この研究は、ウィスコンシン州とウィスコンシン州の子どもの研究所の少年Diabetesat医科大学のマックスマギー国立研究センターによってサポートされていました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析の役割、または原稿の準備がなかった。

1。抑制アッセイを設定する前に、その後の細胞の刺激とするための抗ヒトCD3（クローンUCHT1、最終濃度1μg/mlの）でコーティングtosylactivatedビーズへの1つのニーズは、ビーズが効率的に人間を用いた in vitro増殖アッセイで設定することによって被覆されているかどうかを確認するT細胞<ol><li>オリジナルバイアル、磁気スタンドの場所からM - 450 tosylactivatedビーズを1mlを取り、すべてのビーズがチューブの側面に付着するまで押し続けます。チューブは、磁気スタンドに入れたままでバッファを削除します。 37、撹拌機を再懸濁しますビーズをbuffer1の1mlの抗ヒトCD3の40μlのを追加°、磁気スタンドからチューブを取り、buffer1の1mlを追加、再び磁気スタンドにチューブを配置し、チューブを磁気スタンドにある間buffer1を削除するC 15分間、0.1％w / vのBSAを追加し、次の16時間攪拌を続行。 </li><li>バッファを削除するとbuffer2の1mlのビーズを再懸濁さ;ビーズがある℃、一回5分間buffer3で2〜8℃上記で説明したように磁気スタンドを使用して2〜8℃で5分間二回buffer2でビーズを洗浄4 × 10 8 / mlの最終濃度、使用できるようになります。 </li><li>分注し50,000 25000 PBMC /ウェル、96ウェルプレートでトリプリケートでとCD3でコーティングされたビーズの数が可変（4 × 10 8ビーズ/ mlと、CD31μg/mlの、例えば1、2、3、4、5ビーズ/細胞追加）細胞当たりのビーズの最適数を決定するために。文化の中で72時間後、1μCi[3 H]チミジンを追加し、37℃でインキュベートし、次の16時間継続する。マルチスクリーン収穫プレート（ミリポア）で収穫細胞は、シンチレーション液を追加し、トップカウントNXT（パッカード、CT）を使用しても/分当たりのカウント（cpm）をお読みください。抑制機能を失う可能性が制御性T、の過剰刺激を避けるために、ビーズ/インプレッション単価が5000を超えている細胞の比率が15000未満を使用してください。通常、3ビーズ/細胞の比は、これまでに1から4までテストしたすべての被験者群でのレスポンダとTreg細胞の両方を刺激する。 </li></ol> 2。地元の輸血センターから健康なドナーからのまたは人間leukopacksまたはバフィーコート（BC）からの全血からPBMCを分離、通常健康なボランティアから採取し、無料で利用できる（図1） <ol><li> BC（〜50ml）にPBS 1:6を（250ミリリットルを追加する）希釈してください。今すぐ300ミリリットルの合計体積があります。徐々に15ミリリットルをFicoll - Paqueの上に希薄化後のBCの25ミリリットル層PLUSは、層を乱すことなく、50ミリリットルのファルコンチューブに加えた。 4℃で30分間800xg（スイングバケットローターSH - 3000とソーバル遠心機で1400rpm）で遠心° C、ブレーキをオフにした。 </li><li>慎重にPBMC層（中間相）を収集し、新鮮な50ミリリットルファルコンチューブに移す。 DPBSで50ミリリットルにチューブが満杯になってPBMCを洗ってください。つのチューブに2細胞ペレットを収集する。で10分間4℃で400xgで遠心分離、二回一本のチューブに2細胞ペレットを組み合わせたたびに洗浄ステップを繰り返します。シングル50ミリリットルチューブにすべての細胞ペレットを組み合わせる。 </li><li>トリパンブルー排除試験を用いてPBMCを数えます。染色トリパンブルーの180μlにPBMCの20μlのを追加してトリパンブルーで1:10希釈液を加えます。よく混和して、直ちに血球計でカウントする20μlのかかります。二つの四角いブロック16より小さい正方形を含むそれぞれの内にあるすべての未染色とのみ青色に染色された細胞数を数える。両方の数値の平均を取ると10を掛けます。 PBMC / mlの数を得るために100でこの数を分け。生存細胞の割合として計算する[1 - （全細胞の青色のセル/数の数）× 100]。生存率が≥95％の場合進みます。 </li></ol> 3。 CD4 T細胞のMACS事前ソート<ol><li>先に進む前に、新しいチューブにPBMCの1mlを転送する、5000rad - これらは、抗原提示細胞（APC）になると照射のために細胞を調製するためにメディアの4ミリリットル加える。 </li><li> 4℃で10分間PBS/2mM EDTA/0.5％BSAバッファー中で250xgでの細胞の残りを遠心分離℃にPBS/2mM EDTA/0.5％BSAバッファーの4ミリリットルで上清、再懸濁します細胞を捨て。 </li><li> MACS抗CD4マイクロビーズ200μlのを追加し、4℃でインキュベート℃で20分間。 </li><li> 4℃で10分間250xgでPBS/2mM EDTA/0.5％BSAバッファーと遠心の40ミリリットルを追加することで、洗う℃に脱気、室温PBS/2mM EDTA/0.5％BSAバッファーの8ミリリットルの上清と再懸を捨て。 </li><li> LSカラム上にロードする前に、プレセパレーションフィルターを使用してフィルタ - 別々の細胞懸濁液。 </li><li>キャリブレーションLSカラムに各細胞懸濁液および層の4ミリリットルを分割（deggassed PBS/2mM EDTA/0.5％BSAバッファーの3ミリリットルを持つ）。 LSカラムはMidiMACSセパレータに固定されています。細胞懸濁液は、再実行のフロースルー、不足またはdeggassed室温PBS/2mM EDTA/0.5％BSAバッファーの3ミリリットルを加えるとバッファがから実行できるようにする前に。それが出て明らかになるまでより多くのバッファを追加。 </li><li> LSのカラムにピペット5ミリリットルdeggassedバッファ、〜1.0ミリリットルを介して実行させる新しい滅菌15ミリリットルコレクションチューブにMidiMACSセパレータと場所からLSカラムを削除します。列にプランジャーを入れて、ゆっくりと残りの部分を押してくださいボリュームから。 </li><li>両方のLSの列でも同じことが二CD4 +分画を組み合わせる。 50ミリリットルPBSとカウントセルを追加します。予想される収量は、5 × 10 8細胞までです。 2ミリリットルPBS/2mM EDTA/0.5％BSAバッファー中でも10分、懸濁し、細胞のために400xgで遠心分離します。 </li></ol> 4。蛍光活性化細胞選別（FACS）の分離（図2） <ol><li> 、抗ヒトCD8 - FITC（クローンRPA - T8）、抗ヒトCD14 - FITC（クローンM5E2の20μlを、20μlの次の細胞表面マーカー（光から保護保持）にCDのマーカーに対する抗体のカクテルを作るLPS受容体）、抗ヒトCD32 - FITC（クローンFLI8.26の20μlを、FcγRのタイプII）と抗ヒトCD116 - FITC（クローンM5D126μlの、GM -CSFRαチェーン）とは、代わりに、40μlの抗を追加ヒトCD4 - APCCy7（クローンRPA - T4）。 </li><li> 5μlのは、2ミリリットルの細胞懸濁液を取り出し、汚れカクテルの2μlのと染色、これは、しきい値（蛍光色素マイナスOne - FMO）5を決定するためのチューブです。 </li><li>染色カクテルに、そして4℃で30分で細胞懸濁液とインキュベートするカクテルを追加し、抗ヒトCD25 - PE（IL -2RαクローンM - A251）の50μlを追加。 PBS緩衝液、10分および10 7 / mlの細胞濃度に懸濁し、細胞のための400xgで遠心分離で細胞を洗浄。 </li><li>未染色の細胞と細胞またはFACSアリア（BD Biosciences社、サンノゼ、ニュージャージー州）での細胞選別のために補償制御として使用する単一の蛍光色素で染色されたビーズを準備します。 </li><li>ユーザーは、CD25 + T細胞（図2a）のソートのしきい値を設定できるようになりますFMOチューブに細胞を取得する。単球、マクロファージおよび他のすべてのCD4 + -非T細胞（図2b）からなるFITC陽性細胞を除外するためにFITC -陰性細胞の周りのゲートを設定します。 </li><li>別のプロットでは、CD25 -、CD25lowとCD25high T細胞- Tregsの（CD25の最大数を発現する細胞の上位1％）（図2c）のためにゲートを描きます。細胞サブセットは一般的に高純度（図2d、2eと2fを）示しています。 </li><li> 10分間400xgで細胞を用いたコレクションチューブを遠心し、メッキまで氷上で保管して下さい。 </li></ol> 5。 200μl/wellで96穴プレート（表1として添付する方式）で細胞培養を設定する<ol><li> CD3でコーティングされたビーズのアリコート50μlの（1μg/ mlの）は3ビーズ/ U -底部では10％プールしたヒトAB血清で完全なメディアに再懸濁してウェル内のレスポンダのセル、96ウェルプレートになるように計算。 （たとえば、CD3でコーティングした2ミリリットルのメディアを作るために、CD3でコーティングされたの株式ビーズ-最終濃度4 × 10 8 / mlから7.5μl取るとメディアの2ミリリットルで希釈し、すべての50μlのは75,000 beads-3beads/cellが含まれます）。 </li><li> 5 × 10 5 / mlの細胞濃度と、&quot;唯一のTregsの&quot;というラベルの井戸を含む、以前に追加した刺激、との各ウェルに（2.5 × 10 4細胞を含む）50μlずつを追加し、&quot;APCだけ&quot;と、表の&quot;メディアのみ&quot;に照射APCを薄める1。 </li><li>表1の設計は、次の連で2.5 × 10 4 /ウェルCD4CD25 -またはCD4CD25low T細胞を追加。 </li><li>比1:10（2,500 Treg細胞）の共培養（列B、表1）にし、&quot;唯一のTregsの&quot;というラベルのウェルにTregsのを追加し、5％CO 2とCO 2インキュベーターで37℃プレート℃でインキュベートする、72時間飽和湿度インチ</li><li>パルス1μCi[3 H]チミジンをウェルの中とは° C次の16時間37℃でインキュベーションを続ける。 </li></ol> 6。収穫とカウント<ol><li>パッカードfiltermate収穫機または別のシステムを使用してマルチスクリーン収穫プレート上に細胞を回収。 </li><li>シンチレーション液（Microscint 20）追加、最後のステップの準備のために透明なプラスチックカバーでプレートを収穫するカバー。 </li><li>分当たりのカウント数（cpm）を読んで/ウェルトップカウントNXT（パッカード、CT）または別のシステムを使用して。 </li></ol> 7。抑制のコンピューティングの割合<ol><li>細胞は三連で培養したように、平均を各条件ごとに計算されます。変動係数が&gt; 30％の場合、外れ値が排除され、2つの井戸からのみCPMは平均化されます。抑制の割合は、共培養の単文化とc = CPMの計算[（SC）/秒] × 100％、S = CPMすることによって得られる。 </li><li>ナイーブ（CD25 -）とin vivoで活性化（CD25low） にエフェクターT細胞は、レスポンダーT細胞として播種され、これらのサブセットの各々を抑制する制御性Tの能力の差が前提に基づいて潜在的な機能的な予後の指標として取り込まれ、使用されているようにその活性化細胞では抑制が困難です。 </li></ol> 8。代表的な結果： 方法に大きなばらつきが使用され、in vitroでヒトの抑制アッセイから得られた結果は、私たちはアッセイ1に影響を与える条件の総合的な研究を実行するためのプロンプトが表示。我々は以前の6に決定Teffs（1:10）、：私達はTregsの間に低比を考慮するだけでなく、Tregの機能をテストする検定だけでなく、その純度を開発している。さらに、Tregsのは目に異なる免疫バランスが侵害された場合T1D開発するためにリスクのある被験者のように成功し、ナイーブと、図3に、より顕著になる私たちの以前の研究2,4に示すように、さらに健常者の in vivo活性化T細胞における抑制するEIRの能力。アッセイは、LS（最近発症（RO）T1Dと長年、私たちは健康な制御との間でそれらの機能を比較することが、我々は自然（nTregs）の抑制機能を比較して研究、誘導（iTregs） と in vitro拡張のnTregs で非常にうまくいった）T1D科目。我々はRO T1D被験者はLS T1Dと健常者7に比べて機能的iTregs両方と拡張nTregsを生成するのより良い能力を持っていたと結論づけた。したがって、このアッセイは免疫不均衡の初期および後期の状態の両方の認識に優れたツールとして使用することができます。 in vitroでの抑制アッセイのために必要な手順のスキーム1回路図のプレゼンテーション<img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig1.jpg" alt="図1"/> 図1写真を提示in vitroでの抑制アッセイのステップ<img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig2.jpg" alt="図2"/> FACS細胞の分離2。ゲーティング戦略図 。 ）CD25 +しきい値は、FITC -陰性細胞は（さらにゲートしたとCD + CD25 -、CD + CD25lowとCD + CD25highとして収集された）細胞は、C FITC陰性としてゲーティングした）蛍光色素マイナスワン（FMO）、Bに応じて調整された割合、dで示すように、Tregsのは））、電子、ソート後にTregsのをソートFACS）ソート後にソートされたCD + CD25lowをFACS、およびf）ソート後にソートされたCD4 + CD25 - T細胞をFACS <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。健常者の代表の結果）関連するすべての細胞サブセットのための単一文化として提示健常者（ナイーブ- CD25 -、in vivoで活性化- CD25low で 、抗原提示細胞- APCの毎分のカウントの代表的な結果（CPM）がと各CD25 -と自己制御性TによってCD25lowレスポンダーT細胞は健常者のために提示されている（nの抑制の制御性T細胞- Tregの）だけでなく、レスポンダーT細胞の共培養（CD25 -またはCD25low）とTregsの。B）の割合= 4）。抑制は、共培養の単文化とc = CPMで[（SC）/秒]として× 100％、S = CPMを計算した。レスポンダーT細胞を抑制する制御性Tの容量のわずかな違いが気づいていたが、それは。C（t検定P = 0.08ペア））発表は、応答側としてCD25 -とCD25lowを含め、それぞれ単一の文化のためのリスクの被験者でのcpmである有意ではなかったT細胞だけでなく、それぞれのレスポンダーT細胞サブセットは、自家で各CD25 -とCD25lowレスポンダーT細胞の抑制の制御性T（CD25-/TregsとCD25low/Tregs）。d）の割合で播種されたAPCとTregsの、そして共培養Tregsのは、リスクの被験者（N = 4）でのために提示されます。 CD25 -対CD25lowレスポンダーT細胞を抑制する制御性Tの能力の差は有意であった（t検定P = 0.04をペアになった）。 表1。回路図は 、in vitro 抑制アッセイのセットアップ<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1月3日</td><td> 4月6日</td><td> 7月9日</td><td> 10月12日</td></tr><tr><td> A </td><td> CD4CD25 - </td><td> CD4CD25low </td><td>メディアのみ</td><td>メディアのみ</td></tr><tr><td> B </td><td> CD4CD25 - / Tregsの</td><td> CD4CD25low / Tregsの</td><td>のみTregsの</td><td> APCのみ</td></tr><tr><td> C </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> D </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> F </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> G </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> H </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

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利害の衝突は宣言されません。

Tregsのへの唯一のユニークな特徴として、抑制機能は、同じ内および異なる研究間の疾患の開発のさまざまな段階での被験者の間で確実にかつ均一にテストする必要があります。我々は、このアッセイの標準化への貢献として、当研究室で開発抑制アッセイの詳細を提供します。私たちの広範な最適化の研究では、我々は自然の刺激を提供するAPCとしてPBMCとの併用で抗ヒトCD3でコーティング...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬や器具の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>をFicoll - Paque PLUS </td><td>アマシャムファルマシアバイオテク</td><td> 17-1440-03 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS - 1X </td><td>ギブコ</td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>インビトロジェン</td><td> 15250-061 </td><td></td></tr><tr><td>抗CD4マイクロビーズ</td><td>国内でのみ有効</td><td> 130-045-101 </td><td></td></tr><tr><td>プレセパレーションフィルター</td><td>国内でのみ有効</td><td> 130-041-407 </td><td></td></tr><tr><td> LSカラム</td><td>国内でのみ有効</td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td>インビトロジェン</td><td> 15575-020 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> B4287 </td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトCD4 - APCCy7（クローンRPA - T4） </td><td> BD Pharmingen社</td><td> 557852 </td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトCD25 - PE（クローンM - A251、IL -2Rα） </td><td> BD Pharmingen社</td><td> 555432 </td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトCD8 - FITC（クローンRPA - T8） </td><td> BD Pharmingen社</td><td> 555366 </td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトCD14 - FITC（クローンM5E2、LPSの受容体） </td><td> BD Pharmingen社</td><td> 555397 </td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトCD32 - FITC（クローンFLI8.26、FcγRのタイプII） </td><td> BD Pharmingen社</td><td> 555448 </td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトCD116 - FITC（クローンM5D12、GM -CSFRαチェーン） </td><td> BD Pharmingen社</td><td> 554532 </td><td></td></tr><tr><td> Dynalbeads M - 450 tosylactivated </td><td>インビトロジェン</td><td> 140から13 </td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトCD3 </td><td> Ancell </td><td> 144から024 </td><td></td></tr><tr><td> Buffer1 </td><td>手作り</td><td></td><td> 0.1MのNa 2 B 4 O 7 pH7.6 </td></tr><tr><td> Buffer2 </td><td>手作り</td><td></td><td> PBS/2mM EDTA / 0.1％BSA pH7.4の</td></tr><tr><td> Buffer3 </td><td>手作り</td><td></td><td> 0.2M Tris/0.1％BSA pH8.5 </td></tr><tr><td>完全RPMI培地</td><td>手作り</td><td></td><td> RPMI 1640培地2mM L -グルタミン、5mMのHEPES 100 U /μg/ mlのpeni / strept 0.5mMのピルビン酸ナトリウム</td></tr><tr><td> [3 H]チミジン</td><td>パーキンエルマー</td><td> NET027Z005MC </td><td></td></tr><tr><td>人間のプールされたAB血清</td><td>アトランタバイオ</td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td>マルチスクリーン収穫プレート</td><td>ミリポア</td><td> MAHFC1H60 </td><td></td></tr><tr><td> Microscint 20 </td><td>パーキンエルマー</td><td> 6013621 </td><td></td></tr></tbody></table>

human in vitro suppression as screening tool for the recognition of an early state of immune imbalance

制御性T細胞（Treg）は自己抗原に対する免疫寛容の重要なメディエーターである。さらに、彼らは感染後の免疫応答の重要な調節因子である。 Tregsの上でユニークな表面マーカーを同定するための努力にもかかわらず、唯一のユニークな特徴は、エフェクターT細胞の増殖や機能を抑制する能力です。それが唯一のin vitroアッセイにおいてヒトTregの機能を評価に使用される場合があることは明らかですが健康な細胞と細胞（1型糖尿- T1Dのような）自己免疫疾患を有する被験者から分離された横断的研究からの結果を評価する際に、これは問題となる必 ​​要があります。比較する。応答者の比率とのin vitro抑制アッセイにおけるヒトで使用されている抗原提示細胞（APC）の数と種類：レスポンダーT細胞、刺激の性質と強さ、Tregの数と種類の研究所の間で大きなばらつきがあります。この変動は、困難なTregの機能を測定する研究間の比較を行います。 Tregのフィールドには、健常者と自己免疫疾患患者の両方でうまく動作する標準化された抑制アッセイを必要とします。我々は、膵β細胞の自己免疫破壊の根底にあるの被験者に比べて健康なボランティアから単離したT細胞の刺激ではほとんどのイントラアッセイのばらつきを示すin vitroでの抑制アッセイで開発した。この作品の主な目的は、異なる被験者グループ間の比較を可能にするin vitroでヒトの抑制アッセイで記述することです。さらに、このアッセイは、このように予防的免疫療法の1から利益を得ることができる科目を識別する、機能をnTregに小さな損失を描くと、将来のさらなる損失を予測する可能性を秘めています。以下、我々は、この手順に必要な手順の徹底的な説明を提供しています。我々はTregの機能を測定するために使用されるin vitroでの抑制アッセイの標準化に貢献したいと考えています。さらに、我々は免疫不均衡の初期の状態とT1Dのための潜在的な機能のバイオマーカーを認識するツールとして、このアッセイを提供する。

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Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregsのは、免疫系の強力な抑制因子である。それ故に、それらを定義するためにユニークな表面マーカーの欠如が存在する、Tregsのの定義は、主に機能的です。ここでは、最適化を説明<em&gt; in vitroで</emT1D開発するリスクのある被験者において免疫不均衡を識別することができる&gt;アッセイ。

ヒトのインビトロ</em免疫バランスの初期状態の認識のためのスクリーニングツールとして>抑制

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

human-vitro-suppression-as-screening-tool-for-recognition-an-early

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

14.4K ビュー.  Medical College of Wisconsin. Tregsのは、免疫系の強力な抑制因子である。それ故に、それらを定義するためにユニークな表面マーカーの欠如が存在する、Tregsのの定義は、主に機能的です。ここでは、最適化を説明 in vitroでアッセイ。

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

免疫・感染学

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

ゼブラフィッシュにおける自然免疫の健康の指標として呼吸バースト応答の定量化

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

使用肺炎球菌植民に対するプロバイオティクスの影響を調査<em&gt;体外</em&gt;接着アッセイ

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

西ナイルウイルス変異株の感染に対するMyD88非介在細胞性免疫応答のインビトロ分析

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

アン<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV重感染のコンテキストでのマラリアに対する免疫応答を測定するためのモデル

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

調節するc-ジ-GMPシグナリングで、小さな分子をスクリーニングするためのハイスループットセットアップの確立<em&gt;緑膿菌</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in myelin destruction, which not only slows conduction of nerve impulses, but causes axonal injury resulting in motor and cognitive decline. Current treatments for MS focus on attenuating immune cell infiltration into the central nervous system (CNS). These treatments decrease the number of relapses, improving quality of life, but do not completely eliminate relapses so long-term disability is not improved. Therefore, therapeutic agents that protect the CNS are warranted. In both animal models as well as human patients with MS, T cell entry into the CNS is generally considered the initiating inflammatory event. In order to assess if a drug protects the CNS, any potential effects on immune cell infiltration or proliferation in the periphery must be ruled out. This protocol describes how to determine whether CNS protection observed after drug intervention is a consequence of attenuating CNS-infiltrating immune cells or blocking death of CNS cells during inflammatory insults. The ability to examine MS treatments that are protective to the CNS during inflammatory insults is highly critical for the advancement of therapeutic strategies since current treatments reduce, but do not completely eliminate, relapses (i.e., immune cell infiltration), leaving the CNS vulnerable to degeneration.

This protocol describes how to determine whether pharmacological treatments for experimental autoimmune encephalomyelitis show CNS protection as a consequence of suppressing immune cell infiltration or are neuroprotective during the onslaught of immune cell infiltration.

自己免疫性脱髄に薬理学的介入のためのCNS保護に対する免疫系の抑制を決定します

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

使用してリンパ球血管外漏出の分析<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト血液脳関門のモデル

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

18FDG PET/CT イメージング勉強結核感染と非ひと霊長類における治療のためのツールとしての解析

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

ヒトのインビトロ抑制