Este trabajo fue financiado por una subvención (OPP1015402) de la Fundación Bill y Melinda Gates a través de la Iniciativa de Exploraciones de Grandes Desafíos, y por el NIH a través de subvenciones GM062958-01 y 2R01EB002046. Este trabajo fue realizado, en parte, bajo los auspicios del Departamento de Energía de EE.UU. por el Lawrence Livermore National Laboratory bajo el contrato DE-AC52-07NA27344.

1. Preparando el escenario <ol><li> Compra el ADN correspondiente, sin modificar químicamente la sonda de una empresa de oligonucleótidos de síntesis a medida tales como las tecnologías Biosearch (Novato, CA) o Certificado de Midland (Midland, TX). La sonda se modifica durante la síntesis de la adición de un tiol C6 en su extremo 3 &#39;y un azul de metileno redox-activa en su extremo 5&#39;. </li><li> Disolver el ADN de la sonda en tampón fosfato salino pH 7,4 a una concentración de 200 mM y verificar su concentración midiendo su absorbancia a 260 nm utilizando un espectrofotómetro. Debido a la mitad de azul de metileno en la sonda de ADN, la solución debe tener un tinte azul visible. </li><li> Recién preparar 1 ml de una solución 10 mM de tris (2-carboxietil) fosfina TCEP en agua destilada, desionizada (DI-agua). En nuestra experiencia, estas soluciones TCEP se mantienen frescos durante una semana cuando se almacena en la oscuridad a 4 ° C. </li><li> Para reducir los puentes disulfuro que pueden estar presentes en la solución de ADN de la sonda, combine 1 l de la solución de la sonda de valores de ADN con 2 l de la solución TCEP y mezclar suavemente con una pipeta. Incubar la mezcla durante una hora en un recipiente oscuro, refrigerados. La solución inicialmente azul debe quedar claro que el TCEP reversible reduce el azul de metileno. Si la solución no queda claro, repita el procedimiento usando una solución TCEP fresco o, posiblemente, a temperatura ambiente. </li><li> Después de una hora se diluye la solución de ADN de la sonda reduce con 1 ml de solución tampón, lo que va a diluir a una concentración de 200 millas náuticas. Posteriormente, se incuba una serie de electrodos de disco de oro en porciones de 200 l de esta solución diluida de la sonda. </li><li> Recién preparar por lo menos 2 ml de 2 mm mercaptohexanol en tampón fosfato salino. </li></ol> 2. Sensor de preparación <ol><li> Combine 0,05 micras de polvo de aluminio con agua en un paño fino. Polaco una serie de electrodos de disco de oro (CH Instruments, Austin, TX) presionando la superficie de oro con firmeza en la tela húmeda, y moviéndolos en forma de ocho patrones durante aproximadamente tres minutos por cada electrodo. </li><li> Enjuague los electrodos pulido con DI-agua y sumerja en tubos Eppendorf rellenas con los mismos. Sonicar durante cinco minutos para eliminar cualquier polvo de alúmina residual. </li><li> Colocar los electrodos en una solución 0,5 M de ácido sulfúrico, la fijación a un potenciostato, junto con un contador de platino y la plata / electrodo de plata cloruro de referencia, y ejecutar una serie de voltamogramas para oxidar, reducir y electroquímicamente limpien sus superficies. Después de esto realizar una segunda limpieza electroquímico en una solución de 0,01 M de KCl en 0,1 M de ácido sulfúrico. Los detalles de estos procedimientos de limpieza se pueden encontrar en nuestra naturaleza el papel Protocolos n º 1, y en el suplemento de este video. </li><li> Organizar un conjunto de 2 ml tubos Eppendorf en un rack y rellene cada uno con 200 l de la solución de ADN de la sonda. La concentración de la sonda de ADN en esta solución se define la densidad con la que la sonda de ADN de paquete en la superficie del sensor. El rendimiento del sensor es fuertemente dependiente de la densidad de la sonda, con la densidad óptima que van desde la arquitectura del sensor a la siguiente. La concentración de sonda utilizada en este paso lo que debe ser optimizado para cada nuevo tipo de sensor 2. Para las arquitecturas de la sonda se ha investigado hasta la fecha, las concentraciones de ADN de la sonda que empleamos en este rango de paso de 15 nm a 2 micras, con 200 nM de ser un valor típico. </li><li> Enjuague los electrodos de disco de oro con DI-agua, y luego sumergirlas en la solución de sondas de ADN correspondientes en un tubo Eppendorf durante una hora. En este punto, la sonda de ADN se unen a la superficie del electrodo de oro a través de la formación de una monocapa de auto-tiol en oro montado. </li><li> Enjuague los electrodos con agua DI-, lavarlos en 2 mM mercaptohexanol en un tubo Eppendorf y guárdelas en un lugar oscuro durante 3 horas a la noche a temperatura ambiente para asegurar la formación completa de la monocapa de auto-ensambladas. Este paso incluye la mercaptohexanol como parte de una monocapa mixta para garantizar la formación de una monocapa estable. Para evitar la evaporación es posible que desee para sellar el electrodo en el tubo Eppendorf con parafilm. Los sensores pueden ser almacenados en esta solución durante varios días si es necesario. </li><li> Cuando esté listo para usar el sensor, se enjuaga con agua DI-y luego en remojo en una solución tampón por lo menos durante diez minutos. Sensores destinados a la detección de anticuerpos también debe ser sumergido en una solución de 100 nm de la cadena el reconocimiento correspondiente antes de su uso, seguido de un extremadamente rápido enjuague con tampón. </li></ol> 3. Prueba de sensor, detección de ADN <ol><li> En este protocolo, una cadena de 17 nucleótidos de la sonda es colocada en un electrodo de oro. Cuenta con un reportero de azul de metileno redox en su extremo 3 &#39;(figura 1). Cuando la molécula sonda se hibrida con una cadena de captura, la corriente a través del circuito del sensor disminuye. </li><li> Enjuague un sensor nuevo con DI-agua y sumerja en un espacio en blancomuestra que carecen de la meta a fin de registrar la señal de fondo que produce. Conecte el sensor al cable del electrodo de trabajo de un potenciostato. Coloque un electrodo contador de platino y un electrodo de plata / cloruro de plata en la solución de referencia. </li><li> Ejecutar una medida de la onda cuadrada 0 a -0,6 V con una amplitud de 25 mV y un tamaño de paso de 1 mV. La frecuencia óptima de onda cuadrada dependerá de los detalles de la arquitectura de la sonda 2,3, para las arquitecturas de la sonda que han empleado los valores óptimos están típicamente en el rango de 60 a 600 Hz. Usted debe ver un pico redondeado en aproximadamente -0,35 V, el potencial redox de azul de metileno (el máximo potencial puede variar ligeramente en función del pH exacto de su solución de prueba). La altura desde la base de referencia actual para este pico es proporcional a la eficiencia de la transferencia de electrones entre el azul de metileno y el electrodo de oro (Figura 2). Guardar esta medida de fondo. </li><li> Mover los electrodos en una solución que contiene la molécula de ADN de interés objetivo, equilibrar (5 a 120 minutos dependiendo del tamaño, estructura y concentración de la target4, 5) y cobrar un voltammagram segunda onda cuadrada. La altura del pico a -0.35 V va a cambiar a partir de la medición del fondo inicial,. La magnitud de este cambio está relacionado con la concentración de la sustancia analizada. Se trata de los datos de salida principal de este sensor (Figura 3). </li><li> La medición del cambio de la señal relativa, el porcentaje de disminución o aumento de la señal en relación con el pico de fondo, es a menudo más reproducible que la medición del cambio absoluto en la actual, ya que corrige las variaciones en la superficie del electrodo. Para ello, la diferencia entre la corriente de pico y el pico de corriente de fondo están divididos por el pico de fondo actual. </li></ol> 4. Sensor de la regeneración <ol><li> Una vez que sus mediciones se completa, mueva el sensor en un recipiente lleno de agua para la DI-30 s, o de chorro con un flujo constante de agua para la DI-30 s. Repita esto dos veces más con agua desionizada fresca. Nota: algunos analitos son resistentes a este enfoque, para ellos tratar de aclarar agresiva en 6 millones de clorhidrato de guanidina o etanol al 70%. </li><li> Coloque el sensor de nuevo en una solución donde las mediciones se realizarán. En un minuto, la altura del pico debería haber vuelto a su valor original. Vale la pena señalar que estos sensores a menudo muestran un cambio de señal un poco más grande en su primera prueba y el ciclo de regeneración, y los resultados muy consistentes durante los ciclos posteriores 6. </li></ol> 5. Prueba de sensor, la detección de anticuerpos <ol><li> En este protocolo, la sonda de ADN con azul de metileno y tiol modificados utilizados en estos sensores sirve como un &quot;ancla&quot; cadena 7. Que se conecta directamente al electrodo de oro. Esta es entonces hibridado con una segunda, cadena de &quot;reconocimiento&quot; de ADN que se ha conjugado covalentemente al antígeno correspondiente (Figura 4). Hemos tenido buena suerte con la síntesis de las casas comerciales, tales como las tecnologías y Biosearch Panagene, para la síntesis del ADN de antígeno necesaria quimeras. La etapa de la hibridación se lleva a cabo mediante la transferencia de un sensor de pre-fabricados en un tubo Eppendorf que contiene 100 nM de la cadena de reconocimiento del ADN correspondiente en PBS durante 1 hora. </li><li> Coloque el sensor en la solución en blanco correspondiente. Adjuntar a la cabeza del electrodo de trabajo de un potenciostato y un lugar contraelectrodo de platino y la plata / electrodo de plata cloruro de referencia en la solución. </li><li> Realizar voltamperometría de onda cuadrada como se describió anteriormente. Para la arquitectura de la sonda en particular que hemos empleado aquí la frecuencia de onda cuadrada óptima es de 60 Hz. Usted debe ver un pico redondeado alrededor de -0,35 V. Guardar esta medida de fondo. </li><li> La transferencia de los electrodos a una solución que contiene el analito, incubar por 5 a 60 minutos, y recoger una voltammagram segunda onda cuadrada. Si el anticuerpo está presente meta el pico a -0.35 V se reducirá. La magnitud de este cambio está relacionado con la concentración de anticuerpos. </li></ol> 6. Prueba de sensor, la detección de moléculas pequeñas <ol><li> En este caso, la molécula de la sonda sobre la superficie del sensor es un aptámero, una molécula de ADN o ARN que ha sido seleccionado in vitro para enlazar un analito específico molecular, que los cambios en su estructura (pliegues) en unión a su analito 8,9 ( Figura 5). Aquí contamos con un enlace de cocaína, aptámero de ADN desarrollada por el laboratorio de 10,11 Stojanovic. </li><li> Enjuague un sensor nuevo con DI-agua y sumerja en una muestra en blanco que carecen de la meta a fin de registrar la señal de fondo que produce. Conecte el sensor al cable del electrodo de trabajo de un potenciostato. Colocar un contador de platino y una referencia de plata / cloruro de plata en la solución. </li><li> Realizar voltamperometría de onda cuadrada como se describió anteriormente. Para la arquitectura de la sonda en particular que hemos empleado aquí la frecuencia óptima de onda cuadrada es de 200Hz (Sin embargo, 60 Hz también funciona). Usted debe ver un pico redondeado alrededor de -0,35 V. Guardar esta medida de fondo. </li><li> La transferencia de los electrodos a una solución que contiene el analito, se incuba durante ~ 5 min, y cobrar un voltammagram segunda onda cuadrada. La altura del pico a -0.35 V va a cambiar. La magnitud de este cambio está relacionado con la concentración del analito. Si usted no puede obtener una muestra de la cocaína, procaína, cuyo uso no está regulada, puede ser utilizado como un sustituto. </li></ol> 7. Los resultados representativos: Cuando se utiliza para detectar el ADN utilizando la arquitectura en primer lugar, la señal debe disminuir al menos un 60% cuando se equilibra a meta 200 nm. Después de tres lavados brevemente en agua destilada, la señal debe volver muy cerca (a menos de 0,1-5%) a su valor original. Sensores de detección de anticuerpos deben ser sometidos a una disminución de la señal de 40 a 80%. Aptámero basada en sensores para la detección de cocaína muestran un aumento de la señal de hasta un 200% dependiendo de la cobertura de la frecuencia y la superficie a la que trabajan. Para el sensor de cocaína, una baja cobertura de la superficie es el mejor 3. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Detección de ADN con un biosensor de ADN electroquímico. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Captura de pantalla que muestra la señal producida por un biosensor E-ADN durante la voltamperometría de onda cuadrada. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Captura de pantalla que muestra las señales producidas por un biosensor E-ADN durante la voltamperometría de onda cuadrada, antes y después de la hibridación con un analito. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Detección de anticuerpos con un biosensor de andamios. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Detección de la cocaína o la procaína con un biosensor electroquímico aptamer. <table border="1"><tbody><tr><td> Costumbre Oligo </td><td> Secuencia </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Sonda lineal de ADN (LP17) </td><td> 5&#39;-HS-(CH2) 6-TGGATCGGCGTTTTATT-(CH2) 7-NH-MB-3 &#39; </td><td> HPLC purificada, se puede pedir con SS </td></tr><tr><td> ADN diana analito </td><td> AATAAAACGCCGATCCA </td><td> Sin modificar </td></tr><tr><td> Reconocimiento Strand </td><td> 5&#39;-antígeno-TEG-CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG-3 &#39; </td><td></td></tr><tr><td> Andamio de anclaje </td><td> 5&#39;-HS-(CH2) 6-GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC-(CH 2) 7 MB </td><td> HPLC purificada, se puede pedir con SS </td></tr><tr><td> A4 cocaína aptámero </td><td> 5&#39;-HS-AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG-MethyleneBlue-3 &#39; </td><td> HPLC purificada, se puede pedir con SS </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Sonda y secuencias de ADN diana.

<ol>
	<li>Xiao, Y., Lai, R. Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+electrode-immobilized,+redox-modified+oligonucleotides+for+electrochemical+DNA+and+aptamer-based+sensing.">Preparation of electrode-immobilized, redox-modified oligonucleotides for electrochemical DNA and aptamer-based sensing.</a> Nat. Protocols. 2, 2875-2880 (2007).</li><li>Ricci, F., Lai, R. Y., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Sumner, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Molecular+Crowding+on+the+Response+of+an+Electrochemical+DNA+Sensor.">Effect of Molecular Crowding on the Response of an Electrochemical DNA Sensor.</a> Langmuir. 23, 6827-6834 (2007).</li><li>White, R. J., Phares, N., Lubin, A. A., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensors+via+Optimization+of+Probe+Packing+Density+and+Surface+Chemistry.">Optimization of Electrochemical Aptamer-Based Sensors via Optimization of Probe Packing Density and Surface Chemistry.</a> Langmuir. 24, 10513-10518 (2008).</li><li>Lubin, A. A., Vander Stoep Hunt, B., White, R. J., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Probe+Length,+Probe+Geometry,+and+Redox-Tag+Placement+on+the+Performance+of+the+Electrochemical+E-DNA+Sensor.">Effects of Probe Length, Probe Geometry, and Redox-Tag Placement on the Performance of the Electrochemical E-DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 2150-2158 (2009).</li><li>Lubin, A. A., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding-Based+Electrochemical+Biosensors:+The+Case+for+Responsive+Nucleic+Acid+Architectures.">Folding-Based Electrochemical Biosensors: The Case for Responsive Nucleic Acid Architectures.</a> Accounts of Chemical Research. 43, 496-505 (2010).</li><li>Lubin, A. A., Lai, R. Y., Baker, B. R., Heeger, A. J., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-Specific,+Electronic+Detection+of+Oligonucleotides+in+Blood,+Soil,+and+Foodstuffs+with+the+Reagentless,+Reusable+E-DNA+Sensor.">Sequence-Specific, Electronic Detection of Oligonucleotides in Blood, Soil, and Foodstuffs with the Reagentless, Reusable E-DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 78, 5671-5677 (2006).</li><li>Cash, K. J., Ricci, F., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electrochemical+Sensor+for+the+Detection+of+Protein?Small+Molecule+Interactions+Directly+in+Serum+and+Other+Complex+Matrices.">An Electrochemical Sensor for the Detection of Protein?Small Molecule Interactions Directly in Serum and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6955-6957 (2009).</li><li>Baker, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electronic,+Aptamer-Based+Small-Molecule+Sensor+for+the+Rapid,+Label-Free+Detection+of+Cocaine+in+Adulterated+Samples+and+Biological+Fluids.">An Electronic, Aptamer-Based Small-Molecule Sensor for the Rapid, Label-Free Detection of Cocaine in Adulterated Samples and Biological Fluids.</a> Journal of the American Chemical Society. 128, 3138-3139 (2006).</li><li>Ferapontova, E. E., Olsen, E. M., Gothelf, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA+Aptamer-Based+Electrochemical+Biosensor+for+Detection+of+Theophylline+in+Serum.">An RNA Aptamer-Based Electrochemical Biosensor for Detection of Theophylline in Serum.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 4256-4258 (2008).</li><li>Stojanovic, M. N., Landry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-Based+Colorimetric+Probe+for+Cocaine.">Aptamer-Based Colorimetric Probe for Cocaine.</a> Journal of the American Chemical Society. 124, 9678-9679 (2002).</li><li>Stojanovic, M. N., Prada, P. d. e., Landry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-Based+Folding+Fluorescent+Sensor+for+Cocaine.">Aptamer-Based Folding Fluorescent Sensor for Cocaine.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 4928-4931 (2001).</li><li>Cash, K. J., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+Reusable,+DNA+Pseudoknot-Based+Electrochemical+Sensor+for+Sequence-Specific+DNA+Detection+in+Blood+Serum.">Optimization of a Reusable, DNA Pseudoknot-Based Electrochemical Sensor for Sequence-Specific DNA Detection in Blood Serum.</a> Analytical Chemistry. 81, 656-661 (2009).</li><li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electrochemical+Sensor+for+Single+Nucleotide+Polymorphism+Detection+in+Serum+Based+on+a+Triple-Stem+DNA+Probe.">An Electrochemical Sensor for Single Nucleotide Polymorphism Detection in Serum Based on a Triple-Stem DNA Probe.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 15311-15316 (2009).</li><li>Zuo, X., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Specificity,+Electrochemical+Sandwich+Assays+Based+on+Single+Aptamer+Sequences+and+Suitable+for+the+Direct+Detection+of+Small-Molecule+Targets+in+Blood+and+Other+Complex+Matrices.">High Specificity, Electrochemical Sandwich Assays Based on Single Aptamer Sequences and Suitable for the Direct Detection of Small-Molecule Targets in Blood and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6944-6945 (2009).</li><li>Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electrochemical+Supersandwich+Assay+for+Sensitive+and+Selective+DNA+Detection+in+Complex+Matrices.">An Electrochemical Supersandwich Assay for Sensitive and Selective DNA Detection in Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 14346-14348 (2010).</li><li>Patterson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Triplex-Forming+Oligonucleotide+Probes+for+the+Reagentless,+Electrochemical+Detection+of+Double-Stranded+DNA.">Using Triplex-Forming Oligonucleotide Probes for the Reagentless, Electrochemical Detection of Double-Stranded DNA.</a> Analytical Chemistry. 82, 9109-9115 (2010).</li><li>Ferguson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Microfluidic+Electrochemical+DNA+Sensor.">Integrated Microfluidic Electrochemical DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 6503-6508 (2009).</li><li>Swensen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous,+Real-Time+Monitoring+of+Cocaine+in+Undiluted+Blood+Serum+via+a+Microfluidic,+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensor.">Continuous, Real-Time Monitoring of Cocaine in Undiluted Blood Serum via a Microfluidic, Electrochemical Aptamer-Based Sensor.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 4262-4266 (2009).</li></ol>

Una nota importante es que ninguno de los experimentos descritos anteriormente funcionará correctamente a menos que los electrodos se han limpiado adecuadamente. Aquí está una guía a nuestro procedimiento de limpieza electroquímica. Cuando se trabaja con CH potenciostatos Instruments, que ejecutar estos pasos de limpieza con un conjunto de tres programas de macro. Fase Cero (E-limpia O) Sumergir los electrodos en 0.5MH 2 SO 4 y su conexión a los electrodos de trabajo de un potenciostato. También adjunte y sumergirse en una referencia Ag / AgCl y electrodo auxiliar de platino. Comienza con una etapa de oxidación (2 V por 5 s) y luego una etapa de reducción (0,35 V durante 10 s). Phase One (E-limpia 1) Iniciar la oxidación y la reducción de las exploraciones en las mismas condiciones ácidas (0.5MH 2 SO 4) 0,35 a 1,5 V (20 escanea a una velocidad de barrido de 4 V / s, y un intervalo de muestreo de 0,01 V, seguido de cuatro escanea a una velocidad de barrido de 0,1 V / s, y un intervalo de muestreo de 0,01 V). La segunda fase (E-limpia 2) Llevar a cabo otra serie de oxidación electroquímica y la reducción de las exploraciones en condiciones de acidez (0,01 M KCl/0.1 MH 2 SO 4), que abarca cuatro gamas diferentes potenciales (todos ellos realizados por 10 segmentos en una velocidad de barrido de 0,1 V s 1 y un intervalo de muestreo de 0,01 V ): (i) alcance potencial de 0,2 a 0,75 V, (ii) el rango potencial 0,2 a 1,0 V, (iii) potencial de rango 0,2 a 1,25 V, (iv) alcance potencial de 0,2 a 1,5 V. Muchos tipos de electrodos de oro se pueden utilizar para llevar a cabo estos experimentos. Además de los electrodos de disco de oro, como los que trabajan aquí, hemos tenido éxito con las superficies de oro microfabricated, hilo de oro, y oro en los tableros de circuitos impresos. Junto con los sensores descritos en este documento, muchas otras arquitecturas biosensor electroquímico de ADN han sido reportados. Esto incluye los sensores con una pseudoknot 12, capítulo 13 triples, 14 bocadillo, sandwich Super 15, o la arquitectura de triple 16. En el futuro, esperamos que estos sensores se utilizan en el punto de atención de diagnóstico médico. Se han integrado con éxito en varios dispositivos de microfluídica 17,18, y ofrecen muchas ventajas sobre los sistemas ópticos de detección de analitos. En particular, estos sensores pueden funcionar en turbio, ópticamente denso y altamente muestras auto-fluorescentes.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Los electrodos de oro en disco </td><td> CH Instrumentos </td><td> CHI101 </td><td> Pueden ser reutilizados </td></tr><tr><td> Sonda de ADN sintético </td><td> Biosearch Tecnologías </td><td> Costumbre </td><td></td></tr><tr><td> ADN sintético blanco </td><td> Sigma Genosys </td><td> Costumbre </td><td></td></tr><tr><td> Mercaptohexanol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 725226-1G </td><td> Almacenar en lugar fresco y oscuro </td></tr><tr><td> Electrodo de platino </td><td> BASI </td><td> MW-1032 </td><td> Pueden ser reutilizados </td></tr><tr><td> Ag / AgCl de referencia </td><td> BASI </td><td> MF-2052 </td><td> Pueden ser reutilizados </td></tr><tr><td> Paño de limpieza </td><td> Buehler </td><td> 40-7212 </td><td></td></tr><tr><td> Alúmina polaco </td><td> Buehler </td><td> 40-6325-016 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón fosfato buffer salino, pH 7,4 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P7059-1L </td><td></td></tr><tr><td> CH Instrumentos 605A </td><td> CH Instrumentos </td><td> 605A </td><td> Utilice cualquier potenciostato </td></tr><tr><td> Suero de ternera recién nacido </td><td> Sigma Aldrich </td><td> N4637-500ML </td><td> Almacenan congelados </td></tr><tr><td> NanoDrop </td><td> Fisher Scientific </td><td> ND-2000 </td><td> Utilice cualquier UV-Vis </td></tr><tr><td> PCR Mix </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8862 </td><td> Almacenan congelados </td></tr><tr><td> Cocaína </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C5776 </td><td> DEA requiere licencia </td></tr><tr><td> Procaína </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P9879 </td><td> Sustituto de la cocaína </td></tr><tr><td> Anticuerpo anti-Flag </td><td> Sigma Aldrich </td><td> F1804-1mg </td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication of electrochemical-dna biosensors for the reagentless detection of nucleic acids, proteins and small molecules

Como se practica actualmente la medicina, los médicos enviar las muestras a un laboratorio central de pruebas y por lo tanto hay que esperar horas o días para recibir los resultados. Muchos de los pacientes estarían mejor atendidos por las pruebas rápidas de cabecera. Para ello nuestro laboratorio y otros han desarrollado una plataforma versátil, reagentless biosensor que apoya la cuantitativa, la detección reagentless, electroquímica de los ácidos nucleicos (ADN y ARN), las proteínas (anticuerpos) y analitos pequeñas moléculas sin procesar directamente en muestras clínicas y ambientales. En este video, se demuestra la preparación y utilización de biosensores varios en este &quot;E-DNA&quot; de clase. En particular, fabricamos y demostrar sensores para la detección de una secuencia de ADN diana en una mezcla de reacción de polimerasa en cadena, un anticuerpo específicos para el VIH y la cocaína las drogas. El procedimiento de preparación sólo requiere de tres horas de práctica en el esfuerzo seguido de una incubación durante la noche, y su uso requiere sólo unos minutos.

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Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

&quot;ADN electrónico&quot; sensores, reagentless, biosensores electroquímicos que funcionan bien, incluso cuando son desafiados directamente en la sangre y otras matrices complejas, se han adaptado a la detección de una amplia gama de ácidos nucleicos, proteínas y los analitos de moléculas pequeñas. Aquí se presenta un procedimiento general para la fabricación y el uso de este tipo de sensores.

Fabricación de ADN electroquímico biosensores para la detección Reagentless de ácidos nucleicos, proteínas y moléculas pequeñas

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

fabrication-electrochemical-dna-biosensors-for-reagentless-detection

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JoVE Journal

Bioengineering

33.0K vistas.  University Of California Santa Barbara. "ADN electrónico" sensores, reagentless, biosensores electroquímicos que funcionan bien, incluso cuando son desafiados directamente en la sangre y otras matrices complejas, se han adaptado a la detección de una amplia gama de ácidos nucleicos, proteínas y los analitos de moléculas pequeñas. Aquí se presenta un procedimiento general para la fabricación y el uso de este tipo de sensores.

Video: Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic processes in simple, compact systems with no moving parts. Isotachophoresis (ITP) is a simple and very robust electrokinetic technique that can achieve million-fold preconcentration1,2 and efficient separation and extraction based on ionic mobility.3 For example, we have demonstrated the application of ITP to separation and sensitive detection of unlabeled ionic molecules (e.g. toxins, DNA, rRNA, miRNA) with little or no sample preparation4-8 and to extraction and purification of nucleic acids from complex matrices including cell culture, urine, and blood.9-12
ITP achieves focusing and separation using an applied electric field and two buffers within a fluidic channel system. For anionic analytes, the leading electrolyte (LE) buffer is chosen such that its anions have higher effective electrophoretic mobility than the anions of the trailing electrolyte (TE) buffer (Effective mobility describes the observable drift velocity of an ion and takes into account the ionization state of the ion, as described in detail by Persat et al.13). After establishing an interface between the TE and LE, an electric field is applied such that LE ions move away from the region occupied by TE ions. Sample ions of intermediate effective mobility race ahead of TE ions but cannot overtake LE ions, and so they focus at the LE-TE interface (hereafter called the "ITP interface"). Further, the TE and LE form regions of respectively low and high conductivity, which establish a steep electric field gradient at the ITP interface. This field gradient preconcentrates sample species as they focus. Proper choice of TE and LE results in focusing and purification of target species from other non-focused species and, eventually, separation and segregation of sample species.
We here review the physical principles underlying ITP and discuss two standard modes of operation: "peak" and "plateau" modes. In peak mode, relatively dilute sample ions focus together within overlapping narrow peaks at the ITP interface. In plateau mode, more abundant sample ions reach a steady-state concentration and segregate into adjoining plateau-like zones ordered by their effective mobility. Peak and plateau modes arise out of the same underlying physics, but represent distinct regimes differentiated by the initial analyte concentration and/or the amount of time allotted for sample accumulation.
We first describe in detail a model peak mode experiment and then demonstrate a peak mode assay for the extraction of nucleic acids from E. coli cell culture. We conclude by presenting a plateau mode assay, where we use a non-focusing tracer (NFT) species to visualize the separation and perform quantitation of amino acids.

Isotachophoresis (ITP) is a robust electrokinetic separation and preconcentration technique with applications ranging from toxin detection to sample preparation. We review the physical principles of ITP and the methodology of applying this technique to two specific example applications: separation and detection of small molecules and purification of nucleic acids from cell culture lysate.

El chip Isotachophoresis para separación de iones y purificación de ácidos nucleicos

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Investigación

Bioingeniería

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Detección óptica de<em&gt; E. coli</em&gt; Bacterias por mesoporosos Silicon Biosensores

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the efficiency with which macromolecules penetrate the cytosolic space of cells. Recently, we have circumvented this problem by identifying the reagent dfTAT, a disulfide bond dimer of the peptide TAT labeled with the fluorophore tetramethylrhodamine. We have generated a fluorescently labeled dimer of the prototypical cell-penetrating peptide (CPP) TAT, dfTAT, which penetrates live cells and reaches the cytosolic space of cells with a particularly high efficiency. Cytosolic delivery of dfTAT is achieved in multiple cell lines, including primary cells. Moreover, delivery does not noticeably impact cell viability, proliferation or gene expression. dfTAT can deliver small molecules, peptides, antibodies, biologically active enzymes and a transcription factor. In this report, we describe the protocols involved in dfTAT synthesis and cellular delivery. The manuscript describes how to control the amount of protein delivered to the cytosolic space of cells by varying the amount of protein administered extracellularly. Finally, the current limitations of this new technology and steps involved in validating delivery are discussed. The described protocols should be extremely useful for cell-based assays as well as for the ex vivo manipulation and reprogramming of cells.

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

La entrega de proteínas, péptidos o impermeable a las células pequeñas moléculas en células vivas por incubación con el reactivo endosomolítico dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, significantly affecting the rate of human mortality and morbidity. Conventional methods for the detection of V. parahaemolyticus such as culture-based methods, immunological assays, and molecular-based methods require complicated sample handling and are time-consuming, tedious, and costly. Recently, biosensors have proven to be a promising and comprehensive detection method with the advantages of fast detection, cost-effectiveness, and practicality. This research focuses on developing a rapid method of detecting V. parahaemolyticus with high selectivity and sensitivity using the principles of DNA hybridization. In the work, characterization of synthesized polylactic acid-stabilized gold nanoparticles (PLA-AuNPs) was achieved using X-ray Diffraction (XRD), Ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Field-emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), and Cyclic Voltammetry (CV). We also carried out further testing of stability, sensitivity, and reproducibility of the PLA-AuNPs. We found that the PLA-AuNPs formed a sound structure of stabilized nanoparticles in aqueous solution. We also observed that the sensitivity improved as a result of the smaller charge transfer resistance (Rct) value and an increase of active surface area (0.41 cm2). The development of our DNA biosensor was based on modification of a screen-printed carbon electrode (SPCE) with PLA-AuNPs and using methylene blue (MB) as the redox indicator. We assessed the immobilization and hybridization events by differential pulse voltammetry (DPV). We found that complementary, non-complementary, and mismatched oligonucleotides were specifically distinguished by the fabricated biosensor. It also showed reliably sensitive detection in cross-reactivity studies against various food-borne pathogens and in the identification of V. parahaemolyticus in fresh cockles.

A protocol for the development of an electrochemical DNA biosensor comprising a polylactic acid-stabilized, gold nanoparticles-modified, screen-printed carbon electrode to detect Vibrio parahaemolyticus is presented.

Desarrollo de un Biosensor de ADN electroquímico para la detección de un patógeno de transmisión alimentaria

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

Detección visual de los ácidos nucleicos múltiples en un arreglo de capilares

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

Desarrollo de dispositivos microfluídicos para estudiar la capacidad de elongación de la punta de crecimiento de las células vegetales en espacios extremadamente pequeños

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

Una plataforma microfluídica multicapa para la conducción de la expresión génica sin células prolongada

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated media. In this article, we describe detailed protocols that enable the construction of nanofiber architectures in organic solvent mixtures through the self-assembly of uniquely addressable, single-stranded, gamma-modified peptide nucleic acid (&#947;PNA) tiles. Each single-stranded tile (SST) is a 12-base &#947;PNA oligomer composed of two concatenated modular domains of 6 bases each. Each domain can bind to a mutually complimentary domain present on neighboring strands using programmed complementarity to form nanofibers that can grow to microns in length. The SST motif is made of 9 total oligomers to enable the formation of 3-helix nanofibers. In contrast with analogous DNA nanostructures, which form diameter-monodisperse structures, these &#947;PNA systems form nanofibers that bundle along their widths during self-assembly in organic solvent mixtures. Self-assembly protocols described here therefore also include a conventional surfactant, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), to reduce bundling effects.

This article provides protocols for the design and self-assembly of nanostructures from gamma-modified peptide nucleic acid oligomers in organic solvent mixtures.

Autoensamble de ácidos nucleicos de péptidos modificados con gamma en nanoestructuras complejas en mezclas de disolventes orgánicos

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is accompanied by high manufacturing costs, which has brought about an interest in using alternative methods for gene delivery. Electroporation is an electro-physical, non-viral approach for the intracellular delivery of genes and other exogenous materials. Upon the application of an electric field, the cell membrane temporarily allows molecular delivery into the cell. Typically, electroporation is performed on the macroscale to process large numbers of cells. However, this approach requires extensive empirical protocol development, which is costly when working with primary and difficult-to-transfect cell types. Lengthy protocol development, coupled with the requirement of large voltages to achieve sufficient electric-field strengths to permeabilize the cells, has led to the development of micro-scale electroporation devices. These micro-electroporation devices are manufactured using common microfabrication techniques and allow for greater experimental control with the potential to maintain high throughput capabilities. This work builds off a microfluidic-electroporation technology capable of detecting the level of cell membrane permeabilization at a single-cell level under continuous flow. However, this technology was limited to 4 cells processed per second, and thus a new approach for increasing the system throughput is proposed and presented here. This new technique, denoted as cell-population-based feedback control, considers the cell permeabilization response to a variety of electroporation pulsing conditions and determines the best-suited electroporation pulse conditions for the cell type under test. A higher-throughput mode is then used, where this 'optimal' pulse is applied to the cell suspension in transit. The steps for fabricating the device, setting up and running the microfluidic experiments, and analyzing the results are presented in detail. Finally, this micro-electroporation technology is demonstrated by delivering a DNA plasmid encoding for green fluorescent protein (GFP) into HEK293 cells.

This protocol describes the microfabrication techniques required to build a lab-on-a-chip, microfluidic electroporation device. The experimental setup performs controlled, single-cell-level transfections in a continuous flow and can be extended to higher throughputs with population-based control. An analysis is provided showcasing the ability to electrically monitor the degree of cell membrane permeabilization in real-time.

La fabricación y operación de un sistema de microelectroporación de flujo continuo con detección de permeabilización

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...

Experimental and Data Analysis Workflow for Soft Matter Nanoindentation

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft biomaterials and cells. This approach has gained a central role in the fields of mechanobiology, biomaterials design&#160;and tissue engineering, to obtain a proper mechanical characterization of soft materials with a resolution comparable to the size of single cells (&#956;m). The most popular strategy to acquire such experimental data is to employ an atomic force microscope (AFM); while this instrument offers an unprecedented resolution in force (down to pN) and space (sub-nm), its usability is often limited by its complexity that prevents routine measurements of integral indicators of mechanical properties, such as Young&#39;s Modulus (E). A new generation of nanoindenters, such as those based on optical fiber sensing technology, has recently gained popularity for its ease of integration while allowing to apply sub-nN forces with &#181;m spatial resolution, therefore being suitable to probe local mechanical properties of hydrogels and cells.
In this protocol, a step-by-step guide detailing the experimental procedure to acquire nanoindentation data on hydrogels and cells using a commercially available ferrule-top optical fiber sensing nanoindenter is presented. Whereas some steps are specific to the instrument used herein, the proposed protocol can be taken as a guide for other nanoindentation devices, granted some steps are adapted according to the manufacturer&#39;s guidelines. Further, a new open-source Python software equipped with a user-friendly graphical user interface for the analysis of nanoindentation data is presented, which allows for screening of incorrectly acquired curves, data filtering, computation of the contact point through different numerical procedures, the conventional computation of E, as well as a more advanced analysis particularly suited for single-cell nanoindentation data.

The protocol presents a complete workflow for soft material nanoindentation experiments, including hydrogels and cells. First, the experimental steps to acquire force spectroscopy data are detailed; then, the analysis of such data is detailed through a newly developed open-source Python software, which is free to download from GitHub.

Flujo de trabajo experimental y de análisis de datos para nanoindentación de materia blanda

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft ...