリックスに直接挑戦するときにもうまく機能電気化学バイオセンサーは、核酸、タンパク質と低分子化合物の分析対象物の広い範囲の検出に適応されている。ここではそのようなセンサーの製造と使用のための一般的な手順を示します。

ビデオ: Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic processes in simple, compact systems with no moving parts. Isotachophoresis (ITP) is a simple and very robust electrokinetic technique that can achieve million-fold preconcentration1,2 and efficient separation and extraction based on ionic mobility.3 For example, we have demonstrated the application of ITP to separation and sensitive detection of unlabeled ionic molecules (e.g. toxins, DNA, rRNA, miRNA) with little or no sample preparation4-8 and to extraction and purification of nucleic acids from complex matrices including cell culture, urine, and blood.9-12
ITP achieves focusing and separation using an applied electric field and two buffers within a fluidic channel system. For anionic analytes, the leading electrolyte (LE) buffer is chosen such that its anions have higher effective electrophoretic mobility than the anions of the trailing electrolyte (TE) buffer (Effective mobility describes the observable drift velocity of an ion and takes into account the ionization state of the ion, as described in detail by Persat et al.13). After establishing an interface between the TE and LE, an electric field is applied such that LE ions move away from the region occupied by TE ions. Sample ions of intermediate effective mobility race ahead of TE ions but cannot overtake LE ions, and so they focus at the LE-TE interface (hereafter called the "ITP interface"). Further, the TE and LE form regions of respectively low and high conductivity, which establish a steep electric field gradient at the ITP interface. This field gradient preconcentrates sample species as they focus. Proper choice of TE and LE results in focusing and purification of target species from other non-focused species and, eventually, separation and segregation of sample species.
We here review the physical principles underlying ITP and discuss two standard modes of operation: "peak" and "plateau" modes. In peak mode, relatively dilute sample ions focus together within overlapping narrow peaks at the ITP interface. In plateau mode, more abundant sample ions reach a steady-state concentration and segregate into adjoining plateau-like zones ordered by their effective mobility. Peak and plateau modes arise out of the same underlying physics, but represent distinct regimes differentiated by the initial analyte concentration and/or the amount of time allotted for sample accumulation.
We first describe in detail a model peak mode experiment and then demonstrate a peak mode assay for the extraction of nucleic acids from E. coli cell culture. We conclude by presenting a plateau mode assay, where we use a non-focusing tracer (NFT) species to visualize the separation and perform quantitation of amino acids.

Isotachophoresis (ITP) is a robust electrokinetic separation and preconcentration technique with applications ranging from toxin detection to sample preparation. We review the physical principles of ITP and the methodology of applying this technique to two specific example applications: separation and detection of small molecules and purification of nucleic acids from cell culture lysate.

イオンの分離及び核酸の精製のためのオンチップ等速電気泳動

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

生物工学

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

を光学的に検出<em&gt; E.大腸菌の</emメソポーラスケイ素バイオセンサーによる&gt;バクテリア

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

推定細胞接着分子のキャラクタリゼーションのためのビーズ凝集アッセイ

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the efficiency with which macromolecules penetrate the cytosolic space of cells. Recently, we have circumvented this problem by identifying the reagent dfTAT, a disulfide bond dimer of the peptide TAT labeled with the fluorophore tetramethylrhodamine. We have generated a fluorescently labeled dimer of the prototypical cell-penetrating peptide (CPP) TAT, dfTAT, which penetrates live cells and reaches the cytosolic space of cells with a particularly high efficiency. Cytosolic delivery of dfTAT is achieved in multiple cell lines, including primary cells. Moreover, delivery does not noticeably impact cell viability, proliferation or gene expression. dfTAT can deliver small molecules, peptides, antibodies, biologically active enzymes and a transcription factor. In this report, we describe the protocols involved in dfTAT synthesis and cellular delivery. The manuscript describes how to control the amount of protein delivered to the cytosolic space of cells by varying the amount of protein administered extracellularly. Finally, the current limitations of this new technology and steps involved in validating delivery are discussed. The described protocols should be extremely useful for cell-based assays as well as for the ex vivo manipulation and reprogramming of cells.

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

エンドソーム溶解試薬dfTATとのインキュベーションによって生細胞へのタンパク質、ペプチドまたは細胞不浸透性小分子の送達

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, significantly affecting the rate of human mortality and morbidity. Conventional methods for the detection of V. parahaemolyticus such as culture-based methods, immunological assays, and molecular-based methods require complicated sample handling and are time-consuming, tedious, and costly. Recently, biosensors have proven to be a promising and comprehensive detection method with the advantages of fast detection, cost-effectiveness, and practicality. This research focuses on developing a rapid method of detecting V. parahaemolyticus with high selectivity and sensitivity using the principles of DNA hybridization. In the work, characterization of synthesized polylactic acid-stabilized gold nanoparticles (PLA-AuNPs) was achieved using X-ray Diffraction (XRD), Ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Field-emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), and Cyclic Voltammetry (CV). We also carried out further testing of stability, sensitivity, and reproducibility of the PLA-AuNPs. We found that the PLA-AuNPs formed a sound structure of stabilized nanoparticles in aqueous solution. We also observed that the sensitivity improved as a result of the smaller charge transfer resistance (Rct) value and an increase of active surface area (0.41 cm2). The development of our DNA biosensor was based on modification of a screen-printed carbon electrode (SPCE) with PLA-AuNPs and using methylene blue (MB) as the redox indicator. We assessed the immobilization and hybridization events by differential pulse voltammetry (DPV). We found that complementary, non-complementary, and mismatched oligonucleotides were specifically distinguished by the fabricated biosensor. It also showed reliably sensitive detection in cross-reactivity studies against various food-borne pathogens and in the identification of V. parahaemolyticus in fresh cockles.

A protocol for the development of an electrochemical DNA biosensor comprising a polylactic acid-stabilized, gold nanoparticles-modified, screen-printed carbon electrode to detect Vibrio parahaemolyticus is presented.

食品由来病原体を検出する電気化学的 DNA のバイオ センサーの開発

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

キャピラリー配列で複数の核酸の視覚的検出

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

非常に小さいスペースで先端成長植物細胞の伸長機能を勉強するマイクロ流体デバイスの開発

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

長期無細胞遺伝子発現の伝導のための多層マイクロ流体プラットフォーム

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated media. In this article, we describe detailed protocols that enable the construction of nanofiber architectures in organic solvent mixtures through the self-assembly of uniquely addressable, single-stranded, gamma-modified peptide nucleic acid (&#947;PNA) tiles. Each single-stranded tile (SST) is a 12-base &#947;PNA oligomer composed of two concatenated modular domains of 6 bases each. Each domain can bind to a mutually complimentary domain present on neighboring strands using programmed complementarity to form nanofibers that can grow to microns in length. The SST motif is made of 9 total oligomers to enable the formation of 3-helix nanofibers. In contrast with analogous DNA nanostructures, which form diameter-monodisperse structures, these &#947;PNA systems form nanofibers that bundle along their widths during self-assembly in organic solvent mixtures. Self-assembly protocols described here therefore also include a conventional surfactant, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), to reduce bundling effects.

This article provides protocols for the design and self-assembly of nanostructures from gamma-modified peptide nucleic acid oligomers in organic solvent mixtures.

有機溶媒混合物中の複雑なナノ構造へのガンマ修飾ペプチド核酸の自己集合

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is accompanied by high manufacturing costs, which has brought about an interest in using alternative methods for gene delivery. Electroporation is an electro-physical, non-viral approach for the intracellular delivery of genes and other exogenous materials. Upon the application of an electric field, the cell membrane temporarily allows molecular delivery into the cell. Typically, electroporation is performed on the macroscale to process large numbers of cells. However, this approach requires extensive empirical protocol development, which is costly when working with primary and difficult-to-transfect cell types. Lengthy protocol development, coupled with the requirement of large voltages to achieve sufficient electric-field strengths to permeabilize the cells, has led to the development of micro-scale electroporation devices. These micro-electroporation devices are manufactured using common microfabrication techniques and allow for greater experimental control with the potential to maintain high throughput capabilities. This work builds off a microfluidic-electroporation technology capable of detecting the level of cell membrane permeabilization at a single-cell level under continuous flow. However, this technology was limited to 4 cells processed per second, and thus a new approach for increasing the system throughput is proposed and presented here. This new technique, denoted as cell-population-based feedback control, considers the cell permeabilization response to a variety of electroporation pulsing conditions and determines the best-suited electroporation pulse conditions for the cell type under test. A higher-throughput mode is then used, where this 'optimal' pulse is applied to the cell suspension in transit. The steps for fabricating the device, setting up and running the microfluidic experiments, and analyzing the results are presented in detail. Finally, this micro-electroporation technology is demonstrated by delivering a DNA plasmid encoding for green fluorescent protein (GFP) into HEK293 cells.

This protocol describes the microfabrication techniques required to build a lab-on-a-chip, microfluidic electroporation device. The experimental setup performs controlled, single-cell-level transfections in a continuous flow and can be extended to higher throughputs with population-based control. An analysis is provided showcasing the ability to electrically monitor the degree of cell membrane permeabilization in real-time.

透過処理検出機能付き連続フローマイクロエレクトロポレーションシステムの構築と運用

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...