我々は、ウィスター研究所の動物施設、顕微鏡施設、Histotechnology施設と研究のサプライセンターに感謝します。この調査は健康CA 076674、CA 098101、CA 025874と、CA 10815の国立研究所からの補助金によって一部で賄われていた。

1。三次元ヒト皮膚は、モデルを再構築： <ol><li>無細胞層の調製：0.59 mLの10X EMEM、50μlの200mmのL -グルタミン、0.6 mLのFBS、120μlの7.5％の重炭酸ナトリウムおよび4.6 mLのウシコラーゲンIの1 mLを追加：氷上で50 mLのチューブに以下の試薬を混合組織培養トレーの各インサートに混合。室温で30分間インキュベートし、ゲルが固化することができます。混合物の色は淡黄色からピンクにしてください。 </li><li> DMEMを中和するために10％FBSを含む追加、0.25％トリプシン/ EDTAで培養フラスコからヒト線維芽細胞をトリプシン処理。 10％FBSを1.5 mLのDMEMで遠心分離し、再懸0.45 × 10 6個の細胞で細胞を回収。皮膚幹細胞の場合は、遠心分離、球を分離するためにフラスコをタップすることで、6600皮膚の球を（皮膚の幹細胞は幹細胞の培地で生育したとき、彼らはニューロスフェアと同様の方法で球を形成する）を収集。 </li><li>細胞層の調製：氷の上を50mLチューブに次のようにミックス：1.65 mLの10X EMEM、150μlの200mMのL -グルタミン、1.85 mLのFBS、350μlの7.5％の重炭酸ナトリウム、14mlのウシコラーゲンIおよび1.5 mLの線維芽細胞の懸濁液ステップ2（代 ​​わりに、皮膚幹細胞再構築のために私培地を再構成皮膚の1.5mLの、0.45 × 10 6線維芽細胞および6600真皮球の組み合わせを使用する）から、よく混ぜる。それぞれの無細胞層でコーティングされたインサートの混合液を3 mLを加え。 37℃で5％CO 2組織培養インキュベーターで45分間インキュベートする。混合物の色はピンクに黄色の麦わらからする必要があります。ゲルが固化した後、DMEM 10％FBSを（2mLの内側と皮膚の再構築トレイの各ウェルに挿入10mLの外）を含む追加。 4日間インキュベートし、ゲルの契約のことを確認してください。 </li><li>各インサートの内側と外側の両方から培地を吸引除去する。定期的に血清を洗い落とすために、内側とインサートの外側に10mLに培地（1％透析FBSとHBSS）を2mLの洗浄に追加します。 37℃で1時間インキュベート℃に</li><li>皮膚の準備は、メディアを再構築： <ol><li>正常メラノサイトと皮膚幹細胞のために再構築：基本培地（500 mL）を作成するには、以下の試薬を混合：490 mLのケラチノサイト無血清培地、1.8 mLのウシ下垂体抽出物、10 mLの透析ウシ胎児血清、10μgの/ 500μLをmLのSCF、4μg/ mLのbFGFおよび264μg/ mLのET - 3の500μlの562.5μL。培地I：100mLの基本培地に100μg/ mlの10μlのEGFを追加する。培地II：100mLの基本培地に2μlのEGFを追加する。培地III：300mlの基本培地に1 Mの720μlのCaCl 2を追加。 </li><li>黒色腫の皮膚のために再構築：中I（100mLの）は、以下の試薬を混ぜるようにするには：DMEMの72.5 mLの、F12の24 mLの（HAMのを）、2 mLの200 mMのL -グルタミン、269 g / mlで、200の200μlのヒドロコルチゾン500XμlのITES、200μlの0.05のO - phosphorylethanolamine M、90 mMの、2 nmの200μlのプロゲステロン、1 M 240μLのCaCl 2、10 nMの200μlのトリヨードチロニンとchelexed新生児ウシ血清100μlを200μlのアデニン（、血清100mLにChelex 100の3gを溶解し4℃で1.5時間℃で、フィルター滅菌をかき混ぜる）。ミディアムII（100mLの）を作るために、以下の試薬を混ぜる：DMEMの72.5 mLの、F12の24 mLの（HAMのを）、2 mLの200 mMのL -グルタミン、269 g / mlで、500Xの200μlのITES200μlのヒドロコルチゾン、 1 M、10 nMの200μlのトリヨードチロニンと100μlの新生児ウシ血清の200μlの0.05のO - phosphorylethanolamine M、90 mMの200μlのアデニン、2 nmの200μlのプロゲステロン、240μlの塩化カルシウム。ミディアムIII（300ML）を作るために、以下の試薬を混合：DMEMの142.5 mLの、F12の142.5 mLの（HAMの）、200mMのL -グルタミンの6 mLを、269 g / mlで、500Xの600μlのITESの600μlのヒドロコルチゾン、0.05の600μlのO - phosphorylethanolamine M、90 mMの600μlのアデニン、2 nmの600μlのプロゲステロン、1の720μLのCaCl 2、M、10nmと6 mLの新生児ウシ血清の600μlのトリヨードチロニン。 </li></ol></li><li>大豆トリプシンインヒビター（1Xリン酸塩の250 mg / Lの緩衝生理食塩水）でトリプシンを中和し、0.05％トリプシン/ EDTAで培養フラスコからヒトケラチノサイトをトリプシン処理、培地を再構成皮膚の4.17 × 10 6細胞/ mLで細胞ペレットを再懸濁し、スピンダウンI. </li><li>培地I.を再建皮膚0.83 × 10 6細胞/ mLで細胞ペレットを再懸濁し、スピンダウン、大豆トリプシンインヒビターとトリプシンを中和し、0.05％トリプシン/ EDTAで培養フラスコからヒトメラニン細胞または黒色腫細胞をトリプシン処理</li><li>各インサートの内側と外側の両方から培地を洗濯取り外します。 </li><li>皮膚が培地I（各インサートの外側に内側と10 mLの1.5 mL）を再追加。 </li><li> 、ケラチノサイトとメラノサイトまたはメラノーマ細胞の600μlの細胞懸濁液の600μlの細胞懸濁液を取るよく混ぜる。各インサートの内側にドロップして200μlの混合細胞懸濁液のドロップを分注する。皮膚幹細胞の場合は、再構成するケラチノサイト懸濁液100μlをのみ使用します。 37℃で2日間インキュベート℃に</li><li>私培地を再構築皮膚を吸引除去する内側と各インサートの外側の両方から。培地IIに（内側から2 mLおよび外側に10 mL）を再構成皮膚を追加。 37℃でさらに2日間インキュベート℃に</li><li>吸引皮膚は内側から培地IIを再構成し、各インサートの外側には、7.5mlのスキンは外側だけに培地IIIを再追加。この点から、表面が空気にさらされている開始再構成する。 18日目まで一日おきに培地IIIを変更します。 </li><li>収穫の皮膚は、一日18で再構築： <ol><li>内側とインサートの外側から培地を吸引除去する。 </li><li>ピンセットでトレイからインサートを取り外します。 </li><li>手術用メスの刃で端に円形の近くにトレースすることで（ポリカーボネートフィルターを含む）の再構築を切り取ります。 </li><li>ハード面で再構築し、半分にフィルターをカット。 </li></ol></li><li>パラフィン切片の場合：2黒TBS生検の論文との間の組織学のカセットに再構築し、4時間以上10％ホルマリンで全体のカセットを浸漬の半分を置きます。その後70％エタノールでカセットを配置し、それを4℃で保存して、パラフィン包埋のために再処理するための準備が整うまで。 </li><li>凍結切片の場合： <ol><li>の他の半分を置きます4で50％のショ糖で再構築° Cを1〜2時間、その後2Mにショ糖を変更し、別の1〜2時間4℃に保存。 </li><li>それは船の約50％を埋めるように使い捨てのベース金型に最適な加工温度の凍結媒体（OCT）を分注する。 OCTのいずれかの泡を避けてください。 </li><li>鉗子で再構築し、スクロースから再構築削除のエッジをつかむ。キムワイプはショ糖を吸収するまでキムワイプの上に置きます。 </li><li>鉗子やヘラを使用して、OCTの上にベースの金型に再構築を移す。ベースの金型が完全にいっぱいになるまで多くのOCTで再構築の上部をカバーしています。あなたが困難にカットできるようになりますOCTでいかなる気泡がないことを確認してください。 </li><li>砕いたドライアイス上で均等に基本型を置き、そして、OCTは完全に凍結することができます。 </li><li>スズ箔で基本型をラップし、それを-70℃で保存するクライオスタットでそれを切る準備が整うまで。 </li></ol></li><li>移植皮膚は、マウスで再構築： <ol><li> DMEMの5mLの（凍結と解凍のマウスの皮膚用）と50 mLのファルコンチューブを準備します。 </li><li> 6週間前後雌SCIDへアレス非近交系マウスを使用してください。 </li><li>マウスは、イソフルランで麻酔です（EZ麻酔システム）：最初の麻酔は、イソフルラン4％（マウスが手術台に移動される前）で誘導チャンバ内で行われ、手続き時にノーズコーンブリーザーによって麻酔を維持している（イソフルラン：1.5〜2パーセント）。低体温麻酔時の眼の怪我を防ぐために適用される無菌眼科用潤滑油を防止するために、加熱パッドにより熱のサポート。 </li><li>ビーカーに600mlの水を入れ、40との間に水の温度を保つためにホットプレートの上に残す - 60℃ </li><li>複合ベンゾインチンキとアルコールの準備を綿棒でマウスの皮膚をきれいにします。 </li><li>後で縫合のために同じ位置を維持するために、マウスの背中の上に行をマーク。 </li><li>アイリスのハサミとピンセットを用いて、マウス上部の背面に直径1.2 cm程度の円形創傷床をカット。滅菌ガーゼのスポンジを創傷床をカバーしています。 DMEM 5mLに丸いマウスの皮膚を置く、それは完全に凍結するまで液体窒素の容器のまま。霜取りは、ホットプレートの上にお湯の管が完全に融解するまで。 3回繰り返します。 </li><li>皮膚のトランスウェルを使用して外科ブレードから再構築し、非常に慎重に膜を除去デタッチ、創傷床の上に（上表皮側）を再構築皮膚を転送する。 </li><li>皮膚の再構築の上にマウスの皮膚（上表皮側）を配置します。 </li><li>マウスの皮膚を修正するためにして、以前にラベルを付けたマーカーの最初の縫合、底部の2番目、両側にある2個以上の縫合を行う。 </li><li>移植後のクリーンマウスの皮膚。ノーズコーンを外し、目を覚まし、外来まで加熱パッド上でマウスを保持します。 </li><li>新しいケージにマウスを置く。 </li><li>手術直後は皮下注射、手術後24時間および48時間でメロキシカム（1 mg / kg体重）：手術鎮痛を投稿。 </li></ol></li></ol> 2。代表的な結果： 皮膚は、正常メラノサイトと皮膚幹細胞で再構築 皮膚は、インサート付き特別6穴トレイで培養され再構築されます。皮膚コンパートメントは、最初の4日間（図1A）のために10％FBSを含むDMEM中で培養される。皮膚は、角化細胞がメラ​​ノサイトまたはメラノーマ細胞（図1B）を播種しているときに私が使用されている培地再構築。表皮は、9日目で空気にさらされると、これは角化細胞が分化することができます（図1C）されています。 18日目で、皮膚の表皮は、階層化ケラチノサイトの層で構成されて再構築。未分化基底層と連続して差別化された層は、（図1D）に縦に並んでいます。染色メラノサイトのマーカーS100で再構築のセクションを覆うとそのメラノサイトがデンドライト拡張機能を介して複数のケラチノサイトと表皮と通信の基底層（図1E）に整列されて表示されます。皮膚コンパートメントは、I型コラーゲンマトリックスに埋め込まれている線維芽細胞が含まれています。堆積コラーゲンIVは、真皮（図1F）から表皮を分離する基底膜を、示している。皮膚幹細胞（GFPレンチウイルスベクターで標識）コラーゲンIマトリックスの線維芽細胞に埋め込まれている場合、それらは表皮に移行し、メラノサイト（1）、（図2）に分化する。表皮のケラチノサイトの複数の層が開発されています。 皮膚は黒色腫の腫瘍の再構築 一般的な買収母斑、異形成母斑、RGP（放射状増殖相）メラノーマ、VGP（垂直増殖期）黒色腫と転移性黒色腫（7）：臨床病理学的研究は、段階的にその黒色腫の進行状況を示します。メラノーマ細胞株の異なる段階では、2次元文化の中でお互いに形態学的に似ています（図3A - D）が、それらが皮膚再構築に組み込まれているときに、細胞の挙動は、彼らの中のin vivoでの特性を反映している。場所と正常メラノサイトの成長率は、しっかりと皮膚の再構築（図3E）で制御されます。 VGPメラノーマWM793は真皮（図3G）に侵襲的に成長するのに対し、RGP主メラノーマWM35は、表皮（図3F）で主に増殖する。転移性黒色腫1205Luは積極的に真皮（図3H）の奥深くまで侵入する。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig1.jpg" /> 図1。皮膚は、正常メラノサイトで再構築する。皮膚の肉眼的形態は、ACに示されている再構築する。コラーゲンと混合A.の線維芽細胞を10％FBSおよびフォーム皮膚コンパートメントを含むDMEM中で増殖されています。 B.のケラチノサイトとメラノサイトが真皮の上に播種し、培地を再構築皮膚に成長されています。 C.表皮は、9日目で空気にさらされている。 D. H＆E染色皮膚再構築は、垂直に構成される表皮、指向基底層、および順次分化した層化細胞層を示す。真皮は、コラーゲンI型マトリックス中に埋め込まれた線維芽細胞が含まれています。 E. S100陽性メラノサイト（黒矢印）は、複数のケラチノサイトと基底膜との通信で整列される。 F.コラーゲンIV -染色では、真皮から表皮を分離する基底膜を、示している。 DFのすべてstainingsは、ホルマリン固定、パラフィン包埋切片で行った。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig2.jpg" /> 図2。皮膚の真皮幹細胞は、表皮に移行し、メラノサイトに分化再構築します。5日目に播種ケラチノサイトの後、単一のGFP陽性細胞（緑）が球からの移行を開始。表皮は、まだ単層で構成されています。 8日目では、少数の細胞は表皮 - 真皮のインタフェースに到達する。 10日目では、GFP陽性細胞がしっかりと基底膜の位置に配置されます。移行したGFP陽性表皮エクスプレスメラノサイトのマーカーHMB45の細胞（赤、のような白い矢印で示す）。核はDAPI（青）で染色されています。表皮は、複数の層として開発されています。基底膜は白い点線で示されます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig3.jpg" /> 図3。皮膚は黒色腫のさまざまな段階の再構築：AD。正常メラノサイトおよびメラノーマ細胞は、2次元培養液内で成長する。包皮からAはメラノサイト。 B. RGP WM35細胞。 C. VGP WM793細胞。 D.転移性メラノーマ1205Lu細胞。 E.正常メラノサイトは、基底膜に位置しています。 F. RGPメラノーマWM35細胞は表皮の細胞のクラスターとして成長する。 G. VGPメラノーマWM793細胞が基底膜を介して真皮に侵入。 H.転移性黒色腫1205Lu細胞が積極的に真皮に深く侵入する。 トラブルシューティング<table border="1"><tbody><tr><td> 問題が </td><td> トラブルシューティング </td></tr><tr><td>コラーゲンの混合物は固化していない</td><td>コラーゲンの混合物の色がピンクに藁の黄色でなければならない、そうでなければpHが間違っているとコラーゲンゲルではない場合があります。色は明るい黄色である場合は、より多くの重炭酸ナトリウムは、滴ずつ追加する必要があります。 </td></tr><tr><td>コラーゲンは、途中でmixutureに析出</td><td>コラーゲンの混合物をインサートの上に配置されるまで氷の上ですべてのコンポーネントを置かないでください</td></tr><tr><td>契約コラーゲンは（片側が反対側よりも厚くなる）にもない</td><td>インキュベーターの棚のキャリブレーション</td></tr><tr><td>表皮は、つ以下ケラチノサイトの層が形成されている。 </td><td>下の通路で未分化ケラチノサイトを使用してください</td></tr></tbody></table>

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	<li>Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+skin+cells+in+3D+rather+than+2D+improves+their+ability+to+survive+exposure+to+cytotoxic+agents.">Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents.</a> J Biotechnol. 122, 372-381 (2006).</li><li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+isn't+flat:+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension.">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 242-247 (2006).</li><li>Sun, T., Norton, D., McKean, R. J., Haycock, J. W., Ryan, A. J., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+3D+cell+culture+system+for+investigating+cell+interactions+with+electrospun+fibers.">Development of a 3D cell culture system for investigating cell interactions with electrospun fibers.</a> Biotechnol Bioeng. 97, 1318-1328 (2007).</li><li>Kremer, M., Lang, E., Berger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypical+engineering+of+differentiated+composite-skin+equivalents+of+human+keratinocytes+in+a+collagen-GAG+matrix+(INTEGRA+Artificial+Skin)+in+a+perfusion+culture+system.">Organotypical engineering of differentiated composite-skin equivalents of human keratinocytes in a collagen-GAG matrix (INTEGRA Artificial Skin) in a perfusion culture system.</a> Langenbecks Arch Surg. 386, 357-363 (2001).</li><li>Esc&#225;mez, M. J., Garc&#237;, M., Larcher, F., Meana, A., Mu&#241;oz, E., Jorcano, J. L., Del R&#237;o, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+wound+healing+in+genetically+modified+skin-humanized+mice.">An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice.</a> J Invest Dermatol. 123, 1182-1191 (2004).</li><li>Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Yu, H., Xu, X., Kong, J., Lee, J. T., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dermal+stem+cells+differentiate+into+functional+epidermal+melanocytes.">Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes.</a> J Cell Sci. 123, 853-860 (2010).</li><li>Meier, F., Nesbit, M., Hsu, M. Y., Martin, B., Van Belle, P., Elder, D. E., Schaumburg-Lever, G., Garbe, C., Walz, T. M., Donatien, P., Crombleholme, T. M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+progression+in+skin+reconstructs:+biological+significance+of+bFGF.">Human melanoma progression in skin reconstructs: biological significance of bFGF.</a> Am J Pathol. 156, 193-200 (2000).</li><li>Yu, H., McDaid, R., Lee, J., Li, L., Kumar, S. M., Elder, D. E., Van Belle, P., Gimotty, P., Guerra, M., Hammond, R., Nathanson, K. L., Dalla Palma, M., Herlyn, M., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+BRAF+mutation+and+p53+inactivation+during+transformation+of+a+subpopulation+of+primary+human+melanocytes.">The role of BRAF mutation and p53 inactivation during transformation of a subpopulation of primary human melanocytes.</a> Am J Pathol. 174, 2367-2377 (2009).</li><li>Lee, J. T., Li, L., Brafford, P. A., van den Eijnden, M., Halloran, M. B., Sproesser, K., Haass, N. K., Smalley, K. S., Tsai, J., Bollag, G., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLX4032,+a+potent+inhibitor+of+the+B-Raf+V600E+oncogene,+selectively+inhibits+V600E-positive+melanomas.">PLX4032, a potent inhibitor of the B-Raf V600E oncogene, selectively inhibits V600E-positive melanomas.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 23, 820-827 (2010).</li><li>Tsai, J., Lee, J. T., Wang, W., Zhang, J., Cho, H., Mamo, S., Bremer, R., Gillette, S., Kong, J., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+selective+inhibitor+of+oncogenic+B-Raf+kinase+with+potent+antimelanoma+activity.">Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3041-3046 (2008).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は3次元皮膚の生成で説明している正常ヒトメラノサイト、皮膚幹細胞およびメラノーマ細胞で再構築。単層培養で増殖させた場合、メラニン細胞は、同様の形態（扁平、スピンドルまたは樹枝状の形をした多くの）に関係なく、臨床病期の彼らの起源を紹介。対照的に、3Dの皮膚は、メラノーマ細胞の段階に固有のプロパティを再現再構築します。正常ヒトメラノサイトは、単一の細胞として表皮と真皮層の間の基底膜に存在。より積極的なVGPのメラノーマ細胞は、真皮に基底膜を突破する大規模なクラスタとして成長するのに対し、RGP原発性黒色腫細胞は基底膜に沿って小さなクラスターとして成長する。転移性悪性黒色腫細胞はすべての方向に成長し、単一細胞やクラスタなどの真皮の奥深くまで侵入する。定量分析は、侵入の深さと増殖の程度を測定することにより、このモデル上で行うことができます。正常および悪性メラニン細胞の特性に加えて、我々が直接表皮の基底層にどの家庭、成熟したメラノサイトに皮膚幹細胞の分化を誘導し、E -カドヘリンのアップレギュレーションによってケラチノサイトとの善意の通信を確立できるモデルを用いて（ 6）。 ウイルスベクターを用いて、我々は、アクティブまたはメラノサイトの変換のメカニズムだけではないを研究するために効率的なモデルであることを約束するダイナミクスと皮膚内の各セルの種類によって発現する遺伝子の機能的意義の理解を深める再構築、のために遺伝子機能を不活性化することができますだけでなく、黒色腫（8）の進行。細胞の表現型の長期観測は、皮膚の移植によって免疫不全動物に再構成することが可能となった。このような人間の皮膚 - マウスキメラはmelanomagenesisと黒色腫の転移を研究するために優秀な研究ツールです。 皮膚はまた、薬剤の評価に有用なプラットフォームになることができます再構築します。 2次元培養条件でがん細胞を根絶する多くの薬は、しばしば実験的および臨床応用にはほとんど影響がありません。 in vivoでの腫瘍内に見られるように、3次元培養で黒色腫細胞は多くの場合に応答する細胞2D文化の薬剤に対して耐性である、微小環境は、黒色腫でシグナル伝達経路を調節することを示唆している。成功した創薬のために、3Dの皮膚は、モデルを再構築する生体内で化合物（9,10）の効果を予測するために理想的な臨床ツールです。 要約すると、皮膚はモデルがin vitroおよびin vivo試験との間のギャップを埋める再構築。彼らは、遺伝子が形質転換に関与しているのより良い理解につながるとどのように幹細胞がその変革に貢献する。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> 10倍EMEM </td><td>バイオウィテカー</td><td> 12 - 684F </td></tr><tr><td> L -グルタミン</td><td>ギブコ</td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td> Hyclone </td><td> SH - 30071.02 </td></tr><tr><td>ウシ腱酸抽出コラーゲン</td><td>器官形成</td><td> 50分の200 </td></tr><tr><td>組織培養6ウェルインサート付きトレー</td><td>器官形成</td><td> 9285 </td></tr><tr><td>ケラチノサイト無血清培地</td><td>ギブコ</td><td> 17005042 </td></tr><tr><td>透析ウシ胎児血清</td><td> Hyclone </td><td> SH - 30079.03 </td></tr><tr><td>組換えヒト幹細胞因子</td><td>フィッツジェラルドインダストリーズ</td><td> RDI - 307 - 255X </td></tr><tr><td>塩基性FGF </td><td>フィッツジェラルドインダストリーズ</td><td> 30R - AF015 </td></tr><tr><td>エンドセリン-3、人間の</td><td>アメリカンペプチド（株） </td><td> 88-5-10 </td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>シグマ</td><td> C - 7902 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> JRHバイオサイエンス</td><td> 56430 - 10L </td></tr><tr><td> F12（HAMの） </td><td>ギブコ</td><td> 11765〜54 </td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>シグマ</td><td> H - 0888 </td></tr><tr><td>インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、セレン（ITES） </td><td> BioWhittaker </td><td> 17839Z </td></tr><tr><td> O - Phosphorylethanolamine </td><td>シグマ</td><td> P0503 </td></tr><tr><td>アデニン</td><td>シグマ</td><td> A9795 </td></tr><tr><td>プロゲステロン</td><td>シグマ</td><td> P - 8783 </td></tr><tr><td>トリヨードサイロニン</td><td>シグマ</td><td> T - 5516 </td></tr><tr><td>新生児ウシ血清</td><td> Hyclone </td><td> SH3011802 </td></tr><tr><td> 10％ホルマリン緩衝液</td><td> Surgipath </td><td> 00600 </td></tr><tr><td>最適な切削温度の凍結媒体（OCT） </td><td>桜</td><td> 4583 </td></tr><tr><td>マルチカセット</td><td> Surgipath </td><td> 02293 - BX </td></tr><tr><td> TBS生検の論文</td><td>トライアングル医歯薬学総合研究</td><td> BP - B </td></tr><tr><td> TBS生検の論文</td><td>トライアングル医歯薬学総合研究</td><td> BP - B </td></tr><tr><td>使い捨てのベース金型</td><td>フィッシャー</td><td> 15から182 - 501C </td></tr><tr><td>複合ベンゾインチンキ</td><td>プロの使い捨て、株式会社、 </td><td> S42450 </td></tr><tr><td>アルコールプレップ綿棒</td><td> CVS薬局</td><td></td></tr><tr><td>シルクブラック編組5から0 </td><td>エチコン</td><td> 682G </td></tr><tr><td>ガーゼのスポンジ（無菌） </td><td> CVS薬局</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td> Roboz </td><td> RS5070 </td></tr><tr><td>アイリスはさみ</td><td> Roboz </td><td> RS5913 </td></tr><tr><td>外科ブレード</td><td>フェザー</td><td> 2976 </td></tr><tr><td> EZ麻酔</td><td> Euthanex株式会社</td><td></td></tr><tr><td> SCIDへアレス非近交系マウス</td><td>チャールズ川</td><td></td></tr></tbody></table>

the three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal  skin and melanoma progression

累積証拠は、その細胞は、それらが3次元細胞外マトリックス内で栽培されている時に異なった動作をしても、他のセル（1-5）と相互作用を示唆しながら、実験的な皮膚の生物学のin vitro試験でほとんどは、2次元（2D）モノカルチャーで行われている。マウスモデルは、広く生体内の組織の形態形成を研究するために利用されている。しかし、マウスとヒトの皮膚は、それが困難なヒトへのマウスの研究を推定するために行う細胞構造と生理機能に大きな違いを、持っている。マウスの皮膚のメラノサイトが主に毛包にローカライズされているので、それらは主に表皮の基底層で見つけている人間のもの、とは異なる生物学的性質を持っている。 3Dヒト皮膚再構築モデルの最近の開発は、異なる種類の細胞の間で細胞 - マトリックスと細胞間相互作用を調査するフィールドを有効にしています。コラーゲンIマトリックス、層化、差別化されたケラチノサイトおよび真皮から表皮を分離する機能的な基底膜、から構成されている&quot;表皮&quot;、に埋め込まれている線維芽細胞と&quot;真皮&quot;で構成されて再構築。コラーゲンは、足場、栄養配信、および細胞間相互作用の可能性を提供します。メラニン細胞がメラ​​ニン細胞恒常性と人間の皮膚のメラノーマ進行の自然の特徴を再現組み込んだ3次元皮膚モデル。 in vivoで同様に、再構成された皮膚のメラノサイトは、基底層のケラチノサイトが散在基底膜に局在している。メラノーマ細胞は、in vivoで 、元の腫瘍の病期（RGP、VGPおよび転移性メラノーマ細胞）を反映して、同じ特性を示す。最近、皮膚幹細胞は、ヒトの真皮（6）において同定されている。これらのマルチ強力な幹細胞は、表皮に移行し、メラノサイトに分化することができます。

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The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

このレポートでは、我々は三次元皮膚がアーキテクチャと構成に人間の皮膚を模倣したモデルを再構築について説明します。メラノサイト生理学、メラノーマ進行や皮膚幹細胞の運命は、皮膚、モデルの再構築を使用して検討されている。モデルはまた、薬剤の評価のための前臨床ツールとして有用である。

三次元ヒト皮膚は、モデルを再構築：ノーマルスキンとメラノーマ進行を勉強するツールを

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

49.3K ビュー.  The Wistar Institute. このレポートでは、我々は三次元皮膚がアーキテクチャと構成に人間の皮膚を模倣したモデルを再構築について説明します。メラノサイト生理学、メラノーマ進行や皮膚幹細胞の運命は、皮膚、モデルの再構築を使用して検討されている。モデルはまた、薬剤の評価のための前臨床ツールとして有用である。

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Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

導電性インクの平面および三次元印刷

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

生物工学

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

皮膚からのI型コラーゲンの調製のための改良された方法

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

モデルの声帯ポリープによる三次元流分離の調査

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

三次元インクジェット印刷技術を用いて、ヒト軟骨組織の作製

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

生体材料の血管新生を評価するために、完全な皮膚欠損モデル<em&gt;インビボ</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

三次元の全層皮膚等価物と自動傷つけ処理の発生

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

微小重力下で増殖させたヒト腸粘膜の多細胞三次元器官型モデルの開発

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol applies a macromolecular crowding (MMC) technique to mimic this physiological crowding through the addition of neutral polymers (crowders) to cell cultures in vitro. Previous studies using Ficoll or dextran as crowders demonstrate that the expression of collagen I and fibronectin in WI38 and WS-1 cell lines are significantly enhanced using the MMC technique. However, this technique has not been validated in primary hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts (hHSFs). As hypertrophic scarring arises from the excessive deposition of collagen, this protocol aims to construct a collagen-rich in vitro hypertrophic scar model by applying the MMC technique with hHSFs. This optimized MMC model has been shown to possess more similarities with in vivo scar tissue compared to traditional 2-dimensional (2-D) cell culture systems. In addition, it is cost-effective, time-efficient, and ethically desirable compared to animal models. Therefore, the optimized model reported here offers an advanced &#8220;in vivo-like&#8221; model for hypertrophic scar-related studies.

This protocol describes the use of macromolecular crowding to create an in vitro human hypertrophic scar tissue model that resembles in vivo conditions. When cultivated in a crowded macromolecular environment, human skin fibroblasts exhibit phenotypes, biochemistry, physiology, and functional characteristics resembling scar tissue.

高分子群集を用いたヒト皮萎縮性瘢痕化のインビトロモデル

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

3次元の再構築されたヒト表皮を大規模に育成

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

自己組み立て型血管化ヒト皮膚等価物の生成

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...