このプロトコルで提供される詳細は、多くの場合、技術的に困難である人間の皮膚同等の生成に対処します。血管系および容積物イメージングなどの新規ヒト皮膚等価プロトコル要素が含まれる。この技術は、疾患、老化およびパーソナライズされた医学の研究のために、インビボ組織とより密接に一致する皮膚モデルの簡単な構築を可能にする。
このプロトコルの最も困難な部分は、水中と空気液体界面の間の移行です。一貫した結果を得るためにタイミングとメディアのレベルを最適化するには、いくつかの試行が必要になる可能性があります。まず、冷たいキャップチューブに516マイクロリットルの培地を加え、1000マイクロリットルの正の変位ピペットを使用して375マイクロリットルの冷たいコラーゲンをすぐに加えます。
空のピペットチップを取り外し、調製した250マイクロリットルの正変位ピペットに切り替えて混合します。素早く混ぜますが、余分な泡の形成を防ぐために優しく混ぜます。溶液中の先端を保ち、溶液が均質な色になるまでチューブの異なる位置から均一に混合し、通常は約5ピペットサイクルまたは10秒を要する。
12ウェル培養インサートの膜上に125マイクロリットルの細胞コラーゲンを直ちに分散させる。均一なカバレッジを確保するには、プレートを傾け、ピペットチップを使用して、コラーゲンを穏やかに広げて膜を塗ります。12ウェルプレートを37°Cの細胞培養インキュベーターに直ちに移動させ、少なくとも20分間ゲル化させます。
ゲル化期間の後、インキュベーターから細胞コラーゲンの12ウェルプレートを取り出します。湿った氷から1.7ミリリットルのキャップチューブを取り出し、冷凍からストックコラーゲンを取り出し、蓋を開けた状態で湿った氷の上に置きます。冷たいキャップチューブに冷却されたセルサスペンションの516マイクロリットルを追加します。
1000マイクロリットルのピペットを使用して、375マイクロリットルのコールドコラーゲン溶液をキャップチューブ内の溶液に直接直接ピペットします。ピペットからチューブにすべてのコラーゲンを排出し、正の変位ピペットチップを捨てます。すぐに250マイクロリットルのピペットに切り替え、コラーゲン溶液を混合したら混合し、250マイクロリットルの細胞コラーゲン溶液を12ウェル培養インサートの細胞コラーゲン支持体に移し、12ウェルプレートを摂氏37度の細胞培養インキュベーターに移します。
30分のゲル時間の後、プレートを軽く傾けてゲル化を評価し、コラーゲンが固化したことを確認します。500マイクロリットルと1000マイクロリットルのブレンドメディアを、挿入物の上部チャンバーと下部チャンバーにそれぞれ加えます。コラーゲンゲルが水没していることを確認し、必要に応じてさらに培地を追加します。
ウェルプレートを一晩培養用の細胞培養インキュベーターに入れます。7日目の水中では、手動ピペットを使用して、各コンストラクトの下部と上部のチャンバーからメディアを収集して廃棄します。透過性膜の真下に貼り付けたメディアを収集するには、ピペットチップを膜の下に置き、挿入物を一時的にノックアウトします。
各ウェルの下の部屋に5%FPSを補充したヒト皮膚同等物またはHSE培地の1ミリリットルを加え、各ウェルの上部チャンバーに200マイクロリットルの細胞懸濁液を加える。ケラチノサイトを真皮構築面に直接播種し、インキュベーターで2時間落ち着かせる。ケラチノサイトを播種してから2時間後、慎重に300マイクロリットルのHSE培地を添加し、各コンストラクトの上部チャンバーに5%FPSを添加した。
媒体をロードした後、コンストラクトをインキュベーターに戻します。手動ピペットを使用して、上部チャンバーからのメディア廃棄物のみを除去することによって、各コンストラクトを空気液体インターフェース(ALI)に持ち上げます。触れたり損傷を与えたりすることなく、表皮層にできるだけ近づけるようにしてください。
プレートを異なる角度で傾けてメディアを収集し、一貫した湿度を維持するためにプレート内の周囲の井戸に約2ミリリットルの無菌水を加えます。数時間後にプレートを確認して、角化細胞がまだALIに残っていることを確認してください。上部の部屋のメディアを取り外し、各井戸からどれだけのメディアが取り除かれるかを追跡します。
表皮層は乾燥ではなく水分補給に見えるはずですが、構築物の上にメディアをプールしてはいけません。免疫蛍光染色用の構成体を調製するには、インサートを逆さまにして、ウェルプレートの上に置きます。細かい先端鉗子または精密ナイフを使用して膜の円周の約半分を切断しながら、片手で挿入物を安定させる。
プラスチックハウジングの近くにできるだけ近く切ります。細かい先端鉗子を使用して、切断された膜のフラップの端をつかみ、VHSE構造と同様に挿入物から多孔質膜を穏やかに剥がします。構造がチャンバーの側面に詰まった場合は、細かい先端鉗子または小さなすくい器を使用して井戸に移動します。
VHSEが井戸に入ったら、挿入膜の残りの部分を捨て、染色中にVHSEを水没位置に保持するために各ウェルに培養挿入ハウジングを保持します。イメージングの2日前に、ポリジメチルシロキサンまたはPDMSを調製する。任意のクリーンな混合容器を計量バランスに置き、スケールを切ります。
ベースを追加し、クロスリンカーを追加します。溶液を少なくとも4分間激しく攪拌し、小さな泡を作り出します。十分な混合の後、90または100ミリメートルのペトリ皿にPDMSを注ぎます。
すべての気泡が消え、PDMSがクリアされるまで、真空チャンバー内のPDMSを脱気します。真空をゆっくりと解放し、PDMSを取り外します。皿をオーブンに入れ、摂氏50~60度で一晩硬化させ、PDMSが均等に治癒するために皿が平らに座っていることを確認します。
イメージングの1日前には、VHSE構成体と同じサイズのPDMSシートから円形の井戸をパンチまたは切り取るために、スチールパンチまたはハンドヘルド精密ナイフを使用してください。円形ウェルの周りに正方形のパッチをカットして、単一のPDMSウェルを作成します。PDMSと同様のサイズのガラスカバースリップを使用すると、PDMSの底面にシアノアクリル酸接着剤を追加し、使い捨てのピペットチップで均等に塗ります。
ガラスを中央に置き、PDMSに十分に押し込み、パンチされた円の中に透明なガラス窓を残します。接着剤を使用する前に一晩乾燥させてください。表皮および真皮の特性評価は、VHSE構築物におけるヒト皮膚に対して適切な免疫蛍光マーカーを示す。
サイトケラチン10は、通常、皮膚同等物のすべてのスラビサル層をマークする初期分化ケラチノサイトマーカーである。インボルクリンおよびフィラグリンは、ケラチノサイトにおける後期分化マーカーであり、皮膚同等物の上層最上の上の分化マーカーである。VHSEをクリアすると、1つの設定で簡単なイメージングが可能になり、真皮と表皮を別々に画像化するために構築物の方向を変更する必要がなくなりました。
容積画像を使用すると、各構成体全体で血管構造をマッピングする 3D レンダリングを生成できます。画像スタックは計算ソフトウェアにロードされ、3Dレンダリングと定量化にはカスタムアルゴリズムが使用されました。骨格化は、各コラーゲンIVマーク容器の決定的な中心を決定し、得られたデータは血管径と血管分率を計算するために使用された。
この手順に従って、バリア分析、走査型電子顕微鏡、脂質プロファイルなどの特性評価方法を実行して、血管系が表皮成熟および安定性に特異的に及ぼす影響を理解することができる。このプロトコルは、血管化皮膚モデルにおける組織関連および細胞型特異的研究を可能にする。特に老化や個別化医療の研究に適しています。
