著者はコーラス、MedSysの細胞侵入、CHAIN​​とResinaプロジェクトから資金を調達しています。

プロトコルを図にまとめられている。 4。 1。血液サンプルの収集<ol><li>臨床現場でEDTAチューブ内に少なくとも3つのmlの血液を採取します。 </li><li>サンプルは4℃で一週間まで保存することができます</li><li>普通郵便で検査室にできるだけ早くEDTA-血液サンプルを送ってください。 </li></ol> 2。 HIV RNAおよび/またはDNAの単離<ol><li>マグナピュアコンパクト核酸アイソレーションキットI私、マグナピュアコンパクトなシステムを使用して、1000μlの全血、血清または血漿からのウイルスRNAおよび/またはDNAを得た。 </li><li> 50μlのTEバッファーで培ったRNAまたはDNAを溶出する。あるいは、他の核酸精製法を用いてもよい。 </li></ol> 3。 envの領域の増幅血漿RNAまたはウイルスDNAのいずれかからのenv領域（図2、図4）を増幅する。 Envタンパク質の大部分を含む1245 bpの長さの製品、（NT 6556から7811 AccordinはHXB2へグラム）が生成されます。 <ol><li> RNAサンプル：RT-PCR反応<ol><li>ウイルスRNAはRT反応を妨げる可能性が非常に複雑な二次構造（図4）を提示します。この問題を回避するには、10分（既にPCRチューブやPCRマシンで）65℃で10μlのRNAをインキュベートした後、50℃に温度を下げる</li><li>プライマーENV-FおよびENV-Rを含むPCRマスターミックス40μlを添加する。 ハウスインシステムRT-PCR用マスターミックス： <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> ボリューム/反応量（μl） </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td> RNaseフリーH 2 O </td><td> 14.4 </td><td></td></tr><tr><td> 5倍のバッファ（キアゲンワンステップRT-PCRキット） </td><td> 10 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Q-Solutionは5倍</td><td> 10 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> dNTPミックス（各10mM） </td> &lt;TD&gt; 2 </td><td>各dNTP400μMの</td></tr><tr><td> Enzymミックス（キアゲンワンステップRT-PCRキット） </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td>プライマーENV-F（100μM） </td><td> 0.3 </td><td> 0.6μM </td></tr><tr><td>プライマーENV-R（100μM） </td><td> 0.3 </td><td> 0.6μM </td></tr><tr><td> RNase阻害剤（RNasin） </td><td> 1 </td><td> 5単位/反応</td></tr></tbody></table> ENV-F：5&#39;-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 &#39;（NT 6556→6586 HXB2による） ENV-R：5&#39;-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 &#39;（NT 7785←7811） </li><li> 30分間、50℃でRT反応を実行します。 </li><li>次のように最初のPCRを実行します。 <table border="1"><tbody><tr><td> 95℃、15分</td><td> 1つのx </td></tr><tr><td> 95℃、30秒 50℃、30秒 72℃、2分</tD&gt; <td> 1つのx </td></tr><tr><td> 95℃、30秒 56℃、30秒 72℃、2分</td><td> 38× </td></tr><tr><td> 72℃、10分 4℃∞ </td><td></td></tr></tbody></table></li></ol></li><li> DNAサンプル：PCR反応 プロウイルスDNAのサンプルについては、初期のRT反応は必要ありませんし、PCR反応を直接起動することができます。 <ol><li> provialのDNAを10μlのPCR Master Mixを40μlを添加する。 ハウスインシステムPCR用マスターミックス： <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> ボリューム/反応量（μl） </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td> RNaseフリーH 2 O </td><td> 15.4 </td><td></td></tr><tr><td> 5倍のバッファ（HotStarTaq DNAポリメラーゼ） </td><td> 10 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Q-Solutionは5倍</td><td> 10 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> dNTPミックス（各10mM） </td><td> 2 </td><td>各dNTP400μMの</td></tr><tr><td> Enzymミックス（HotStarTaq DNAポリメラーゼ） </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td>プライマーENV-F（100μM） </td><td> 0.3 </td><td> 0.6μM </td></tr><tr><td>プライマーENV-R（100μM） </td><td> 0.3 </td><td> 0.6μM </td></tr></tbody></table> ENV-F：5&#39;-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 &#39;（NT 6556→6586） ENV-R：5&#39;-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 &#39;（NT 7785←7811） </li><li>以前にRNAサンプル（ステップ3.1.4）で説明したPCR条件を実行します。 </li></ol></li></ol> 4。 V3領域の増幅：ネステッドPCR <ol><li> nested PCR法は、鋳型として、最初のPCR反応（アガロースゲルで以前の分析なし）から5μlを使用し、PCRマスの95μlを加えるTERは混ぜる。 ネストされたインハウスPCR用マスターミックス<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> ボリューム/反応量（μl） </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 61.9 </td><td></td></tr><tr><td> 10×PCRバッファー</td><td> 10 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Q-Solutionは5倍</td><td> 20 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> dNTPミックス（各10mM） </td><td> 2 </td><td>各dNTP200μMの</td></tr><tr><td>プライマーENV-2F（100μM） </td><td> 0.3 </td><td> 0.6μM </td></tr><tr><td>プライマーENV-2R（100μM） </td><td> 0.3 </td><td> 0.6μM </td></tr><tr><td> HotStarTaq DNAポリメラーゼ</td><td> 0.5 </td><td> 2,5単位/反応</td></tr></tbody></table> ENV-2F：5&#39;-GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC -3 &#39;（NT 6838→6864） <strong&gt; ENV-2R：5&#39;-CACCACTCTTCTCTTTGCCTTGGTGGGTGC -3 &#39;（NT 7712←7742） </li><li>次のようにPCRを実行します。 <table border="0"><tbody><tr><td> 93℃、15分</td><td> 1つのx </td></tr><tr><td> 95℃、30秒 50℃、30秒 72℃、90秒</td><td> 1つのx </td></tr><tr><td> 95℃、30秒 56℃、30秒 72℃、90秒</td><td> 43× </td></tr><tr><td> 72℃、10分 4℃∞ </td><td></td></tr></tbody></table></li><li> 1％アガロースゲル（図4）でPCR産物を分析します。予想される製品は、902 bpの長さである。 </li><li>シークエンシングサンプルの精製。 <ol><li>サプライヤーが提供するプロトコル、ソリューション、マイクロカラムを使用して、Qiagen社のPCR精製キットでPCR産物を精製する。バンド強度に応じて、30から100μlのPEのバッファーで溶出。 </li><li>あるいは、サンプルはエキソヌクレアーゼを用いて精製することができる私とFastのAP（サーモアルカリホスファターゼ）。この目的のために、15μlのPCR産物に6μlのエキソ-APのミックスを追加し、37℃で15分間インキュベート℃、 <table border="1"><tbody><tr><td> 580μlのH 2 O </td></tr><tr><td> 66μlの高速AP </td></tr><tr><td> 13.4μlのエクソ私</td></tr></tbody></table></li></ol></li></ol> 5。 V3のアンプリコンの配列反応<ol><li>シーケンス反応は以下のプライマーの一方のみを用いたPCR反応で構成されています。 ENV-2：5&#39;-GTACAATGYACACATGGAATTAGGC -3（NT 6959→6980） ENV-5：5&#39;-AAAATTCCCCTCCACAATTA - 3 &#39;（NT 7352←7371） ENV-6：5&#39;-GGCCAGTAGTATCAACTCAAC - 3 &#39;（NT 6979→7000） ENV-7：5&#39;-TGTCCACTGATGGGAGGGGC - 3 &#39;（NT 7530←7549） ENV-10：5 &#39; - GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC - 3&#39;（NT 7478←7507） ENV-11：5 &#39; - TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC - 3&#39;（NT 7638←7664） 最初の選択肢プライマーは以下のとおりです。ENV-2、ENV-6またはenv-7は、env-11 </li><li>テンプレートとして精製されたV3のアンプリコンから1μlを使用し、PCRマスターミックスの9μlを添加する。 Master Mixをシーケンシング： <table border="1"><tbody><tr><td> 4μlのシーケンスミックス（HIV-ジェノタイピングキット） </td></tr><tr><td> 4μlのH 2 O </td></tr><tr><td> 1μlのプライマー（100ピコモル/μl）を</td></tr></tbody></table></li><li>次のようにシーケンス反応を実行します。 <table border="0"><tbody><tr><td> 96℃、10秒</td><td></td></tr><tr><td> 50℃、10秒</td><td> 36× </td></tr><tr><td> 60℃、45秒</td><td></td></tr><tr><td> 4℃∞ </td><td></td></tr></tbody></table></li></ol> 6。シークエンシングサンプルの精製シーケンスUSIを清めるngのセファデックスG-50超。 <ol><li>デックスG-50超で &quot;列ローダ&quot;で井戸の数を適切に記入してください。上に回してフィルタープレートMAHVN4510にデックスを転送します。 </li><li>フィルタープレートの各ウェルに300μlのミリQ H 2 Oを追加し、2〜8℃で少なくとも3時間のためにそれをインキュベート℃に</li><li> 910Xgと4から15℃で5分間プレートを遠心分離フロースルーを捨てる。 </li><li>シーケンスの製品との膨潤したセファデックスプレート上ピペットシーケンスに10μlのH 2 Oを追加します。 </li><li>精製された生成物を得るためには、5分間プレートを遠心します。 910Xgと4から15℃で、フロースルーを収集します。 </li></ol> 7。シーケンサーABIプリズム3130 XLの精製サンプルのシーケンシング<ol><li>各実行の前に、バッファを変更して、ポリマー（POP7）の音量を確認してください。必要に応じて、新しいものに古いポリマーフラスコを交換してください。 </li><li> 18秒の噴射時間を含む保存された実行条件を使用。 </li><li>このマシンでは、16のシーケンスサンプルを1ランの信号データの収集は、約60分（36センチメートルキャピラリー）または150分（50センチメートルキャピラリー）を取ります。 </li></ol> 8。シーケンス編集<ol><li>シーケンス（図5）を合わせて、編集するためのプログラムLASERGENE（DNAスター）を使用します。他のシーケンス編集プログラムを使用することができる。参照として&quot;V3-コンセンサスB&quot; および envコンセンサス配列を使用します。 </li><li> LASERGENEは、利用可能なすべての生データを用いて分析した試料のコンセンサス配列を作成し、FASTAファイルとして格納します。 FASTA形式のファイルには、サンプルの名前と塩基配列とヘッダを含むテキストフ​​ァイルです。 </li></ol> 9。データの解釈や向性予測をシーケン<ol><li>データ解釈をシーケンシングするWebベースの解釈システムによって行われるgeno2pheno [コレセプター]（ <a href="http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php">http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/</a>index.php）を。向性の予測については、別のFPRの設定が選択できます。デフォルト設定では、ドイツ·オーストリアの治療ガイドラインに沿っています。 FPRの≥20％の場合、ウイルスはFPR &lt;12.5％時FPRの≥20％およびX4 R5として分類されます。 </li><li>サーバにFASTAファイルをアップロードします。このサーバーは、アミノ酸に塩基配列を変換V3-コンセンサスB配列でそれを整列させ、サブタイプ分類を生成します。また、偽陽性率（FPR）として表現（図4）コレセプター使用率の予測を生成します。 </li></ol> 10。代表的な結果 geno2pheno [コレセプター]の出力は、向性の段階的な解釈を示しています。コレセプター使用の可能性に応じて、解釈のテキストと背景の色が可能であれば、リスクが低いことを示唆し、最終的に赤に黄色に、MVCのための安全管理を示唆し、緑（&lt;20％FPR）によって異なります。赤は示唆している色ですMVCを処方していないING。さらに、サーバは、印刷された患者さん及び、サンプルデータで埋められ、医師に送信することができますPDF形式のレポートを生成します。 geno2pheno [コレセプター]の出力例を、図に示されている。 6。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig1.jpg" /> 図。 1。 HIV感染の概略複製。ビリオンは、受容体のような細胞のCD4に結合しなければならず、コレセプターとしてCCR5またはCXCR4のどちらかに。コレセプターCCR5は、マラビロクのようなCCR5アンタゴニスト（MVC、Celsentri、Selzentry）でブロックすることができます。ウイルスと細胞膜の融合後、ウイル​​スのヌクレオは、細胞質に放出される。ヌクレオカプシドは分解し、ウイルスRNAの複合体は、細胞質へ放出される。ウイルスの逆転写酵素（RT）は、次に核に輸送され、HIVインテグラーゼによって宿主ゲノムに組み込まれたプロウイルスDNAにゲノムRNAを転写する。細胞のRNAポリメラーゼのtraプロウイルスゲノムからのウイルスゲノムおよびメッセンジャーRNAをnscribe。ウイルスタンパク質は、細胞質内で産生され、細胞表面に輸送される。細胞から未熟な、非感染性ビリオンとしてウイルス粒子の芽。 HIVプロテアーゼは、感染性粒子を産生するタンパク質を切断する。の手順のいずれかの阻害は、複製サイクルの中断につながる。 彼らが阻害することを抗レトロウイルス薬とレプリケーション·ステップは赤でマークされています。 ウイルスRNAおよびプロウイルスDNA（向性や抵抗解析に用いる材料）が緑色でマークされています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig2.jpg" /> 図2。 HIVプロウイルスゲノム。HIV粒子は、異なる構造タンパク質と住宅の両方のウイルスおよび細胞起源からの様々な酵素やタンパク質を構築されています。フィギュアショーウイルスゲノム内の遺伝子の位置はS。表面タンパク質gp120及びgp41はビリオンの表面にスパイクを構成し、膜融合を実行するためにヒト細胞にお問い合わせください。図の下の部分では、我々のプロトコルで使用されるPCR増幅産物とプライマーが示されています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig3.jpg" /> ウイルス学研究所で薬剤耐性または向性決定のための分析低ウイルス量（VL）の測定では、ケルン大学（ドイツ）の患者の図3：割合。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig4.jpg" /> 図4。実験の全体的なスキーム ..してください<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3264/3264fig4_lg.jpg">ここをクリックし</a> 、この図の拡大版を見ることができます。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig5.jpg" /> 図5。シーケンスはLASERGENEで編集。V3のアンプリコンが少なくともフォワード1と1リバースプライマーを用いて配列決定されています。 LASERGENEは参照配列 &quot;V3-Bのコンセンサス&quot;とenvでシーケンサーから得られた &quot;。ABI&quot;ファイルをalignes。 LASERGENEは、利用可能なすべての行データを使用してコンセンサス配列を作成します。彼らはサンプルコンセンサス配列に寄与しないように、リファレンス·シーケンスは、（そして、灰色で表示されます）マークを付けることができます。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig6.jpg" /> 図6。 geno2phenoによって生成された親和性の予測レポート[コレセプター] tool.Theレポートが保存され、コンピュータで完了することができますPDFファイルとして生成されます。追加データなど私たち患者の名前、血液抽出の日付などは、手動でPDF Writerのプログラムを使用して含めることができます。具体的なコメントを追加することもできます。テサロニケ電子データは、ユーザーのコンピュータ上ではなくgeno2pheno [コレセプター]サーバ上に排他的です。してください<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3264/3264fig6_lg.jpg">ここをクリックし</a> 、この図の拡大版を見ることができます。

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	<li>Heger, E., Schuelter, E., Klimkait, T., Lengauer, T., Kaiser, R., Walter, H., Sierra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+coreceptor+proficiency+panel+test.">European coreceptor proficiency panel test.</a> , (2011).</li><li>Lengauer, T., Sander, O., Sierra, S., Thielen, T., Kaiser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+prediction+of+HIV+coreceptor+usage.">Bioinformatic prediction of HIV coreceptor usage.</a> Nature Biotech. 25 (12), 1407-1410 (2007).</li><li>McGovern, R., Dong, W., Zhong, X., Knapp, D., Thielen, A., Chapman, D., Lewis, M., James, I., Valdez, H., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population-based+Sequencing+of+the+V3-loop+Is+Comparable+to+the+Enhanced+Sensitivity+Trofile+Assay+in+Predicting+Virologic+Response+to+Maraviroc+of+Treatment-na+ve+Patients+in+the+MERIT+Trial.">Population-based Sequencing of the V3-loop Is Comparable to the Enhanced Sensitivity Trofile Assay in Predicting Virologic Response to Maraviroc of Treatment-na ve Patients in the MERIT Trial.</a> , (2010).</li><li>Reuter, S., Braken, P., Jensen, B., Sierra-Aragon, S., Oette, M., Balduin, M., Kaiser, R., Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maraviroc+in+treatment-experienced+patients+with+HIV-1+infection+-+experience+from+routine+clinical+practice.">Maraviroc in treatment-experienced patients with HIV-1 infection - experience from routine clinical practice.</a> Eur. J. Med. Res. 15 (6), 231-237 (2010).</li><li>Recordon-Pinson, P., Soulie, C., Flandre, P., Descamps, D., Lazrek, M., Charpentier, C., Montes, B., Trabaud, M. A., Cottalorda, J., Schneider, V., Morand-Joubert, L., Tamalet, C., Desbois, D., Mace, M., Ferre, V., Vabret, A., Ruffault, A., Pallier, C., Raymond, S., Izopet, J., Reynes, J., Marcelin, A. G., Masquelier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+genotypic+prediction+of+HIV-1+coreceptor+use+versus+a+phenotypic+assay+and+correlation+with+the+virological+response+to+maraviroc:+the+ANRS+GenoTropism+study.">Evaluation of the genotypic prediction of HIV-1 coreceptor use versus a phenotypic assay and correlation with the virological response to maraviroc: the ANRS GenoTropism study.</a> Antimicrob. Agents. Chemother. 54 (8), 3335-3340 (2010).</li><li>Swenson, L. C., Knapp, D., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+and+accuracy+of+the+geno2pheno+co-receptor+algorithm+for+predicting+HIV+tropism+for+single+and+triplicate+measurements+of+V3+genotype.">Calibration and accuracy of the geno2pheno co-receptor algorithm for predicting HIV tropism for single and triplicate measurements of V3 genotype.</a> , (2010).</li><li>Macartney, M. J., Cameron, J., Strang, A., Garc&#237;a, A., Booth, C., Marshall, N., Johnson, M., Geretti, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+genotypic+assay+for+the+prediction+of+HIV-1+coreceptor+tropism+and+guiding+the+use+of+CCR5+antagonists+in+clinical+practice.">Use of a genotypic assay for the prediction of HIV-1 coreceptor tropism and guiding the use of CCR5 antagonists in clinical practice.</a> , (2010).</li><li>Sierra, S., Thielen, A., Reuter, S., Jensen, B., Esser, S., F&#228;tkenheuer, G., Lengauer, T., Pfister, H., Sichtig, N., Kaiser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropism+determination+and+clinical+outcome+of+61+patients+under+MVC+treatment.">Tropism determination and clinical outcome of 61 patients under MVC treatment.</a> , (2010).</li><li>Obermeier, M., Carganico, A., Bieniek, B., Schleehauf, D., Dupke, S., Fischer, K., Freiwald, M., Neifer, S., Schuler, C., Mayr, C., Klausen, G., K&#246;ppe, S., &#252;&#252;nsche, T., Berg, T., Baumgarten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropism+testing+from+proviral+DNA+-+analysis+of+a+subgroup+from+the+Berlin+Maraviroc+cohort.">Tropism testing from proviral DNA - analysis of a subgroup from the Berlin Maraviroc cohort.</a> , (2010).</li><li>Vandekerckhove, L. P., Wensing, A. M., Kaiser, R., Brun-Vezinet, F., Clotet, B., De Luca, A., Dressler, S., Garcia, F., Geretti, A. M., Klimkait, T., Korn, K., Masquelier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+guidelines+on+the+clinical+management+of+HIV-1+tropism+testing.">European guidelines on the clinical management of HIV-1 tropism testing.</a> Lancet Infect Dis. 11 (5), 394-407 (2011).</li><li>Walter, H., Eberle, J., M&#246;ller, H., Noah, C., Wolf, E., St rmer, M., Braun, P., Krn, K., D umer, M., Berg, T., Obermeier, M., Thielen, A., Kaiser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empfehlung+zur+Bestimmung+des+HIV-1-Korezeptor-Gebrauchs+(DAIG+Recommendations+for+the+HIV-1+tropism+testing).">Empfehlung zur Bestimmung des HIV-1-Korezeptor-Gebrauchs (DAIG Recommendations for the HIV-1 tropism testing).</a> , (2011).</li><li>Obermeier, M. J., Carganico, A., Dupke, S., Schranz, D., Cordes, C., Freiwald, M., Klausen, G., K&#246;ppe, S., Schuler, C., Mayr, C., Schleehauf, D., Berg, T., Krznaric, I., Baumgarten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+genotypic+co-receptor+tropism+testing+from+viral+RNA+and+proviral+DNA:+week+24+analysis+of+the+Berlin+maraviroc+cohort.">Clinical application of genotypic co-receptor tropism testing from viral RNA and proviral DNA: week 24 analysis of the Berlin maraviroc cohort.</a> Journal of the International AIDS Society. 13, 129-129 (2010).</li><li>Toma, J., Frantzell, A., Hoh, R., Martin, J., Deeks, S., Petropoulos, C., Huang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+HIV-1+Co-receptor+Tropism+Using+PBMC+Proviral+DNA+Derived+from+Aviremic+Blood+Samples.">Determining HIV-1 Co-receptor Tropism Using PBMC Proviral DNA Derived from Aviremic Blood Samples.</a> , (2010).</li></ol>

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臨床試験3-9に示すように、V3のシーケンスは、信頼性の高いウイルス親和性の予測を可能にします。実際には、遺伝子型決定が現在のヨーロッパ、ドイツ·オーストリアのガイドライン10に企図されている。 表現型のテストに比べて、だけでなく、短い回転時間（耐性試験に相当）ですが、また、費用のことである。また、遺伝子型検査の主な利点は、結果がFPRのようにグレード分けされているため、患者のニーズに適合させることができるということです。 Trofileの結果は、他の一方で、単にR5またはX4のレポートであり、生データへのアクセスが与えられていない。 オーストリア·ドイツのガイドラインは、個々の患者のニーズ11にカットオフ特にFPRを適応できるようにしながら、現在、欧州のガイドラインでは、20％10のFPRカットオフを示唆している。この行では、抗レトロウイルス薬の選択肢の広い範囲、より高いFPRのカットオフ値（&gt; 20％）の患者さんにrecommアール終了しました。逆に、限られた治療の選択肢を有する重度の事前治療を受けた患者のために、より低いFPRカットオフ（&gt; 5％）を使用することができる。治療指針のこの種は、現在、部分的に活性な薬剤が減少治療の選択肢患者の治療に含めることができるのNRTI、NNRTIを、小僧、INISにテスト抵抗による進行中である。また、遺伝子型誘導療法の変化の成長数字で、臨床的に意義のあるFPRのカットオフ値は常にバイオインフォマティクス、ウイルス学者および臨床家のパネルによって調整されています。 遺伝子型の指向性テストのもう1つの重要な利点は、非常に低い、あるいは検出限界以下のウイルス負荷（VL）を用いた臨床試料を分析の可能性である。この例では、血漿RNAが増幅可能でないときに、プロウイルスDNAを配列決定することができ、信頼性の高い予測9,12に使用されます。注目すべきは、低いか、または検出できないウイルス量の患者数は急激に最新の年で増加している。日付、TへrofileアッセイはVLのみを有する患者からの試料の分析&lt;1000コピー/ mlを可能にします。しかし、予備的研究では、プロウイルスDNAもTrofile 13でテストするadecuateすることができることが示されている。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>マグナピュアコンパクト核酸アイソレーションキットI </td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 04 802 993 001 </td><td></td></tr><tr><td>マグナピュアコンパクトシステム</td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 03731146001 </td><td></td></tr><tr><td> T3000サーモ</td><td> Biometra </td><td> 050から723 </td><td></td></tr><tr><td>ワンステップRT-PCRキット</td><td>キアゲン</td><td> 210215 </td><td></td></tr><tr><td> HotStarTaqマスターミックスキット</td><td>キアゲン</td><td> 203445 </td><td></td></tr><tr><td> QIAクイックPCR精製キット</td><td>キアゲン</td><td> 28106 </td><td></td></tr><tr><td>エキソヌクレアーゼI（エクソI） </td><td>フェルメンタス</td><td> EN0582 </td><td></td></tr><tr><td> FastAP感熱アルカリホスファターゼ</td><td>フェルメンタス</td><td> EF0651 </td> &lt;TD&gt; </td></tr><tr><td> BigDye v3.1のターミネーターサイクルシークエンシングキット</td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> 4337457 </td><td></td></tr><tr><td>デックスG-50スーパーファイン</td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-0041-01 </td><td></td></tr><tr><td> ABIプリズム3130 XLキャピラリーシーケンサー</td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> 3130XL </td><td></td></tr></tbody></table>

prediction of hiv-1 coreceptor usage (tropism) by sequence analysis using a genotypic approach

マラビロクは（MVC）の共受容体拮抗薬のクラスからの最初のライセンスを取得し、抗レトロウイルス薬です。それは人間の免疫細胞（図1）を感染させるためにHIV株の大部分で使用されているホストコレセプターCCR5に結合する。他のHIV分​​離株が異なるコレセプター、CXCR4を使用しています。使用されている受容体、Envタンパク質（図2）でウイルスに決定される。コレセプター使用に応じて、ウイルスはそれぞれ、R5またはX4、として分類されます。 MVCは、CCR5受容体を阻害する標的細胞へのR5ウイルスのエントリにバインドします。病気の経過中、X4ウイルスが出現するとR5ウイルスを脱却することができる。 EMAとFDAが要求するようなコレセプター使用の決定は、（また、向性と呼ばれる）、従って前MVCの管理に必須です。 MVCの効率MOTIVATE、MERITと1029のための研究は、これはsophiに基づいた高品質なアッセイであるモノグラム、サンフランシスコ、アメリカからTrofileアッセイを用いて行われてきたsticated換えテスト。ヨーロッパの医師ではなく、またそれに伴う抵抗試験を提供する分散型の専門家の研究室で作業する傾向があるので、日常生活のためにこのテストの受け入れは、米国の外でかなり低いです。これらの研究所は、2011年1に提示されている最後のものをいくつかの品質保証評価を受けています。 ここ数年、我々はHIVのenv-V3の遺伝子領域（V3）2からの配列解析に基づく指向性の測定を行った。この領域は、信頼性の高い予測を実行するための十分な情報を運ぶ。短い回転時間（耐性試験に相当）を、低コスト、患者のニーズに結果を適応させる可能性と非常に低いか、またはあっても検出できないウイルス負荷（VLと臨床検体を分析の可能性：コレセプター使用の遺伝子型の決定は、次のような利点を提示）、特に以来、VLと分析されたサンプルの数&lt;1000コピー/μL大体（図3）の最後の年で増加した。 向性テストするための主な手順は（図4）このビデオで実証： 1。血液サンプルの収集 2。血単核細胞から血漿および/またはHIVプロウイルスDNAからHIVのRNAの単離 3。 envの領域の増幅 4。 V3領域の増幅 5。 V3のアンプリコンの配列反応 6。シークエンシングサンプルの精製 7。精製サンプルのシーケンシング 8。シーケンス編集 9。データの解釈や向性予測をシーケン

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Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

HIV-1のコレセプター使用率の予測は、抗レトロウイルス薬、すなわち共受容体拮抗薬の新しいクラスの管理のために必要とされる。それは、一連の分析によって行うことができます<em&gt; ENV</emインターネットベースの解釈システムを介し&gt;遺伝子とそれに続く解釈（geno2pheno<sub&gt; [コレセプター]</sub&gt;）。

遺伝子型アプローチを用いた配列解析によるHIV-1コレセプター使用（指向性）の予測

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

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Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' surface envelope glycoprotein. We previously proposed that the crown of the V3 loop, although dynamic and sequence variable, is constrained throughout the population of HIV-1 viruses to an immunologically relevant &beta;-hairpin tertiary structure. Importantly, there are thousands of different V3 loop crown sequences in circulating HIV-1 viruses, making 3D structural characterization of trends across the diversity of viruses difficult or impossible by crystallography or NMR. Our previous successful studies with folding of the V3 crown1, 2 used the ab initio algorithm 3 accessible in the ICM-Pro molecular modeling software package (Molsoft LLC, La Jolla, CA) and suggested that the crown of the V3 loop, specifically from positions 10 to 22, benefits sufficiently from the flexibility and length of its flanking stems to behave to a large degree as if it were an unconstrained peptide freely folding in solution. As such, rapid ab initio folding of just this portion of the V3 loop of any individual strain of the 60,000+ circulating HIV-1 strains can be informative. Here, we folded the V3 loop of the R2 strain to gain insight into the structural basis of its unique properties. R2 bears a rare V3 loop sequence thought to be responsible for the exquisite sensitivity of this strain to neutralization by patient sera and monoclonal antibodies4, 5. The strain mediates CD4-independent infection and appears to elicit broadly neutralizing antibodies. We demonstrate how evaluation of the results of the folding can be informative for associating observed structures in the folding with the immunological activities observed for R2.

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The crown region of different V3 loop sequences of the surface envelope glycoprotein (gp120) of HIV-1 can be structurally characterized in many cases by in silico folding of positions 10 to 22 of the loop using a state-of-the-art ab initio folding algorithm. Here we demonstrate the folding and evaluation of this region of the V3 loop from the R2 strain of HIV-1, a uniquely neutralization sensitive strain with puzzling functional properties.

によるHIV - 1 V3ループクラウンR2シーケンスの免疫学的に関連する動的第三紀の構造的特徴の評価第一原理折りたたみ

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' ...

免疫・感染学

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, the LTR is also responsive to cellular activation states and to the local chromatin activity where the integration has occurred. This can result in high HIV-independent activity, and has restricted the usefulness of LTR-based reporter to mark HIV positive cells 1,2,3. Here, we constructed an expression lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, numerous HIV DNA sequences that include the Rev-response element and HIV splicing sites 4,5,6. The vector was incorporated into a lentiviral reporter virus, permitting highly specific detection of replicating HIV in living cell populations. The activity of the vector was measured by expression of the green fluorescence protein (GFP). The application of this vector as reported here offers a novel alternative approach to existing methods, such as in situ PCR or HIV antigen staining, to identify HIV-positive cells. The vector can also express therapeutic genes for basic or clinical experimentation to target HIV-positive cells.

We have developed a lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, the Rev-response element (RRE) that can regulate reporter gene expression in an HIV-1 Tat- and Rev-dependent fashion. The vector permits the specific detection of replicating HIV in living cells via the expression of GFP.

緑色蛍光タンパク質を発現するリビジョンに依存するレンチウイルスベクターを用いたHIV - 1陽性細胞の特定のマーキング

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein complexes and assemblies. In fact, single particle electron microscopy1 and two-dimensional (2D) electron crystallography2 have become relatively routine methodologies and a large number of structures have been solved using these methods. At the same time, image processing and three-dimensional (3D) reconstruction of helical objects has rapidly developed, especially, the iterative helical real-space reconstruction (IHRSR) method3, which uses single particle analysis tools in conjunction with helical symmetry. Many biological entities function in filamentous or helical forms, including actin filaments4, microtubules5, amyloid fibers6, tobacco mosaic viruses7, and bacteria flagella8, and, because a 3D density map of a helical entity can be attained from a single projection image, compared to the many images required for 3D reconstruction of a non-helical object, with the IHRSR method, structural analysis of such flexible and disordered helical assemblies is now attainable.
In this video article, we provide detailed protocols for obtaining a 3D density map of a helical protein assembly (HIV-1 capsid9 is our example), including protocols for cryo-EM specimen preparation, low dose data collection by cryo-EM, indexing of helical diffraction patterns, and image processing and 3D reconstruction using IHRSR. Compared to other techniques, cryo-EM offers optimal specimen preservation under near native conditions. Samples are embedded in a thin layer of vitreous ice, by rapid freezing, and imaged in electron microscopes at liquid nitrogen temperature, under low dose conditions to minimize the radiation damage. Sample images are obtained under near native conditions at the expense of low signal and low contrast in the recorded micrographs. Fortunately, the process of helical reconstruction has largely been automated, with the exception of indexing the helical diffraction pattern. Here, we describe an approach to index helical structure and determine helical symmetries (helical parameters) from digitized micrographs, an essential step for 3D helical reconstruction. Briefly, we obtain an initial 3D density map by applying the IHRSR method. This initial map is then iteratively refined by introducing constraints for the alignment parameters of each segment, thus controlling their degrees of freedom. Further improvement is achieved by correcting for the contrast transfer function (CTF) of the electron microscope (amplitude and phase correction) and by optimizing the helical symmetry of the assembly.

This article describes a method to obtain a three-dimensional (3D) structure of helically assembled molecules using cryo-electron microscopy. In this protocol, we use HIV-1 capsid assemblies to illustrate the detailed 3D reconstruction procedure for achieving a density map by the iterative helical real-space reconstruction method.

クライオ電子顕微鏡によるHIV - 1キャプシドアセンブリの構造とヘリカル実空間の反復再構成

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

HIV - 1コアのin vitroでの脱殻で

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

HIV-1感染CD4の生得センシングを評価<sup&gt; +</sup&gt;使用して形質細胞様樹状細胞によるT細胞<em&gt;エクスビボ</em&gt;共培養系。

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

細胞ベースのELISAアッセイを使用して、HIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造評価

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1陽性個体の血漿からエキソソームの単離

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

の測定<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1プレインテグレーション複合体の統合活動

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Here, we describe a quantitative proteomics method using the technique of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to analyze the effects of HIV-1 infection on host exosomal proteomes. This protocol can be easily adapted to cells under different stress or infection conditions.