Ce travail a été financé par une subvention (OPP1015402) de la Fondation Bill and Melinda Gates Foundation à travers la Challenges Explorations Initiative Grand, et par le biais de subventions des NIH GM062958-01 et 2R01EB002046. Ce travail a été exécuté en partie sous les auspices du Département américain de l&#39;énergie par le Lawrence Livermore National Laboratory en vertu du contrat DE-AC52-07NA27344.

1. Préparer le terrain <ol><li> Acheter le pertinentes, sonde d&#39;ADN modifié chimiquement par une société synthèse d&#39;oligonucléotides personnalisés tels que Biosearch Technologies (Novato, Californie) ou Midland Certified (Midland, TX). La sonde est modifiée lors de la synthèse par l&#39;ajout d&#39;un thiol C6 à sa extrémité 3 &#39;et un bleu de méthylène redox-actif à son extrémité 5&#39;. </li><li> Dissoudre la sonde d&#39;ADN dans un tampon phosphate salin pH 7,4 à une concentration de 200 uM et de vérifier sa concentration en mesurant son absorbance à 260 nm avec un spectrophotomètre. En raison de la fraction du bleu de méthylène sur la sonde d&#39;ADN de la solution doit avoir une teinte bleue visible. </li><li> Fraîchement préparer 1 mL d&#39;une solution 10 mM de tris (2-carboxyéthyl) phosphine PTCE dans l&#39;eau distillée, eau déminéralisée (eau déminéralisée). Dans notre expérience, ces solutions restent fraîches PTCE une semaine lorsque stockés dans l&#39;obscurité à 4 ° C. </li><li> Afin de réduire toute ponts disulfures qui pourraient être présents dans la solution d&#39;ADN de sonde, combinez 1 pl de la solution stock sonde d&#39;ADN avec 2 ul de la solution PTCE et mélanger doucement avec une pipette. Incuber le mélange pendant une heure dans un endroit sombre, conteneur réfrigéré. La solution initialement bleue devrait devenir claire que le PTCE réduit de façon réversible le bleu de méthylène. Si la solution ne devient pas claire, répéter la procédure en utilisant une solution PTCE frais ou, éventuellement, à la température ambiante. </li><li> Après une heure de diluer la solution d&#39;ADN réduite sonde avec 1 ml de tampon, ce sera le diluer à une concentration de 200nm. Plus tard, vous aurez incuber un ensemble d&#39;électrodes à disque d&#39;or en portions de 200 ul de cette solution diluée de sonde. </li><li> Fraîchement préparer au moins 2 ml de 2mm mercaptohexanol en tampon phosphate salin. </li></ol> 2. Préparation du capteur <ol><li> Combinez 0,05 microns de poudre d&#39;alumine avec de l&#39;eau sur un chiffon de polissage fines. Pologne un ensemble d&#39;électrodes disque d&#39;or (CH Instruments, Austin, TX) en appuyant sur la surface d&#39;or fermement dans le tissu humide, et en les déplaçant dans un modèle à huit chiffres pour environ trois minutes par électrode. </li><li> Rincer les électrodes polies avec de l&#39;eau déminéralisée et de les immerger dans des tubes Eppendorf remplis de la même chose. Soniquer pendant cinq minutes pour enlever tout résidu de poudre d&#39;alumine. </li><li> Placer les électrodes dans une solution 0,5 M d&#39;acide sulfurique, de les joindre à un potentiostat avec un compteur de platine et argent / chlorure d&#39;électrode de référence, et d&#39;exécuter une série de voltampérogrammes à s&#39;oxyder, réduire, et électrochimiquement nettoyer leurs surfaces. Suite à cette effectuer un second nettoyage électrochimique dans une solution de 0,01 M de KCl à 0,1 M d&#39;acide sulfurique. Les détails les plus fins de ces procédures de nettoyage peut être trouvé dans notre nature Protocoles papier 1, et dans le supplément à cette vidéo. </li><li> Disposer d&#39;un ensemble de deux tubes Eppendorf ml dans un rack et remplissez chacune avec 200 ul de la solution d&#39;ADN sonde. La concentration de l&#39;ADN sonde dans cette solution va définir la densité avec laquelle la sonde ADN paquet sur la surface du capteur. Les performances du capteur est fortement dépendante de la densité de sonde, avec la densité optimale varie d&#39;une architecture de capteurs à l&#39;autre. La concentration de sonde utilisés à cette étape devrait donc être optimisé pour chaque nouveau type de capteur 2. Pour les architectures de sonde que nous avons étudiés à ce jour, les concentrations d&#39;ADN de sonde, nous comptons dans cette gamme étape à partir de 15 nm à 2 pm, avec 200 Nm étant une valeur typique. </li><li> Rincer les électrodes à disque d&#39;or avec de l&#39;eau déminéralisée, puis les immerger dans la solution d&#39;ADN sonde pertinentes dans un tube Eppendorf pendant une heure. À ce stade, l&#39;ADN sonde joindre à la surface de l&#39;électrode d&#39;or par la formation d&#39;une monocouche auto thiol-sur-or assemblés. </li><li> Rincez les électrodes avec de l&#39;eau déminéralisée, les plonger dans 2mM mercaptohexanol dans un tube Eppendorf et les stocker dans un endroit sombre pendant 3 heures à une nuit à température ambiante afin d&#39;assurer la formation complète de la monocouche auto-assemblées. Cette étape intègre les mercaptohexanol dans le cadre d&#39;une monocouche mixte pour assurer la formation d&#39;une monocouche stable. Pour éviter l&#39;évaporation, vous voudrez peut-être pour sceller l&#39;électrode dans le tube Eppendorf avec du parafilm. Les capteurs peuvent être stockés dans cette solution pendant plusieurs jours si nécessaire. </li><li> Lorsque vous êtes prêt à utiliser le capteur, le rincer avec de l&#39;eau déminéralisée puis le tremper dans le tampon d&#39;au moins dix minutes. Capteurs destinés à la détection d&#39;anticorps doit également être immergées dans une solution 100 nM du brin de reconnaissance pertinentes avant de l&#39;utiliser, rapidement suivie par une très rincer avec de la mémoire tampon. </li></ol> 3. Test du capteur, détection de l&#39;ADN <ol><li> Dans ce protocole, un brin 17 sonde nucléotidique est apposée sur une électrode en or. Il a une journaliste de méthylène bleu redox à sa extrémité 3 &#39;(figure 1). Lorsque la molécule sonde s&#39;hybride avec un brin capture, le courant à travers le circuit du capteur diminue. </li><li> Rincez un capteur frais avec de l&#39;eau déminéralisée et le plonger dans un videl&#39;échantillon manquant la cible afin d&#39;enregistrer le signal de fond qu&#39;il produit. Fixez le capteur à la tête électrode de travail d&#39;un potentiostat. Placez une contre-électrode de platine et une électrode d&#39;argent / chlorure d&#39;argent dans la solution de référence. </li><li> Exécuter une mesure d&#39;ondes carrées de 0 à -0,6 V avec une amplitude de 25 mV et une taille de pas de 1mV. La fréquence de l&#39;onde optimale carrés dépendra des détails de l&#39;architecture de sonde 2,3; pour les architectures de sonde que nous avons employé les valeurs optimales sont typiquement dans la gamme 60 à 600 Hz. Vous devriez voir un pic arrondi à environ -0,35 V, le potentiel redox de bleu de méthylène (le potentiel de pointe peuvent changer légèrement selon le pH de votre solution précise de test). La hauteur de référence actuelle à ce pic est proportionnelle à la l&#39;efficacité de transfert d&#39;électrons entre le bleu de méthylène et l&#39;électrode en or (figure 2). Sauvegarder cette mesure initiale. </li><li> Déplacez les électrodes à une solution qui contient la molécule d&#39;ADN cible d&#39;intérêt, à équilibrer (5 à 120 mn selon la taille, la structure et la concentration des target4, 5) et de percevoir un voltammagram deuxième vague carrée. La hauteur du pic à -0,35 V va changer à partir de la mesure de fond, initiales. L&#39;ampleur de ce changement est lié à la concentration de l&#39;analyte. C&#39;est la sortie des données principales de ce capteur (figure 3). </li><li> Mesurer le changement de signal relatif, le pourcentage de diminution ou d&#39;augmentation du signal par rapport au pic de fond, est souvent plus reproductible que la mesure de la variation absolue de courant, car cela corrige les variations de la surface de l&#39;électrode. Pour ce faire, la différence entre le courant de crête et le courant de crête de fond sont divisées par le pic de courant de fond. </li></ol> 4. Régénération du capteur <ol><li> Une fois que vos mesures sont terminées, placez le capteur dans un récipient rempli d&#39;eau déminéralisée pendant 30 s, ou gicler c&#39;est avec un flux régulier de l&#39;eau déminéralisée pendant 30 s. Répétez ceci deux fois plus avec de l&#39;eau déminéralisée fraîche. Remarque: certains analytes sont résistantes à cette approche, car les essayer agressive de rinçage dans le chlorhydrate de guanidine 6 M ou de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Placez le capteur de retour dans une solution où les mesures seront prises. En une minute, la hauteur du pic aurait dû retourner à sa valeur initiale. Il est à noter que ces capteurs présentent souvent un changement de signal légèrement plus grande au cours de leur premier test et le cycle de régénération, et des résultats très cohérents au cours des cycles ultérieurs 6. </li></ol> 5. Test du capteur, la détection d&#39;anticorps <ol><li> Dans ce protocole, la sonde d&#39;ADN au bleu de méthylène et de thiols modifiés utilisés dans ces capteurs sert une &quot;ancre&quot; brin 7. Il est rattaché directement à l&#39;électrode d&#39;or. Ceci est ensuite hybridée avec une deuxième brin d&#39;ADN «reconnaissance» qui a été conjugué de façon covalente à l&#39;antigène pertinents (figure 4). Nous avons eu de la chance avec ses maisons synthèse commerciale, tels que Biosearch Technologies et Panagene, pour la synthèse de l&#39;ADN de l&#39;antigène nécessaire chimères. L&#39;étape d&#39;hybridation est effectuée par le transfert d&#39;un capteur de pré-fabriqués dans un tube Eppendorf contenant 100 nM de brin d&#39;ADN de reconnaissance pertinents dans du PBS pendant 1 heure. </li><li> Placez le capteur dans la solution pertinente vierge. Attachez-le à la tête de l&#39;électrode de travail d&#39;un potentiostat et placer une contre-électrode de platine et argent / électrode de référence de chlorure dans la solution. </li><li> Effectuer voltamétrie à onde carrée comme décrit ci-dessus. Pour l&#39;architecture sonde particulière que nous avons employé ici la fréquence optimale d&#39;onde carrée est de 60 Hz. Vous devriez voir un pic arrondi autour de -0,35 V. Enregistrer cette mesure de fond. </li><li> Transfert des électrodes dans une solution contenant l&#39;analyte cible, incuber pendant 5 à 60 min, et de recueillir une seconde vague voltammagram carrés. Si l&#39;anticorps cible est présente le pic à -0,35 V va diminuer. L&#39;ampleur de ce changement est lié à la concentration d&#39;anticorps. </li></ol> 6. Test du capteur, la détection de molécules petites <ol><li> Dans ce cas, la molécule sonde sur la surface du capteur est un aptamère, un molécule d&#39;ADN ou d&#39;ARN qui a été sélectionné in vitro pour lier un analyte spécifique moléculaire, que les changements de sa structure (plis) lors de la liaison à son analyte cible 8,9 ( Figure 5). Ici nous employons un aptamère cocaïne liaison à l&#39;ADN, développé par le laboratoire de 10,11 Stojanovic. </li><li> Rincez un capteur frais avec de l&#39;eau déminéralisée et le plonger dans un échantillon blanc manquent la cible afin d&#39;enregistrer le signal de fond qu&#39;il produit. Fixez le capteur à la tête électrode de travail d&#39;un potentiostat. Placer un compteur de platine et une référence en argent / chlorure d&#39;argent dans la solution. </li><li> Effectuer voltamétrie à onde carrée comme décrit ci-dessus. Pour l&#39;architecture sonde particulière que nous avons employé ici la fréquence des ondes optimale carré est de 200Hz (Mais 60 Hz fonctionne aussi). Vous devriez voir un pic arrondi autour de -0,35 V. Enregistrer cette mesure de fond. </li><li> Transfert des électrodes dans une solution contenant l&#39;analyte cible, incuber pendant ~ 5 min, et de recueillir une seconde vague voltammagram carrés. La hauteur du pic à -0,35 V va changer. L&#39;ampleur de ce changement est lié à la concentration de l&#39;analyte cible. Si vous ne pouvez pas obtenir un échantillon de la cocaïne, la procaïne, dont l&#39;utilisation n&#39;est pas réglementée, peut être utilisé comme un substitut. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs: Quand il est utilisé pour détecter l&#39;ADN en utilisant l&#39;architecture d&#39;abord, le signal devrait diminuer d&#39;au moins 60% lorsque l&#39;équilibre à une cible de 200 nM. Après trois rinçages brève dans l&#39;eau déminéralisée, le signal devrait revenir très proche (dans 0,1-5%) à sa valeur initiale. Capteurs de détection d&#39;anticorps devraient subir une baisse de signal de 40 à 80%. Aptamères à base de capteurs pour la détection de la cocaïne présentent une augmentation du signal de jusqu&#39;à 200% selon la fréquence et la couverture de surface au cours de laquelle ils opèrent. Pour le capteur de la cocaïne, une couverture de surface faible est le meilleur 3. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Détection de l&#39;ADN avec un biocapteur ADN électrochimique. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Capture d&#39;écran la figure 2. Montrant le signal produit par un biocapteur E-ADN au cours de la voltamétrie à onde carrée. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Capture d&#39;écran la figure 3. Montrant les signaux produits par un biocapteur E-ADN au cours de la voltamétrie à onde carrée, avant et après hybridation avec un analyte. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Détection des anticorps avec un biocapteur échafaud. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Détection de cocaïne ou de la procaïne avec un biocapteur électrochimique aptamère. <table border="1"><tbody><tr><td> Oligo personnalisé </td><td> Séquence </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Linéaire sondes à ADN (LP17) </td><td> 5&#39;-HS-(CH2) 6-TGGATCGGCGTTTTATT-(CH2) 7-NH-MB-3 &#39; </td><td> Purifiée par HPLC, peut être commandé avec SS </td></tr><tr><td> L&#39;ADN analyte cible </td><td> AATAAAACGCCGATCCA </td><td> Unmodified </td></tr><tr><td> Reconnaissance Strand </td><td> 5&#39;-antigène-TEG-CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG-3 &#39; </td><td></td></tr><tr><td> Échafaudage Anchor </td><td> 5&#39;-HS-(CH 2) 6-GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC-(CH2) 7-MB </td><td> Purifiée par HPLC, peut être commandé avec SS </td></tr><tr><td> A4 cocaïne aptamères </td><td> 5&#39;-HS-AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG-MethyleneBlue-3 &#39; </td><td> Purifiée par HPLC, peut être commandé avec SS </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Probe et séquences d&#39;ADN cible.

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	<li>Xiao, Y., Lai, R. Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+electrode-immobilized,+redox-modified+oligonucleotides+for+electrochemical+DNA+and+aptamer-based+sensing.">Preparation of electrode-immobilized, redox-modified oligonucleotides for electrochemical DNA and aptamer-based sensing.</a> Nat. Protocols. 2, 2875-2880 (2007).</li><li>Ricci, F., Lai, R. Y., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Sumner, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Molecular+Crowding+on+the+Response+of+an+Electrochemical+DNA+Sensor.">Effect of Molecular Crowding on the Response of an Electrochemical DNA Sensor.</a> Langmuir. 23, 6827-6834 (2007).</li><li>White, R. J., Phares, N., Lubin, A. A., Xiao, Y., Plaxco, K. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Microfluidic+Electrochemical+DNA+Sensor.">Integrated Microfluidic Electrochemical DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 6503-6508 (2009).</li><li>Swensen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous,+Real-Time+Monitoring+of+Cocaine+in+Undiluted+Blood+Serum+via+a+Microfluidic,+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensor.">Continuous, Real-Time Monitoring of Cocaine in Undiluted Blood Serum via a Microfluidic, Electrochemical Aptamer-Based Sensor.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 4262-4266 (2009).</li></ol>

Une remarque importante est que aucun des expériences décrites ci-dessus fonctionnera correctement si les électrodes ont été correctement nettoyé. Voici un guide à notre procédure de nettoyage électrochimique. Lorsque vous travaillez avec potentiostats Instruments CH, nous exécuter ces étapes de nettoyage en utilisant un ensemble de trois programmes de macro. Phase Zéro (E-propre O) Plonger les électrodes dans 0.5MH 2 SO 4 et de les connecter à des électrodes de travail d&#39;un potentiostat. Également joindre et plonger une référence Ag / AgCl et contre-électrode de platine. Commencez avec une étape d&#39;oxydation (2 V pendant 5 s), puis une étape de réduction (0,35 V pendant 10 s). Phase One (E-propre 1) Initier l&#39;oxydation et de réduction de scans dans les mêmes conditions acides (0.5MH 2 SO 4) 0,35 à 1,5 V (20 numérise à une vitesse de balayage de 4 V / s et un intervalle d&#39;échantillonnage de 0,01 V, suivie par quatre numérise à une vitesse de balayage de 0,1 V / s et un intervalle d&#39;échantillonnage de 0,01 V). Phase Deux (E-nettoyage 2) Effectuer une autre série d&#39;oxydation électrochimique et scans de réduction dans des conditions acides (0,01 M KCl/0.1 MH 2 SO 4) couvrant quatre différentes gammes potentielles (toutes réalisées pour 10 segments à une vitesse de balayage de 0,1 V s 1 et un intervalle d&#39;échantillonnage de 0,01 V ): (i) portée potentielle de 0,2 à 0,75 V, (ii) gamme potentielle de 0,2 à 1,0 V, (iii) gamme potentielle de 0,2 à 1,25 V, (iv) éventail potentiel de 0,2 à 1,5 V. Plusieurs types d&#39;électrodes en or peuvent être utilisés pour réaliser ces expérimentations. En plus d&#39;électrodes à disque d&#39;or telles que celles utilisées ici, nous avons eu du succès avec des surfaces d&#39;or microfabriqué, fil d&#39;or, et or sur les circuits imprimés. Avec les capteurs décrits dans ce document, de nombreuses autres architectures électrochimique biocapteur ADN ont été signalés. Cela comprend des capteurs avec un pseudo-noeud 12, 13 triple brin, un sandwich 14, sandwich Super 15, 16 ou triplex architecture. Dans l&#39;avenir, nous prévoyons que ces capteurs seront utilisés dans le diagnostic sur les soins médicaux. Ils ont été intégrés avec succès dans plusieurs dispositifs microfluidiques 17,18, et offrent de nombreux avantages sur les systèmes optiques détection de l&#39;analyte. En particulier, ces capteurs peuvent fonctionner en trouble, optiquement dense et très auto-fluorescence des échantillons.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Électrodes à disque d&#39;or </td><td> CH Instruments </td><td> CHI101 </td><td> Peut-être ré-utilisés </td></tr><tr><td> Sonde d&#39;ADN synthétique </td><td> Biosearch Technologies </td><td> Personnalisé </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;ADN cible synthétique </td><td> Sigma Genosys </td><td> Personnalisé </td><td></td></tr><tr><td> Mercaptohexanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 725226-1G </td><td> Conserver dans un endroit sombre et frais </td></tr><tr><td> Électrode de platine </td><td> BASi </td><td> MW-1032 </td><td> Peut-être ré-utilisés </td></tr><tr><td> Référence Ag / AgCl </td><td> BASi </td><td> MF-2052 </td><td> Peut-être ré-utilisés </td></tr><tr><td> Chiffon </td><td> Buehler </td><td> 40-7212 </td><td></td></tr><tr><td> Alumine polonaise </td><td> Buehler </td><td> 40-6325-016 </td><td></td></tr><tr><td> Tamponnée au phosphate tampon salin, pH 7,4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7059-1L </td><td></td></tr><tr><td> CH Instruments 605A </td><td> CH Instruments </td><td> 605A </td><td> Utilisez n&#39;importe quel potentiostat </td></tr><tr><td> Sérum de veau nouveau-né </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N4637-500ML </td><td> Conservés congelés </td></tr><tr><td> NanoDrop </td><td> Fisher Scientific </td><td> ND-2000 </td><td> Utilisez n&#39;importe quel UV-Vis </td></tr><tr><td> PCR Mix </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8862 </td><td> Conservés congelés </td></tr><tr><td> La cocaïne </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5776 </td><td> DEA licence requise </td></tr><tr><td> Procaïne </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9879 </td><td> Substituer à la cocaïne </td></tr><tr><td> Anticorps Anti-Flag </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F1804-1mg </td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication of electrochemical-dna biosensors for the reagentless detection of nucleic acids, proteins and small molecules

Comme la médecine est pratiquée actuellement, les médecins envoient des échantillons à un laboratoire central pour les tests et doivent donc attendre des heures ou des jours pour recevoir les résultats. Beaucoup de patients seraient mieux servis par des tests rapides et de chevet. À cette fin, notre laboratoire et d&#39;autres ont développé un appareil polyvalent, plateforme sans réactif biocapteur qui soutient le quantitatif, sans réactif, détection électrochimique des acides nucléiques (ADN, ARN), des protéines (y compris des anticorps) et de petites molécules d&#39;analytes non transformés directement dans des échantillons cliniques et environnementaux. Dans cette vidéo, nous démontrons la préparation et l&#39;utilisation de biocapteurs plusieurs reprises dans ce «E-DNA» de classe. En particulier, nous fabriquons et de démontrer des capteurs pour la détection d&#39;une séquence d&#39;ADN cible dans un mélange polymerase chain reaction, un anticorps spécifique du VIH et de la cocaïne drogue. La procédure de préparation ne nécessite que trois heures de pratique sur l&#39;effort suivie d&#39;une nuit d&#39;incubation, et leur utilisation nécessite quelques minutes seulement.

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Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

«E-DNA» de capteurs, sans réactif, les biocapteurs électrochimiques qui se comportent bien, même si contesté directement dans le sang et d&#39;autres matrices complexes, ont été adaptés à la détection d&#39;une large gamme d&#39;acides nucléiques, de protéines et de petites molécules d&#39;analytes. Nous présentons ici une procédure générale pour la fabrication et l&#39;utilisation de tels capteurs.

La fabrication des électrochimique de l&#39;ADN des Biocapteurs pour la détection sans réactif d&#39;acides nucléiques, protéines et petites molécules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

fabrication-electrochemical-dna-biosensors-for-reagentless-detection

Research

JoVE Journal

Bioengineering

33.1K vues.  University Of California Santa Barbara. «E-DNA» de capteurs, sans réactif, les biocapteurs électrochimiques qui se comportent bien, même si contesté directement dans le sang et d'autres matrices complexes, ont été adaptés à la détection d'une large gamme d'acides nucléiques, de protéines et de petites molécules d'analytes. Nous présentons ici une procédure générale pour la fabrication et l'utilisation de tels capteurs.

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On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic processes in simple, compact systems with no moving parts. Isotachophoresis (ITP) is a simple and very robust electrokinetic technique that can achieve million-fold preconcentration1,2 and efficient separation and extraction based on ionic mobility.3 For example, we have demonstrated the application of ITP to separation and sensitive detection of unlabeled ionic molecules (e.g. toxins, DNA, rRNA, miRNA) with little or no sample preparation4-8 and to extraction and purification of nucleic acids from complex matrices including cell culture, urine, and blood.9-12
ITP achieves focusing and separation using an applied electric field and two buffers within a fluidic channel system. For anionic analytes, the leading electrolyte (LE) buffer is chosen such that its anions have higher effective electrophoretic mobility than the anions of the trailing electrolyte (TE) buffer (Effective mobility describes the observable drift velocity of an ion and takes into account the ionization state of the ion, as described in detail by Persat et al.13). After establishing an interface between the TE and LE, an electric field is applied such that LE ions move away from the region occupied by TE ions. Sample ions of intermediate effective mobility race ahead of TE ions but cannot overtake LE ions, and so they focus at the LE-TE interface (hereafter called the "ITP interface"). Further, the TE and LE form regions of respectively low and high conductivity, which establish a steep electric field gradient at the ITP interface. This field gradient preconcentrates sample species as they focus. Proper choice of TE and LE results in focusing and purification of target species from other non-focused species and, eventually, separation and segregation of sample species.
We here review the physical principles underlying ITP and discuss two standard modes of operation: "peak" and "plateau" modes. In peak mode, relatively dilute sample ions focus together within overlapping narrow peaks at the ITP interface. In plateau mode, more abundant sample ions reach a steady-state concentration and segregate into adjoining plateau-like zones ordered by their effective mobility. Peak and plateau modes arise out of the same underlying physics, but represent distinct regimes differentiated by the initial analyte concentration and/or the amount of time allotted for sample accumulation.
We first describe in detail a model peak mode experiment and then demonstrate a peak mode assay for the extraction of nucleic acids from E. coli cell culture. We conclude by presenting a plateau mode assay, where we use a non-focusing tracer (NFT) species to visualize the separation and perform quantitation of amino acids.

Isotachophoresis (ITP) is a robust electrokinetic separation and preconcentration technique with applications ranging from toxin detection to sample preparation. We review the physical principles of ITP and the methodology of applying this technique to two specific example applications: separation and detection of small molecules and purification of nucleic acids from cell culture lysate.

Sur la puce isotachophorèse pour la séparation des ions et purification des acides nucléiques

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Recherche

Bio-ingénierie

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Détection optique de<em&gt; E. coli</em&gt; Bactérie par mésoporeux Silicon biocapteurs

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Perles agrégation essais pour la caractérisation de molécules d&#39;adhésion cellulaire putatif

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the efficiency with which macromolecules penetrate the cytosolic space of cells. Recently, we have circumvented this problem by identifying the reagent dfTAT, a disulfide bond dimer of the peptide TAT labeled with the fluorophore tetramethylrhodamine. We have generated a fluorescently labeled dimer of the prototypical cell-penetrating peptide (CPP) TAT, dfTAT, which penetrates live cells and reaches the cytosolic space of cells with a particularly high efficiency. Cytosolic delivery of dfTAT is achieved in multiple cell lines, including primary cells. Moreover, delivery does not noticeably impact cell viability, proliferation or gene expression. dfTAT can deliver small molecules, peptides, antibodies, biologically active enzymes and a transcription factor. In this report, we describe the protocols involved in dfTAT synthesis and cellular delivery. The manuscript describes how to control the amount of protein delivered to the cytosolic space of cells by varying the amount of protein administered extracellularly. Finally, the current limitations of this new technology and steps involved in validating delivery are discussed. The described protocols should be extremely useful for cell-based assays as well as for the ex vivo manipulation and reprogramming of cells.

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Livraison des protéines, des peptides ou imperméable aux cellules petites molécules dans des cellules vivantes par incubation avec le réactif dfTAT endosomolytique

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, significantly affecting the rate of human mortality and morbidity. Conventional methods for the detection of V. parahaemolyticus such as culture-based methods, immunological assays, and molecular-based methods require complicated sample handling and are time-consuming, tedious, and costly. Recently, biosensors have proven to be a promising and comprehensive detection method with the advantages of fast detection, cost-effectiveness, and practicality. This research focuses on developing a rapid method of detecting V. parahaemolyticus with high selectivity and sensitivity using the principles of DNA hybridization. In the work, characterization of synthesized polylactic acid-stabilized gold nanoparticles (PLA-AuNPs) was achieved using X-ray Diffraction (XRD), Ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Field-emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), and Cyclic Voltammetry (CV). We also carried out further testing of stability, sensitivity, and reproducibility of the PLA-AuNPs. We found that the PLA-AuNPs formed a sound structure of stabilized nanoparticles in aqueous solution. We also observed that the sensitivity improved as a result of the smaller charge transfer resistance (Rct) value and an increase of active surface area (0.41 cm2). The development of our DNA biosensor was based on modification of a screen-printed carbon electrode (SPCE) with PLA-AuNPs and using methylene blue (MB) as the redox indicator. We assessed the immobilization and hybridization events by differential pulse voltammetry (DPV). We found that complementary, non-complementary, and mismatched oligonucleotides were specifically distinguished by the fabricated biosensor. It also showed reliably sensitive detection in cross-reactivity studies against various food-borne pathogens and in the identification of V. parahaemolyticus in fresh cockles.

A protocol for the development of an electrochemical DNA biosensor comprising a polylactic acid-stabilized, gold nanoparticles-modified, screen-printed carbon electrode to detect Vibrio parahaemolyticus is presented.

Développement d’un Biocapteur électrochimique ADN pour détecter un pathogène d’origine alimentaire

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

Détection visuelle de plusieurs acides nucléiques dans une gamme capillaire

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

Développement de dispositifs microfluidiques pour étudier la capacité d’élongation de la pointe de croissance des cellules végétales dans des espaces très réduits

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

Une plate-forme microfluidique multicouche pour la conduite d'une expression génique prolongée sans cellules

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated media. In this article, we describe detailed protocols that enable the construction of nanofiber architectures in organic solvent mixtures through the self-assembly of uniquely addressable, single-stranded, gamma-modified peptide nucleic acid (&#947;PNA) tiles. Each single-stranded tile (SST) is a 12-base &#947;PNA oligomer composed of two concatenated modular domains of 6 bases each. Each domain can bind to a mutually complimentary domain present on neighboring strands using programmed complementarity to form nanofibers that can grow to microns in length. The SST motif is made of 9 total oligomers to enable the formation of 3-helix nanofibers. In contrast with analogous DNA nanostructures, which form diameter-monodisperse structures, these &#947;PNA systems form nanofibers that bundle along their widths during self-assembly in organic solvent mixtures. Self-assembly protocols described here therefore also include a conventional surfactant, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), to reduce bundling effects.

This article provides protocols for the design and self-assembly of nanostructures from gamma-modified peptide nucleic acid oligomers in organic solvent mixtures.

Auto-assemblage d’acides nucléiques peptides gamma modifiés en nanostructures complexes dans des mélanges de solvants organiques

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is accompanied by high manufacturing costs, which has brought about an interest in using alternative methods for gene delivery. Electroporation is an electro-physical, non-viral approach for the intracellular delivery of genes and other exogenous materials. Upon the application of an electric field, the cell membrane temporarily allows molecular delivery into the cell. Typically, electroporation is performed on the macroscale to process large numbers of cells. However, this approach requires extensive empirical protocol development, which is costly when working with primary and difficult-to-transfect cell types. Lengthy protocol development, coupled with the requirement of large voltages to achieve sufficient electric-field strengths to permeabilize the cells, has led to the development of micro-scale electroporation devices. These micro-electroporation devices are manufactured using common microfabrication techniques and allow for greater experimental control with the potential to maintain high throughput capabilities. This work builds off a microfluidic-electroporation technology capable of detecting the level of cell membrane permeabilization at a single-cell level under continuous flow. However, this technology was limited to 4 cells processed per second, and thus a new approach for increasing the system throughput is proposed and presented here. This new technique, denoted as cell-population-based feedback control, considers the cell permeabilization response to a variety of electroporation pulsing conditions and determines the best-suited electroporation pulse conditions for the cell type under test. A higher-throughput mode is then used, where this 'optimal' pulse is applied to the cell suspension in transit. The steps for fabricating the device, setting up and running the microfluidic experiments, and analyzing the results are presented in detail. Finally, this micro-electroporation technology is demonstrated by delivering a DNA plasmid encoding for green fluorescent protein (GFP) into HEK293 cells.

This protocol describes the microfabrication techniques required to build a lab-on-a-chip, microfluidic electroporation device. The experimental setup performs controlled, single-cell-level transfections in a continuous flow and can be extended to higher throughputs with population-based control. An analysis is provided showcasing the ability to electrically monitor the degree of cell membrane permeabilization in real-time.

La fabrication et l’exploitation d’un système de micro-électroporation à flux continu avec détection de perméabilisation

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...