著者らは、キム·ラボ、有用な議論やデータ共有のためのゼブラフィッシュのケアとメンテナンス、ロバート·ウィーラーのためのマークNilanの過去と現在のメンバーに感謝して、NIHの助成金3RO1GM087308-02S1と1P20RR024475-01A2およびメイン州農林う資金調達のために駅（公開番号3303）を試してみてください。

1。ゼブラフィッシュケアとメンテナンス<ol><li>畜産：マススポーン大人のゼブラフィッシュは、以前に13を説明した。以前に14を説明したように生成された胚を収集します。 </li><li>マイクロインジェクション（必要な場合）：ホリノオリゴヌクレオチドを用いたマイクロインジェクション1-4細胞期のゼブラフィッシュ胚以前に15を説明するように遺伝子産物を過剰発現するように遺伝子産物またはmRNAをノックダウンする。 <ol><li>モックの十分なプールを維持するには、コントロールを注入された（少なくとも48の生活、モックが実験的に操作魚が96ウェルマイクロプレートを埋めるために必要とされる、コントロールの魚と48の生活に注射）。 </li></ol></li><li>胚を維持：卵の水に28℃で、深いペトリ皿の中の胚を育てる目的の発達段階（呼吸バースト応答はゼブラフィッシュ胚でこのプロトコルを使用して検出可能でなくなるまで（60μg/ mlのインスタントオーシャンシーソルト水オートクレーブ蒸留）より若い2日）は受精12を投稿してください。注：は、Oでした1 -フェニル-2 -チオ尿素の使用（PTU）のいずれかを介してゼブラフィッシュ胚における色 ​​素沈着を予防またはgolden/slc24a5変異体ゼブラフィッシュが大幅にPMA（未発表データ、48でテスト胚、72、および96によって蛍光の誘導を変化させないことをbserved HPF）。 <ol><li>プラスチックホールピペットで毎日死んで胚を削除します。 </li><li>慎重に古い卵の水をデカントし、毎日新しい卵の水で補給してください。 </li></ol></li><li>実験当日、dechorionate胚（胚は彼らの絨毛膜に残っている場合）以前に2細かい鉗子14を用いて説明したように（この呼吸バーストアッセイはまた、腎臓のための大人のゼブラフィッシュ12および詳細なプロトコルから解剖腎臓に実行できます。Dechorionate胚大人のゼブラフィッシュからの解剖は、以前）16,17に記載されている。 </li></ol> 2。溶液の調製<ol><li> H2DCFDAの原液を準備します。H2DCFDA 1mgを秤量。 <ol><li>ディ1 mg / mlのストック溶液を作るためにジメチルスルホキシド（DMSO）1ml中のH2DCFDAのssolve 1ミリグラム。 </li><li> 1.7ミリリットルマイクロ遠心管中でこの原液22μlのアリコートを作る。 </li><li>アルミ箔でH2DCFDA原液の一定分量をラップし、H2DCFDAは感光性であるため、暗い可能な限りおいてください。 </li><li>最大3ヶ月間-20℃で保存H2DCFDA分量。 </li></ol></li><li>注意-ホルボールミリステートアセテート（PMA）の原液を準備し、適切な個人用保護具（ すなわち 、手袋、ゴーグルとマスク）を使用して、PMA 1mgを秤量。 <ol><li> 1 mg / mlのストック溶液を作るためにDMSO 1ml中にPMAを溶解する。 </li><li> 1.7ミリリットルマイクロ遠心チューブに11μLずつを加えます。 </li><li>最大3ヶ月間-80℃でのPMA原液の店舗ずつ。 </li></ol></li><li> H2DCFDAのワーキング溶液を調製します。実験の日に、1に1部H2DCFDA原液を添加することにより、H2DCFDAワーキング溶液を作る部品のDMSO（500μg/ mlのH2DCFDA最終濃度）。例えば、H2DCFDAストック溶液20μlを追加し、ホイルに20μlのDMSOを1.7 mlマイクロチューブを包んだ。 </li><li> PMAのワーキング溶液を調製：実験の日に、49の部分に、ヌクレアーゼフリーの水を1部、PMAのストック溶液を添加することによって、PMA作業溶液を作る（20μg/ mlのPMA最終濃度）。例えば、1.7ミリリットルのマイクロチューブに490μlのヌクレアーゼフリーの水で10μlのPMA原液を希釈。 </li><li> H2DCFDAの投与溶液の調製：実験の日に、卵の水に1μg/ mlのH2DCFDAの最終濃度でH2DCFDAの投与溶液を作る。投与溶液の調製容積は、所望のように変更したが、試薬の最終濃度が維持されていることを確認することができる。腎臓の場合は、代わりに卵の水、（フェノールレッドなしで、50％のDMEM、50％のF-12）ダルベッコ改変イーグルmedium/F-12の同じボリュームを使用しています。 H2DCFDAの5ミリリットルを作成するには解決策を投与、コニカル遠心管をホイルで包み、 &#39;H&#39;とラベル15ミリリットルに5卵mlの水（またはDMEM/F-12）を転送するために5ミリリットル血清学的ピペットを使用しています。 <ol><li> 15ミリリットルから10卵の水の液（またはDMEM/F-12）を削除 &#39;H&#39;とラベル円錐管、廃棄します。 </li><li> （このボリュームは48胚または腎臓サンプル（全96ウェルマイクロプレートの半分のために十分である）混合する「H」とボルテックスラベル15ミリリットルコニカルチューブにH2DCFDA作業液10μlを追加し、これらのウェルは、レベルの測定を提供します）バックグラウンド蛍光の。 </li></ol></li><li>実験の日に、最終濃度でH2DCFDA + PMAの投与溶液行います：H2DCFDA + PMAの投与溶液を準備しH2DCFDAを - 1μg/ mlのとPMA - 400 ng / mlの。 H2DCFDA + PMA投与溶液5mlを加えるには、「H + P」という新しい15ミリリットルコニカルチューブに卵、水（またはDMEM/F-12）の5ミリリットルを転送するために5ミリリットル血清学的ピペットを使用しています。 <ol><li> _ 110を削除する6; &#39;H + P」とラベル15ミリリットルから卵、水（またはDMEM/F-12）のL円錐管、廃棄します。 </li><li> 、H2DCFDAワーキング溶液10μlを追加 &#39;H + P」とラベル付けされ、その後15ミリリットルに、PMA作業溶液100μlを加え円錐管と混合する渦（このボリュームは、48サンプルまたは完全な96ウェルマイクロプレートの他の半分のために十分である）。 </li></ol></li><li>氷上の投与溶液を保管してください。 </li></ol> 3。マイクロプレートリーダープログラミング<ol><li>マイクロプレートリーダーの電源をオンにします。楽器を準備します。 <ol><li>光源のウォームアップ。 </li><li>蛍光読み込むプログラムが設定しますが例えば励起：485 nmの、放射：528 nmの、光学位置：トップ510ナノメートル、感度：65、先読みにステップを振っ5秒で。 </li></ol></li></ol> 4。 96穴マイクロプレートのセットアップ（ 図2を参照） <ol><li>消耗品を収集します。絨毛膜を除去した胚と皿、黒の96ウェルマイクロプレート、P200ピペッターとを取得ヒント、H2DCFDAおよびH2DCFDA + PMA投与溶液、マルチチャンネルP200ピペッター、2無菌貯水池、アルミニウム箔およびはさみでアイスバケット。 </li><li> 96穴マイクロプレートの各ウェルに転送1胚：使用はさみピペットチップをカットするように開口部を通って適合する胚または腎臓。 <ol><li>必要に応じて（それは各々が異なるため、ピペットチップを変更する必要はありません100μlにP200ピペッターを設定し、黒の96ウェルマイクロプレートのウェルのような多くに卵、水（またはDMEM/F-12）と一緒に1胚を転送胚の実験条件内のサンプルが、これは実験条件間でチップを交換する必要があるかもしれない）。これらは、収集されたデータをゆがめる傾向があるので、残留絨毛膜を転送しないようにしてください。腎臓の転送のために、（100μlに設定された）大きな体積ピペッターを使用することができ、必要に応じてピペットチップは、より大きな孔サイズを得るために切断することができる。これは、胚または腎臓試料なしでウェルを組み込むことが必要であるが、有することができるいくつかの実験操作を制御するために投与溶液。 </li></ol></li><li>投与溶液を追加し、滅菌25ミリリットルリザーバーにH2DCFDAの投与溶液を注ぐ。 <ol><li>同時に96ウェルマイクロプレート（H2DCFDAの500 ng / mlの最終濃度）に1列にH2DCFDA投与溶液100μlをピペットするためにマルチチャンネルP200ピペッターおよび8のヒントを参考にしてください。 </li><li> （全体の96穴マイクロプレートを充填した場合、通常は6列または48ウェルの）必要な数の列に対して、この（TIPSの変更が必要ありません）を繰り返します。対照胚サンプルと実験的に操作胚サンプルの半分は半分にこのソリューションを追加します（例：96ウェルマイクロプレートを設定し、図2に示されている、これらのウェル（オレンジ色）、PMAで誘導していない試料では、バックグラウンド蛍光データを提供します） 。 </li><li>新しい滅菌25ミリリットルリザーバーにH2DCFDA + PMAの投与溶液を注ぐ。 </li><li> simultするマルチチャンネルP200ピペッターおよび8のヒントを参考にしてくださいaneously（、ヒントを変更することは必要ありませんミリリットルH2DCFDA-500 NG /およびPMA-200 ng / mlの最終濃度）を96ウェルマイクロプレートの残りの列（ 図2の赤で表示）にH2DCFDA + PMA投与溶液100μlをピペット。 </li></ol></li><li>アルミホイルでマイクロプレートをカバーしています。 </li><li>各ウェル内の溶液を均質化する150 rpmで約20秒間、マイクロプレートを横に振る。 </li><li>それが読まれていないときに28℃でマイクロプレートをインキュベートする。 </li></ol> 5。蛍光定量<ol><li>ステップ3.1.2で説明したパラメータを使用して、PMAの添加後の時間= 0時間目に、マイクロプレートをお読みください。 <ol><li> （PMAの添加後4時間など ）所望の時間間隔のための測定を数分おきに撮影を続行以降の時点まで、28℃でのホイル包まれたマイクロプレートをインキュベートし、目的の時点で、エンドポイントの測定を行う。 </li></ol></li><li>プラスチックtを使用するウェルから胚を取得する順伝達ピペット。 </li><li> 、あなたの動物のケアと使用プロトコルに従ってトリカインMS222における例えば浸漬胚を安楽死させる。 </li><li>バイオハザード廃棄物容器内のマイクロプレートや他の使い捨て材料を処分。 </li></ol> 6。データ解析<ol><li>あなたは、蛍光値を比較したいと思いますた時点（PMA、 表1を加えた後例えば 4時間）を決定します。 </li><li>個々のPMA誘導対照群の蛍光値からの平均非誘導対照群の蛍光値を引きます。 </li><li> PMAとない実験群のためにこれを繰り返します。 </li><li> 2列、コントロール+ PMA群と実験+ PMA群（ 表2）、これらの正規化された蛍光値を格納します。 </li><li>コントロール+ PMA grouの正規化された蛍光値のための平均と標準偏差を計算するPと実験+のPMAグループ。 </li><li> （ 表2）の統計的有意性を決定するために、対応のないt検定を用いて正規化された蛍光値を比較する。 </li><li>グラフコントロール+ PMAグループと適切な標準偏差を反映してエラーバーを用いた実験+ PMAグループの手段。 </li><li>グラフ上や図の凡例（ 図2）における有意水準を記録します。 </li></ol>

<ol>
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著者らは、開示することは何もありません。

食細胞の主な機能は、検出巻き込む、および病原体を破壊することである。適切な呼吸バーストを生成する食細胞の能力は、この機能のために重要である。したがって、呼吸バースト応答の定量化は、個体群間および/または実験操作に応答して一般的な先天性免疫の健康および機能の比較を可能にする一つの方法である。ここでは、誘導し、定量化、および個々のゼブラフィッシュ胚のグル...

先天性および適応免疫：免疫システムは、2つのブランチで構成されている。自然免疫は、進化的に適応免疫よりも古代のです。脊椎動物は、先天性および適応ブランチの両方を有するのに対し、無脊椎動物は、現在、唯一の自然免疫を有すると考えられている。適応免疫は、特定の病原体に特異的かつ長期的な免疫を付与しながら、先天性免疫は、細菌、ウイルス、および真菌の侵入に対する即時応答である。自然免疫応答の重要な側面は、外国の侵略者を巻き込むと破壊する食細胞（ 例えば 、マクロファージ、好中球）の炎症と採用になりサイトカインやケモカインの放出を伴う。 成功した自然免疫応答が関与：侵入する微生物の（1）認識、適切なシグナル伝達カスケード（サイトカインおよびケモカインの例リリース）の（2）の誘導、食細胞の（3）適切な発達/十分な数、（4）感染の部位への食細胞の遊走、病原体（5）を飲み込み、そして微生物の貪食（6）の破壊。これらのステップのいずれか1の欠乏は圧倒されたホストにつながる、感染に屈する可能性があります。それはすべての植物や動物の病原体に対する防御の最前線であるため、堅牢な自然免疫応答は、生物の健康に不可欠です。脊椎動物では、それはまた、適応免疫応答を増強する1。そのため、我々はそれをよりよく理解し、その機能を最適化するために、自然免疫応答のすべての側面を評価することができることが重要です。 多くのモデル生物は、 アラビドプシスから℃の範囲、自然免疫の研究に使用されている培養したヒト細胞へのマウスにショウジョウバエの虫 。自然免疫の研究にゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）のモデルシステムを使用する利点は、ゼブラフィッシュは、先天性および適応の両方のIMで、脊椎動物であるということですmunity、まだ自然免疫と獲得免疫の開発が一時的に分離されています。適応免疫は約4〜6週間の受精後2を発生する、完全に機能するようになるまでのゼブラフィッシュは、単に感染に対する防御のための自然免疫に依存しています。遺伝子操作、光学的透明性と迅速な、外部の開発のためのツールに加えて、ゼブラフィッシュ胚における守備の原則モードなどの自然免疫は、 生体内での自然免疫応答の複雑さを研究するする単純化したモデルが用意されています。 複数のプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚における先天性免疫応答の異なるファセットを評価するために開発されてきた。マイクロアレイおよびRNAseqは、ゼブラフィッシュ自然免疫応答によって誘発されるサイトカインプロフィールがヒトのものと同様であり、また、先天性免疫3,4の予想外の遺伝子の関与が示唆されていることを検証しています。ゼブラフィッシュ胚および蛍光の透明性、トランスジーン病原体およびゼブラフィッシュのIC株は、リアルタイムで、生体内で動的な宿主-病原体相互作用の可視化を可能にします。好中球特有のミエロプロモーター 5,6またはマクロファージ特異的MPEG1プロモーター 7の制御下にGFPを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュ胚は、食作用および破壊を視覚化するために局所的な感染症の8と同様の部位への食細胞の遊走を可視化し、定量化することが可能になってきた蛍光標識された病原体8,9。ゼブラフィッシュ胚はまた、ハイスループットアッセイおよび化学スクリーンの生成に適している。従って、感染10と化学的に誘発される損傷の部位11に食細胞の移行の際にトランスクリプトーム解析のハイスループット法が最近開発されている。 上記の技術のうち、どれも定量的に食細胞による病原体の破壊の最終段階を評価しません。この最終段階飲み込ま病原体を殺す呼吸バースト（ すなわち 、ROSの生産および他の毒性化合物）を伴う。酵素NADPHオキシダーゼは、食細胞内ROSの主要な源である。酸素への電子の伝達におけるNADPHオキシダーゼ酵素結果のサブユニットのアセンブリー、スーパーオキシドアニオンを生成する。その後の酵素反応を介して、スーパーオキシドは、その後過酸化水素および次亜塩素酸（ 図1A）に変換することができる。これは、病原体を殺すため、ゼブラフィッシュ胚の呼吸バーストの可能性の定量化は、全体的な自然免疫の健康の指標である食細胞の呼吸バーストです。私たちは、個々のゼブラフィッシュ胚12のグループで呼吸バーストを定量化するための蛍光ベースのアッセイを開発しました。このアッセイは、市販の、細胞浸透性色素の非蛍光、還元体を利用する。この色素は、2 &#39;、7&#39;-ジクロロジアセテート（H2DCFDA）は、fluoresに変換される酸化時セント化合物、2 &#39;、7&#39;-ジクロロフルオレセイン（DCF）。食細胞呼吸バーストによって生成された多様なROSがH2DCFDAを酸化し、蛍光24を生成することができます。蛍光の出現は、ゼブラフィッシュのグループ間の呼吸バースト応答を定量化し、比較することができる。プロテインキナーゼCアゴニストホルボールミリステートアセテート（PMA）は、化学的にROSを生成するNADPHオキシダーゼを誘導し、従って、蛍光読み取り（ 図1B）を増加させるために使用される。ここに、我々は、このゼブラフィッシュ胚呼吸バーストアッセイの修正と最適化されたバージョンの詳細なプロトコルを提供する。このアッセイは、経時的および/ ​​または実験操作（ 例えば、モルホリノ媒介性タンパク質ノックダウン）に応答して、個々のゼブラフィッシュ胚の呼吸バースト群間を比較するために使用することができる。この方法の使用は、他のゼブラフィッシュ先天性免疫アッセイと連動して、複雑で重要なのより完全な像を提供する先天性免疫応答。

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>H2DCFDA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>35845-1G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP6851</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-5X10ML</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tricaine S MS222</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>100 grams</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM/F-12, No Phenol Red </td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Deep Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>#5 Dumont Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72700-D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.7 ml Micro Centrifuge Tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>10011-724</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-918</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5 ml Serological Pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Contact BioTek</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black 96 Well Microplate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-728</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 ml Sterile Reservoirs</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>3054-2003</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>P200 Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Multichannel Pipettor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-948</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-478</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantification of the respiratory burst response as an indicator of innate immune health in zebrafish

食細胞の呼吸バーストは病原体感染に対する自然免疫応答の一部であり、活性酸素種（ROS）の産生を伴う。 ROSは毒性があり、食作用を受けた微生物を死滅させるように機能する。食細胞由来のROSのインビボ定量は堅牢な自然免疫応答をマウントする生物の能力に関する情報を提供する。ここでは、食細胞の呼吸バーストの化学誘導時に全体のゼブラフィッシュ胚におけるROSを定量化し、比較するためのプロトコルを記述します。この方法は、ROSによる酸化の際に蛍光性となる非蛍光化合物を利用する。個々のゼブラフィッシュ胚は、マイクロプレートのウェルにピペットおよび呼吸バーストの化学誘導物質の有無にかかわらず、この蛍光性基質中でインキュベートする。各ウェルの蛍光をマイクロプレートリーダーを用いて、所望の時点で定量化される。蛍光読み取りは、バックグラウンド蛍光を除去するように調整され、次いで同時対応のないt検定を使用してmpared。この方法は、異なる発達段階で、そのようなタンパク質のノックダウン、過剰発現、あるいは薬理学的薬剤を用いた治療などの実験操作に応答したゼブラフィッシュ胚の呼吸バーストの可能性を比較することができます。この方法はまた、成体ゼブラフィッシュの腎臓および他のいくつかの魚種からの全解剖腎臓または細胞調製物中の呼吸バースト応答をモニターするために使用することができる。私たちは、このプロトコルの相対的なシンプルさと適応性は、既存のプロトコルを補完し、より良い自然免疫応答を理解しようと研究者を対象としています信じています。

ここでは、48および72時間後に受精（HPF）でのゼブラフィッシュ胚（野生型、AB型、バックグラウンド）での呼吸バースト応答を比較するデータを提供する。 48 HPFの胚は、我々の実験群としての対照群および72 HPFの胚を務めた。使用したサンプル·サイズは24非誘導胚および発達段階ごとの24 PMA誘導胚だった。 （相対蛍光単位（RFU）で生）蛍光読み取りを4時間PMAの添加後、マイクロプレートを...

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Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

自然免疫応答は、病原体感染に対する生物を保護します。自然免疫応答の重要な構成要素は、食細胞の呼吸バーストは、侵入する微生物を殺す活性酸素種を生成します。我々は、先天性免疫応答が化学的に誘発されたときに生成される活性酸素種を定量化する呼吸バーストアッセイを記載している。

ゼブラフィッシュにおける自然免疫の健康の指標として呼吸バースト応答の定量化

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

quantification-respiratory-burst-response-as-an-indicator-innate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.5K ビュー.  University of Maine. 自然免疫応答は、病原体感染に対する生物を保護します。自然免疫応答の重要な構成要素は、食細胞の呼吸バーストは、侵入する微生物を殺す活性酸素種を生成します。我々は、先天性免疫応答が化学的に誘発されたときに生成される活性酸素種を定量化する呼吸バーストアッセイを記載している。 

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Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

ヒトのインビトロ</em免疫バランスの初期状態の認識のためのスクリーニングツールとして>抑制

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

免疫・感染学

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

の寄生蜂の紹介<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;と抗寄生虫免疫応答

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

免疫応答やスリープ中の定量的測定<em&gt;ショウジョウバエ</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

サイトカイン産生のウイルス回避における先天性免疫シグナルを解剖

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

マウスマクロファージにおける先天性免疫応答を調査するために、RNA干渉を使用

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

西ナイルウイルス変異株の感染に対するMyD88非介在細胞性免疫応答のインビトロ分析

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

のゼブラフィッシュ幼生モデルにおける先天性免疫応答の非侵襲的イメージング<em&gt;ストレプトコッカスイニエ</em&gt;感染

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

体内上部気道免疫メディエーター レベルの定量化のための粘膜内層流体の非侵襲的サンプリング

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

マウスのモデルを評価する生得の免疫反応黄色ブドウ球菌感染症

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...