我々は、これらのプロトコルの開発とテストでのサポートのためにSBIのスタッフと科学者に感謝します。

1。 293TNパッケージングプラスミドを持つ細胞と発現コンストラクトのトランスフェクション<ol><li>シード7.0から8.0×10 4 mM L-グルタミン、4.5g / Lグルコース、抗生物質なしでウシ胎児血清（10％）を添加したDMEM培地を含む培養培地20mlで15 cm 2の培養プレートあたり6 293TN細胞。細胞密度は、トランスフェクション時の密集度60から80パーセントに達するように2〜5％のCOと37℃で18〜24時間培養する。いくつかのケースでは、標的細胞の形質導入のための十分に高い抗体価を得るために細胞の種のいくつかのプレートに必要となる場合があります。 </li><li>細胞の各プレートについて、オートクレーブ2ミリリットルEppendorffチューブに1.6ミリリットルの無血清DMEMを追加します。上下にピペッティングしてDMEMとミックスに構築する45μlのごlentivectorのpPACKH1またはpPACKF1および4.5μgを追加します。 </li><li>同じチューブにPureFectionの55μlを添加します。 10秒間ボルテックスする。室温fでDMEM-プラスミドPureFection混合物をインキュベートまたは15分。 </li><li>組織培養プレートに均等にプレート全体に分散させる優しく滴と渦にDMEM-プラスミドPureFection混合物を追加します。インキュベーターに皿を返し、5％CO 2で37℃で成長します。 </li><li>トランスフェクション後にメディアを変更する必要はありません。あなたのlentivectorコンストラクトは、GFPのような蛍光タンパク質をコードする遺伝子を発現した場合、12〜24時間トランスフェクション後、顕微鏡下であなたの細胞を確認してください。あなたは、トランスフェクションが成功したことを示す、&gt; 90％GFP陽性細胞を見ることができるはずです。 </li><li> 50ミリリットル滅菌遠心管に細胞培養48時間後上清を72時間収集します。この細胞培養上清は現在、感染pseudoviral粒子を含んでいます。 （BSL-2の安全クラスを操作するための推奨ガイドラインに従ってください。）遠心1500×gで室温で15分間ペレット化し、細胞破片を。ペレットを乱さないように確保し、新しいチューブにウイルス上清を転送します。 </li><li>ウイルスのパッケージングのために使用されている293TN細胞がバイオハザード容器に廃棄されるべきであり、ウイルスのパッケージングのさらなるラウンドのために使用されるようにされていません。 </li></ol> 2。ウイルス上清の濃度<ol><li>レンチウイルス粒子含有上清のすべての4ボリュームに寒い（4°C）PEG-それはウイルスの降水ソリューションの1ボリュームを追加します。大量のレンチウイルス粒子の沈殿は、コーニングを250mlのポリプロピレン製遠心チューブで達成することができます。反転チューブを数回して、ソリューションを混在させることなく、混合物ボルテックスしないでください。 </li><li> （最大4日でも可）少なくとも12時間4℃で溶液を冷蔵してください。冷凍工程の間にチューブを振ったり回転させないでください。 </li><li> 4℃で30分間1500×gで上清/ PEG-IT混合物を遠心分離℃に遠心分離後、レンチウイルス粒子がチューブの底にベージュや白のペレットとして表示されます。 supernataを注ぐNT。 </li><li>ペレット中の沈殿したレンチウイルス粒子を乱さないように注意しながら、吸引することにより、流体の痕跡をすべて削除します。の痕跡が残存PEG-それはウイルスを希釈します（したがって、力価を減少させる）が、PEG-それは不活性で毒性はないので、標的細胞の整合性に影響を与えません。 </li><li>再懸濁し、（4℃）寒い使用して、元のボリュームの1/100でレンチウイルス粒子を組み合わせて、滅菌リン酸緩衝生理食塩水またはDMEM、25 mMのHEPES緩衝液を含む。 </li><li>使用直前まで滅菌低温バイアルおよび-70℃保存に分注し。 </li></ol> 3。標的細胞のウイルスタイターと伝達<ol><li>我々は、標的細胞·オブ·関心を伝達し、実験間の一貫性を保つために、標的細胞に対して感染症の適切な多重度（MOI）を算出する前に、レンチウイルス粒子をタイ​​ターをお勧めします。ウイルスタイターのために、私たちは簡単に感染陽性対照ラインとしてHT1080細胞を使用することをお勧めします。 PLタイターのプロトコルを使用すると、パッケージ化されたレンチウイルス粒子の小アリコートでHT1080細胞を形質関与していることに注意して容易になります。力価が知られると、標的細胞·オブ·関心は生産レンチウイルス粒子でも導入することができます。 ：お勧めタイタープロトコルはで見つけることができます<a href="http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf</a> 7。 </li><li>細胞培養培地で24ウェルプレートにウェル当たりプレート5万標的細胞·オブ·関心。細胞は通常、インチその指定された培養条件で細胞は一晩増殖培養したメディアを使用しています。細胞は伝達の日にコンフルエント％70から50の間でなければなりません。 </li><li>伝達の日に、細胞から培地を吸引除去する。 1×の最終濃度（例えば、培養液500μlに2.5μlのTransDux）にTransDuxで培地を組み合わせたものです。その後TransDux-CEを転送各ウェルにLL培地の混合物。 </li><li>各ウェルに標的細胞に対するMOI最適に対応するウイルスの適切な量をピペットで。最適なMOIが不明な場合、我々は異なるMOIでの範囲（例えば、MOI 1、2および5の組織培養細胞を簡単に感染、およびMOI多くの困難には1、10および20のように試すことをお勧め）初代細胞を感染させる。レンチウイルス粒子の濃度が（としてのウイルスタイタープロトコルを介して決定される）が知られていない場合は、ウイルスの別のボリュームはそのようなウイルスの1、2、5μlのように、試すことができます。ウイルスは72時間までのターゲット細胞と接触したままにすることができます。 </li><li>ウイルスの構造が宿主細胞のゲノムに組み込まれた後に導入標的細胞·オブ·関心を持ってさらなる実験は、72時間導入した後に開始することができる。特定のニーズに応じて標的細胞·オブ·関心媒体と通路を変更します。 </li></ol> 4。代表的な結果<pクラス= &quot;jove_step&quot;&gt; 293TN細胞のトランスフェクション 293TN細胞の出発密度が成功したウイルスのパッケージングのために重要です。 293TN細胞はトランスフェクション（ 図2）の日コンフルエント-80 60％の間でなければなりません。 293TN細胞が60％コンフルエント未満である場合は、それらのトランスフェクションを実行する前に、数時間のために成長することができます。 293TN細胞が&gt; 80％コンフルエントある場合は、トランスフェクションの前に再播種する必要があります。 lentivector表現するGFPを使用する場合は、293TN細胞の少なくとも90％が成功したトランスフェクション（ 図3）を示す、トランスフェクション後緑24時間蛍光を発するべきである。細胞の90％未満ではGFP陽性であるときは、このトランスフェクションが成功しなかったことを示し、ウイルス力価が低くなるため、次のステップに進みません。代わりに、新しいプレート293TN細胞と293TN細胞はトランスフェクション前に、適切な細胞密度であることを確認して、やり直してください。 293TN細胞は48〜72時間トランスフェクション後の組織培養プレートをやってのけることができます。これは負のレンチウイルス粒子の産生に影響を与えません。 HT1080細胞でタイターウイルス力価は、製造元の指示に従って、SBIのグローバル超高速タイターキットを使用して計算することができます。このシステムは、HT1080細胞にレンチウイルスベクターからWPRE配列のウイルスの統合を測定する定量PCRを利用し、正確にmlあたりの感染ユニット（図4）を測定するためのゲノム基準配列に基づいて、標準曲線を比較します。 標的細胞の伝達構成的に活性のGFPマーカーを発現するレンチウイルス粒子を使用している場合は伝達反応が動作している場合は、GFP陽性細胞は、形質導入の12から24時間以内に表示されるように開始する必要があります。レンチウイルスコンストラクトが安定トンに統合された後、GFPの発現は継続すべきである彼は細胞のゲノムをホストします。異なるMOIでで伝達する場合、低MOIでは、以下のGFPの蛍光を示し、高いMOIでは増加したGFPの蛍光を（ 図5）を示す場合には、GFPの蛍光は、約、MOIと一致する必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig1.jpg" alt="図1" /> 図1ウイルスの生産プロトコルの概要。 lentivectorとPPACKパッケージングプラスミドを混合し、293TN細胞に同時トランスフェクトされています。 48 -72時間後、ウイル​​ス上清を回収し、ウイルス粒子は、PEG-それを沈殿させる。レンチウイルス粒子をタイター後、彼らは標的細胞·オブ·関心を伝達するために使用することができます。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3171/3171fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig2.jpg" alt="図2" /> 293TN細胞の図2の位相コントラスト画像。セルdensityは60〜80％コンフルエントにトランスフェクションの日の間でなければなりません。 <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig3.jpg" alt="図3" /> 図3 24時間Purefection、pPACKH1、とlentivector構築するエンコーディングGFPのトランスフェクション後のGFP陽性293TN細胞の蛍光画像。 <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。WPREの定量PCRの結果とMOIおよびパッケージのウイルス粒子の対応する力価を計算するためにSBIのグローバル超高速タイターキットを用いて得られた標準曲線。 <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig5.jpg" alt="図5" /> HT1080細胞の図5蛍光画像は、レンチウイルスの量が増加して導入した。画像は72時間後の形質からです。

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このビデオの記事への生産とフリーアクセスは、システムサイエンスが主催しています。

このウイルスのパッケージングと標的細胞のプロトコルの伝達は、SBIのウイルスのパッケージング試薬の使用に最適化されています。他の試薬の置換は、プロトコルの結果に影響を及ぼす可能性があります。このプロトコルは、レンチウイルス生産用に最適化されており、ウイルスやpseudoviruses他の種類の製造に適しないかもしれません。 成功したウイルスのパッケージングは​​、いくつかの重要なステップに依存しています。 293TN細胞は、細胞培養上清中にレンチウイルス粒子の分泌のために絶対に必要であるSV40ラージT抗原を発現する。 293TN細胞はトランスフェクション時のもので、その密度が十分に細胞にlentivectorとパッケージングプラスミドを転送するPureFection試薬ためには特に重要です。徹底的にプレートを渦巻く続いて滴下方法で組織培養プレートにPureFection混合物を追加すると、パッケージングプラスミドの分散のために重要であるとlentivectorは、細胞のすべてにわたって構築します。適切にベクトルを配布するための障害は、生産されて不十分なレンチウイルス粒子になることがあります。ウイルスのパッケージング反応が組織培養プレートの表面積に基づいて、高力価のウイルスの生産のためにスケールアップすることができます。一つは、パッケージ化する必要がありますコンストラクト当たり293TN細胞のプレート、いくつかの組織培養皿に選択することができます。ウイルス上清の濃度が高力価のウイルスを作成する上で特に便利です。細胞の複数のプレートからウイルス上清は 、in vivo実験で 、または形質導入することは困難である細胞の使用のために組み合わせて、濃縮することができる。 生産レンチウイルス粒子をタイ​​ターは、標的細胞の形質導入に使用する正確なMOIを計算するために重要である。与えられた伝達に使用されたMOIを知ることは情報伝達が成功しない場合にトラブルシューティングが可能になります。たとえば、MOI、つまりを使用してが低すぎるコンストラクト·オブ·関心を非常に少数の標的細胞になることがあります。 MOIが高すぎるそれを使用して、しかし、ストレスの兆候を示す標的細胞になることがあります。目標は、MOI細胞の健康を維持しながら、コンストラクト·オブ·関心の表現を最大限にそれを使用することです。我々はHT1080細胞内でレンチウイルスコンストラクトの統合されたコピーを測定する定量PCRベースのタイタープロトコルをお勧めしますが、他のタイターのアプローチはまた、p24をELISAまたはGFP-陽性細胞の割合の推定として、使用することができます。 標的細胞の正常な伝達には、いくつかの重要な要因に依存しています。 TransDuxは、高い伝達効率を可能にするユニークな感染試薬であるが、それは細胞に毒性はありません。 TransDuxは、多くの場合、標的細胞への毒性があるポリブレンの代わりに使用することができます。標的細胞の形質導入におけるTransDuxの包含は、ウイルス粒子上の電荷を中和するのに役立ち、細胞内にウイルスを許可するだ。 TransDuxは細胞に有毒ではないので、1は、このように確率を増加させる、レンチウイルス粒子は最大72時間の細胞（ウイルスのコンストラクトが宿主細胞のゲノムに組み込まれていた時刻）と接触したままできるようにすることができますウイルス粒子は細胞を入力します。いくつかの困難な形質導入細胞については、形質導入は、導入効率を高めるために連続した日に繰り返すことができます。たとえば、1日目の細胞に形質導入​​、細胞は2日目に休息することができますし、3日目に再び細胞を形質導入する。標的細胞の選択、さらに実験や特性評価を開始する前に、最後の伝達後72時間を待つことが重要である。 効率的なウイルスのパッケージングは​​、5 &#39;および3&#39;LTR領域との間でも、レンチウイルスコンストラクトのサイズに依存しています。レンチウイルスコンストラクトのこのセクションでは、ネイティブのHIVゲノムのサイズに相当する、約9キロバイト以下にする必要があります。 9キロバイト月ドを超えて生産pseudoviral粒子のしわ価。新技術は、このようなpiggyBacトランスポゾンベクターとしては、最大1回のトランスフェクションを介して100キロバイトへの導入遺伝子の信頼性の高い、安定した統合を可能にします。このアプローチは、それが標的細胞をトランスフェクトすることが可能となり、ウイルスのパッケージング工程9,10を必要としない付加的な利点を提供する場合にはレンチウイルスベクターのサイズ制限を超えて構造体に使用することができます。 このプロトコルを使用して製造pseudoviral粒子は、それらはほとんどの哺乳動物の細胞型を感染させることができるという点で感染性である。このプロトコルで使用される製品は、しかし、彼らは非複製と自己不活性化pseudovirusesを生成するという点で、第三世代のbiosafeです。したがって、一度標的細胞または動物に導入、標的細胞または動物が伝染性ではありません。バイオからお勧めできませんが、第三世代のbiosafeではありません他のlentivectorプラスミドの置換が可能です。視点。標的細胞のウイルス産生のプロトコルと、後続の伝達は、NIHのガイドライン11に従って、バイオセーフティレベル2の下で実施されるべきであり、ウイルス粒子を取り扱う際には研究者は常に白衣や手袋を着用しなければならない。使用293TNプロデューサー細胞は、ウイルス粒子のチューブと使い捨てピペットは、適切なバイオハザード容器に廃棄する必要があります。再利用可能なピペットとガラス製品は、漂白剤で除染と人員の暴露を減らすためにオートクレーブする必要があります。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> DMEM高グルコース培地</td><td>ギブコ</td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> 293TN細胞</td><td> SBI </td><td> LV900A-1 </td><td></td></tr><tr><td> pPACKH1 </td><td> SBI </td><td> LV500A-1 </td><td> HIVベースlentivectorsのために</td></tr><tr><td> pPACKF1 </td><td> SBI </td><td> LV100A-1 </td><td> FIVベースlentivectorsのために</td></tr><tr><td>任意のレンチウイルスベクター</td><td> SBI </td><td>さまざまな</td><td> cDNAを、shRNAを、マイクロRNA、転写レポーター</td></tr><tr><td> PureFection </td><td> SBI </td><td> LV750A-1 LV750A-5 </td><td></td></tr><tr><td> PEG-IT </td><td> SBI </td><td> LV810A-1 LV825A-1 </td><td></td></tr><tr><td>グローバル超高速タイターキット</td><td> SBI </td><td> LV961A-1 </td><td>このプロトコルに説明するが、ウイルス粒子を力価には必要ありません</td></tr><tr><td> TransDux </td><td> SBI </td><td> LV850A-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

packaging hiv- or fiv-based lentivector expression constructs &amp; transduction of vsv-g pseudotyped viral particles

標準的なプラスミドベクターと同様に、エフェクターの一過性の発現を得るために低〜中程度の効率で細胞内にプラスミドの形でlentivectorsをトランスフェクトすることが可能です。 pseudoviral粒子にパッケージングレンチウイルス発現構築物は、しかし、さらに困難なトランスフェクションは、プライマリ、幹細胞などの細胞、および分化した細胞で、100％の伝達まで可能になります。また、レンチウイルスの配信は、典型的には、トランスフェクション試薬1、2の毒性に起因する細胞死などの化学的トランスフェクションに関連付けられた特定の細胞応答を生成しません。標的細胞に導入する場合は、レンチウイルスコンストラクトはゲノムDNAに統合され、小さなヘアピンRNA（shRNA）は、cDNA、RNAまたはレポーター遺伝子3、4の安定な発現を提供しています。安定的にエフェクター分子を発現する標的細胞は、発現ベクターなどピューロマイシンまたはGFPとして構築中に含まれる選択可能なマーカーを用いて単離することができます。後のPSウイルスの構造遺伝子が存在しないと、長い末端反復配列（LTRの）が伝達5、6に自己不活性化するように設計されているため、eudoviral粒子は標的細胞に感染し、彼らは標的細胞内で複製することはできません。 効率的なレンチウイルスパッケージング1、5、6、7のために必要な3つの主要コンポーネントがあります。 <ol><li>包装に必要な遺伝的要素の一部が含まれレンチウイルス発現ベクターは、ウイルス発現の安定した統合は、ゲノムDNA中に構築し、エフェクターまたはレポーターの発現。 </li><li>組換えpseudoviral粒子に発現構築物のRNAコピーの転写およびパッケージングのために不可欠なタンパク質を提供するレンチウイルスパッケージングプラスミド。このプロトコルは、ウイルスコートタンパク質のためにHIVやFIVゲノムと水疱性口内炎ウイルスのGタンパク質（VSV-G）からgag、polおよびREVのエンコードPPACKプラスミド（SBI）を使用します。 </li><li> 293TN生成<html>メンテナンスのためにセルを再選択するための有用な高タイターレンチウイルス生産とネオマイシン耐性遺伝子のために必要とされるSV40ラージT抗原を発現r細胞（HEK293細胞に由来する）。 </li></ol>ウイルス産生プロトコルの概要を図1に見ることができます。ウイルス産生は、レンチウイルス発現ベクターおよびパッケージングプラスミドと共トランスフェクト293TNプロデューサー細胞によって開始されます。ウイルス粒子が培地中に分泌されています。 48〜72時間後の細胞培養培地を収穫しています。細胞の破片は、細胞培養培地から削除され、ウイルス粒子は、濃度のPEG-それとを遠心分離によって沈殿させる。生産レンチウイルス粒子は、力価測定され、標的細胞を形質導入するために使用することができます。ウイルスタイターの詳細については、このプロトコルに含まれていませんが、で見つけることができます： ANK &quot;&gt; http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf 8。 このプロトコルは、示された特定の製品を使用して最適化されています。他の試薬は置換されていてもよいが、同じ結果が保証されません。

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Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

レンチウイルス発現ベクターは安定し、哺乳動物細胞と生物全体を分割し、非分裂で異なるエフェクター分子またはレポーターコンストラクトを発現させるための最も効果的な車である。ここでは、pseudoviral粒子にlentivector発現構築物をパッケージ化するとpseudoviral粒子を用いた標的細胞を形質導入するためにどのようにプロトコルを提供しています。

包装HIV-またはFIVベースLentivector発現コンストラクト＆VSV-Gシュードウイルス粒子の伝達

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

packaging-hiv-or-fiv-based-lentivector-expression-constructs

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

34.9K ビュー.  System Biosciences. レンチウイルス発現ベクターは安定し、哺乳動物細胞と生物全体を分割し、非分裂で異なるエフェクター分子またはレポーターコンストラクトを発現させるための最も効果的な車である。ここでは、pseudoviral粒子にlentivector発現構築物をパッケージ化するとpseudoviral粒子を用いた標的細胞を形質導入するためにどのようにプロトコルを提供しています。

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Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

免疫・感染学

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

標準的な臨床アッセイによる検出限界以下のウイルス量とHIV感染個体におけるHIV - 1 RNAを増幅して定量化

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

HIV逆転写酵素及びインテグラーゼ阻害剤の迅速なスクリーニング

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. The family also includes the smallpox virus, Variola. Due to the complexity of poxvirus replication, many questions still remain regarding their gene expression strategy. In this article we describe the conceptualization and usage of recombinant vaccinia viruses that enable real-time measurement of single and multiple stages of viral gene expression in a high-throughput format. This is enabled through the use of spectrally distinct fluorescent proteins as reporters for each of three stages of viral replication. These viruses provide a high signal-to-noise ratio while retaining stage specific expression patterns, enabling plate-based assays and microscopic observations of virus propagation and replication. These tools have uses for antiviral discovery, studies of the virus-host interaction, and evolutionary biology.

We describe the usage of a fluorescent reporter vaccinia virus that enables real-time measurement of viral infectivity and gene expression through the stage-specific expression of spectrally distinct reporter fluorophores. We detail a plate-based method for accurately identifying the stage at which virus replication is affected in response to small molecule inhibition.

遺伝子発現のすべての段階でウイルス機能を定量化するためのワクレポーターウイルス

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

遺伝子または薬物療法で使用するためのHIV-1産生を標的RNAの有効性および毒性の評価

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be difficult. To overcome this challenge, a methodology combining indexed flow cytometry and high-throughput multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was developed. The objective was to identify and characterize simian immunodeficiency virus (SIV)-infected cells present within rhesus macaques. Through quantitation of surface protein by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mRNA by qPCR, virus-infected cells are identified by viral gene expression, which is combined with host gene and protein measurements to create a multidimensional profile. We term the approach, targeted Single-Cell Proteo-transcriptional Evaluation, or tSCEPTRE. To perform the method, viable cells are stained with fluorescent antibodies specific for surface markers used for FACS isolation of a cell subset and/or downstream phenotypic analysis. Single cells are sorted followed by immediate lysis, multiplex reverse transcription (RT), PCR pre-amplification, and high throughput qPCR of up to 96 transcripts. FACS measurements are recorded at the time of sorting and subsequently linked to the gene expression data by well position to create a combined protein and transcriptional profile. To study SIV-infected cells directly ex vivo, cells were identified by qPCR detection of multiple viral RNA species. The combination of viral transcripts and the quantity of each provide a framework for classifying cells into distinct stages of the viral life cycle (e.g., productive versus non-productive). Moreover, tSCEPTRE of SIV+ cells were compared to uninfected cells isolated from the same specimen to assess differentially expressed host genes and proteins. The analysis revealed previously unappreciated viral RNA expression heterogeneity among infected cells as well as in vivo SIV-mediated post-transcriptional gene regulation with single-cell resolution. The tSCEPTRE method is relevant for the analysis of any cell population amenable to identification by expression of surface protein marker(s), host or pathogen gene(s), or combinations thereof.

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Described is a methodology to quantitate the expression of 96 genes and 18 surface proteins by single cells ex vivo, allowing for the identification of differentially expressed genes and proteins in virus-infected cells relative to uninfected cells. We apply the approach to study SIV-infected CD4+ T cells isolated from rhesus macaques.

MRNA およびサル免疫不全ウイルス感染 cd4 表面タンパク質発現の単一細胞定量+ T 細胞孤立したアカゲザルから

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. An HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) is generated by inserting Cre recombinase into the HIV-1 genome between the matrix and the capsid proteins of the Gag polyprotein. This results in a packaging of Cre recombinase into virus particles, which is then released into a target cell line stably expressing a Cre recombinase-activated red fluorescent protein (RFP) to GFP switch cassette. In the basal state, this cassette expresses RFP only. Following the delivery of Cre recombinase into the target cell, the RFP, flanked by loxP sites, excises, resulting in GFP expression. This assay can be used to test any inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems and has been used to identify a class of purinergic receptor antagonists as novel inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.

We describe a cell-based assay to report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. It can be used to test inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems.

高スループットの Cre Lox 活性化ウイルスの膜融合アッセイの HIV-1 ウイルス膜融合阻害剤を識別するために

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

バイオ セーフティ レベル 2 の設定で高病原性コロナを勉強する新規微粒子の製造

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

高病原性H5N1および鳥類H7N9ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質を用いた高力性インフルエンザ擬似型粒子の生産

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

疑似型ウイルスによるSARS-CoV-2に対する血清中和の評価

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in addition to their better-known use in gene therapy for the delivery of a gene of interest. PVs are replication defective because the viral genome is divided into different plasmids that are not incorporated into the PVs. This safe and versatile system allows the use of PVs in biosafety level 2 laboratories. Here, we present a general methodology to produce lentiviral PVs based on three plasmids as mentioned here: (1) the backbone plasmid carrying the reporter gene needed to monitor the infection; (2) the packaging plasmid carrying the genes for all the structural proteins needed to generate the PVs; (3) the envelope surface glycoprotein expression plasmid that determines virus tropism and mediates viral entry into the host cell. In this work, SARS-CoV-2 Spike is the envelope glycoprotein used for the production of non-replicative SARS-CoV-2 pseudotyped lentiviruses.
Briefly, packaging cells (HEK293T) were co-transfected with the three different plasmids using standard methods. After 48 h, the supernatant containing the PVs was harvested, filtered, and stored at -80 &#176;C. The infectivity of SARS-CoV-2 PVs was tested by studying the expression of the reporter gene (luciferase) in a target cell line 48 h after infection. The higher the value for relative luminescence units (RLUs), the higher the infection/transduction rate. Furthermore, the infectious PVs were added to the serially diluted serum samples to study the neutralization process of pseudoviruses' entry into target cells, measured as the reduction in RLU intensity: lower values corresponding to high neutralizing activity.

著者スポットライト:Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses 

Pseudotyped viruses (PVs) are replication-defective virions that are used to study host-virus interactions under safer conditions than handling authentic viruses. Presented here is a detailed protocol that shows how SARS-CoV-2 PVs can be used to test the neutralizing ability of patients' serum after COVID-19 vaccination.

中和アッセイを介してSARS-CoV-2に対する体液性免疫応答を監視するための分子ツールとしての偽型ウイルス

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...